Nieuwe anti-HIV lectine familie, die een strenge bindende specificiteit voor hoge mannose glycanen toont werd gevonden in lagere organismen. De bacteriële ortholoog geïdentificeerd in het genoom van Pseudomonas fluorescens Visum:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) High-Mannose Binding Antiviral lectine PFL van Pseudomonas fluorescens Redacteur: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brazilië Ontvangen: 7 mei 2012; Aanvaard: 27 augustus 2012; Gepubliceerd: 20 september 2012 Copyright: © Sato et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. Dit onderzoek werd mede ondersteund door een Grant-in-Aid for Young Scientists (B) van de Japan Society voor de Bevordering van de Wetenschap (JSPS) (Grant nummer 24790101). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie High mannose-bindende lectinen die specifiek glycanen richten op een virus oppervlak veelbelovend potentieel virale inactiverende middelen die kunnen worden gebruikt voor de preventie en bestrijding van virusinfecties [1], [2]. Talrijke lectinen die specifiek herkennen hoge mannose glycanen gevonden van verschillende taxonomie waaronder bacteriën, algen, planten en dieren, en sommige waarvan is aangetoond dat anti-HIV activiteit vertonen [3]. We hebben onlangs vonden een nieuwe anti-HIV lectine familie verdeeld in lagere organismen zoals bacteriën, cyanobacteriën en mariene algen [4]. Ze vertonen gemeenschappelijke kenmerken, zoals de opeenvolging vermenigvuldiging van sterk geconserveerde N-terminale domein en exclusieve high mannose oligosaccharide erkenningen. Sommige lectinen in deze familie zoals cyanobacteriën OAA van Oscillatoria agardhii Naast de krachtige antivirale activiteit ESA-2 toont verschillende biologische activiteiten zoals mitogene activiteit van muis en humane lymfocyten en In de huidige studie, hebben we de ortholoog lectine gen uit P gekloond. fluorescens Materials Stab cultuur van P. fluorescens haemagglutinine werd uitgevoerd onder toepassing van een 2% (v /v) suspensie van met trypsine behandelde konijnenerythrocyten zoals eerder beschreven [9]. In het kort werd konijn natieve erythrocytensuspensie behandeld met 0,5% trypsine in zoutoplossing en het mengsel geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Na wassen met zoutoplossing, werd 2%-trypsine behandelde erythrocyten suspensie bereid in zoutoplossing. Hemagglutinatie activiteit werd uitgedrukt als een titer, het omgekeerde van de hoogste 2-voudige verdunning vertonen positieve hemagglutinatie. Genomisch DNA van P. fluorescens De verzamelde bacteriële cellen werden geresuspendeerd in 20 mM fosfaatbuffer ( pH 7,0) bevattende 0,15 M NaCl (PBS) en werden verbroken door sonicatie. Na centrifugeren bij 8000 rpm gedurende 20 min werd een monster van de supernatant onderworpen aan 12 kolom (GE Healthcare) geëquilibreerd met PBS Superose. De kolom werd geëlueerd met PBS bij een stroomsnelheid van 0,8 ml /min door een isocratische modus. Het eluaat werd gevolgd door absorptie bij 280 nm en onderzocht op hemagglutinatie activiteit en de actieve fracties werden samengevoegd. Het molecuulgewicht van PFL werd bepaald met MALDI-TOF MS analyse van een Autoflex massaspectrometer (Bruker, Japan) na de kalibratie met een peptide mass standaard kit (Bruker, Japan) met behulp van sinapinisch zuur als een matrix. DNA-sequentie-analyse Nucleotidesequenties werden bepaald door de dideoxy terminator werkwijze keten met een BigDye Terminator Cycle Sequencing versie 3,1 kit (Applied Biosystems). DNA sequentiebepaling werd uitgevoerd met een ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). PFL werd gelabeld met Alexa Fluor 488 volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen, Eugene, OR). Glycaan bindingsspecificiteit van PFL werd bepaald door de gedrukte glycan microarrays (versie 5.0) volgens de standaardprocedure van CoreH van het Consortium for Functional Glycomics (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). De gemiddelde relatieve fluorescentie in duplo zes werd berekend door het gemiddelde van vier waarden na het verwijderen van de hoogste en laagste waarden van enkele van de foutieve treffers elimineren met zeer hoge of lage punten. De fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM), en% CV is de coëfficiënt van variatie (SD /gemiddelde) berekend als%. In vitro Immunofluorescentiekleuring was uitgevoerd om de invoer remming van influenzavirus door PFL visualiseren. Kort samengevat, MDCK cellen gekweekt op dekglaasjes werden geïnfecteerd met A /Udorn /72 bij een multipliciteit van infectie van ongeveer 0,001 infectieuze deeltjes per cel, in aanwezigheid of afwezigheid van 200 nM PFL in DMEM bevattende 10 ug /ml trypsine. Na 24 uur na infectie werden de geïnfecteerde cellen gefixeerd met 80% aceton gedurende 5 minuten. Na wassen met PBS werden de cellen geïncubeerd met muizen monoklonaal anti-HA antilichaam (Hytest, Turku, Finland) bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na wassen met PBS werden de cellen geïncubeerd met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd geit anti-muis IgG antilichaam (Anticorps secondaires, Compiègne, Frankrijk) bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na verder PBS wassen werden de cellen gemonteerd met Vectashield met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) en onder een fluorescentie-microscoop (OLYMPUS BX51 Olympus, Japan) waargenomen. ELISA Directe wisselwerking van PFL met virale envelop glycoproteïne HA werd getest onder gebruikmaking van een enzymgekoppelde immnosorbent assay (ELISA). PFL (5 ug /ml) in carbonaatbuffer (pH 9,6) werd gecoat op 96 gats ELISA platen (BD Biosciences, Bedford, MA). De putjes werden driemaal gewassen met PBS dat 0,1% Tween 20 (PBST) en geblokkeerd met 3% afgeroomde melk bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na wassen met PBST, variërende concentraties influenza HA vaccinbereiding (Astellas, Tokyo, Japan) werden toegevoegd aan elk putje en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na wassen met PBST werden de putjes geïncubeerd met muizen anti-HA monoklonaal antilichaam (Hytest) bij 37 ° C gedurende 1 uur, gevolgd door incubatie met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd geit anti-muis IgG antilichaam (GE Healthcare, UK ) bij 37 ° C gedurende 1 uur. Vervolgens 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substraat (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI) werd toegevoegd. De reactie werd gestopt met TMB stopreagens (Sigma-Aldrich) en absorptie bij 450 nm werd gemeten met een microplaat reader (1420 multilabel teller, PerkinElmer). celproliferatie werd gekwantificeerd met een gebruikelijke MTS assay gebruikt CellTiter 96 celproliferatie assay (Promega, Madison, WI). Cellen gezaaid op 96-well microplaat werden gedurende 72 uur met verschillende concentraties PFL in geschikt medium met 10% FBS. De cellen werden vervolgens geïncubeerd met 20 pl MTS reagens voor 1 uur bij 37 ° C en gemeten met een microplaat reader (1420 multilabel teller, PerkinElmer) bij 490 nm. Het effect van gist mannan op cytotoxity van PFL werd bepaald door het incuberen van de cellen met 5 uM PFL in aanwezigheid van verschillende concentraties van gist mannan in RPMI 1640 met 10% FBS gedurende 72 uur, en cellevensvatbaarheid werd gemeten zoals hierboven beschreven. Isolatie van PFL bindingsmolecuul (s) op MKN28 cell PFL werd gelabeld met biotine via biotine labeling kit (DOJINDO moleculaire technologieën, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Om MKN28 cellen op dekglaasjes, gebiotinyleerd PFL (200 ug) werd toegevoegd en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur confluent. Na wassen met koude PBS werden de cellen afgeschraapt en gelyseerd in 800 pl RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% natrium deoxycholaat, cocktail van proteaseremmers, 0,1% SDS ). Vervolgens werd 100 ui biotine-avidine kralen capture (Adar Biotech, Israël) aan het cellysaat toegevoegd en overnacht geïncubeerd bij 4 ° C onder zacht schudden. De parels werden driemaal gewassen met 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Gevangen eiwitten op korrels werden geëlueerd met 50 ui SDS-PAGE monsterbuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 1% mercaptoethanol, 0,003% broomfenolblauw) gedurende 15 min bij 90 ° C en onderworpen aan SDS-PAGE. De eiwitband specifiek voor PFL behandeling fractie werd geanalyseerd met MALDI-TOF MS na in-gel digestie met trypsine. In het kort werden de CBB gekleurde eiwitbanden uitgesneden en ontkleurd met 25 mM ammoniumbicarbonaat met 50% acetonitril. De reductieve alkylering werd uitgevoerd met 50 mM TCEP (Tris [2-carboxyethyl] fosfine) in 25 mM ammonium bicarbonaat, gevolgd door incubatie met 50 mM iodoacetoamide gedurende 1 uur. Na dehydratatie met acetonitril, werd het eiwit in de gel gedigereerd met 10 ul van TPCK-trypsine (100 ug /ml) in 50 mM ammoniumbicarbonaat. De vertering werd gezuiverd met Zip tip (Millipore, Japan) en gespot op een MALDI doel. Eén pi matrixoplossing (α-cyano-4-hydroxycinnapic acid matrix [Bruker, Japan] in aceton-ethanol [01:02]) werd vervolgens toegevoegd aan de plek. MALDI-TOF-MS-analyse werd uitgevoerd door een Autoflex massaspectrometer (Bruker, Japan) na de kalibratie met een peptide mass standaard kit (Bruker, Japan) uitgevoerd. De peptide mass vinger afdrukken van gegevens werd doorzocht door de Mascot software (Matrix Science, Japan). MKN28 cellen werden gekweekt op dekglaasjes in een 6-wells plaat . De cellen groeien op dekglaasjes werden behandeld met 30 ug /ml Alexa488-geconjugeerd PFL in RPMI 1640 en gedurende verschillende perioden. Na wassen met PBS werden de cellen gefixeerd met 80% aceton gedurende 5 minuten. Na wassen met PBS werden de cellen geïncubeerd met muizen monoklonaal anti-integrine α2 /CD49b antilichaam (R &D Systems, MN) bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na wassen met PBS werden de cellen geïncubeerd met Alexa568-geconjugeerd geit anti-muis IgG antilichaam (Life technologies, Japan) bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na verder wassen PBS, werden de cellen gemonteerd met Vectashield met DAPI (Vector Laboratories) en onder confocale laser scanning microscoop waargenomen (IX70, Olympus, Japan). Door toepassing van de andere maagkanker cellijn GCIY en normale menselijke hepatocyten cellen ACBRI 3716, werden de cellulaire lokalisatie van integrine α2 en Alexa488-PFL dezelfde wijze onderzocht als boven beschreven, en bekeken onder een fluorescentiemicroscoop (Olympus BX51). Het effect van gist mannan op de cellulaire lokalisatie van PFL en integrine α2 werd als volgt beoordeeld. Confluente MKN28 cellen gekweekt op dekglaasjes in een 6-well plaat werden behandeld met 20 ug /ml Alexa488-PFL in RPMI 1640 in aanwezigheid of afwezigheid van 700 ug /ml gist mannan gedurende 4 uur. De cellen werden gefixeerd, zichtbaar gemaakt met behulp van anti-integrine α2 /CD49b antilichaam zoals hierboven beschreven, en bekeken onder een fluorescentiemicroscoop (Olympus BX51). Effect van verschillende lectinen op de cellulaire lokalisatie van integrine α2 werd onderzocht op dezelfde wijze door het incuberen van de MKN28 cellen met 20 ug /ml van elk lectine in RPMI 1640 voor 4 uur. moleculair kloneren, expressie en zuivering van PFL We hebben eerder vonden het genoom van P. fluorescens De afgeleide aminozuursequentie PFL herbergde twee homologe domeinen die elk bestaan uit de N- en C-terminale helften met 62% sequentie-identiteit tussen hen. PFL tentoongesteld hoge sequentiehomologie met cyanobacteriën lectine OAA van Oscillatoria agardhii Om koolhydraat-bindende specificiteit van PFL te bepalen, werd glycan array analyse uitgevoerd op het Consortium voor Functional Glycomics met behulp van gedrukte serie versie 5.0. Van de 611 geteste soorten oligosacchariden, PFL (10 ug /ml) vertoonden exclusieve specificiteit voor hoge mannose glycanen soort zoals getoond in Fig. 3. De volledige lijst van de oligosaccharide getest en de resultaten kan online worden gevonden op (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp). PFL sterk gebonden aan M6 glycan (216 ) en M8 glycan (212), die beide een blootgestelde α1-3 Mens op de D2 arm, met hetzelfde niveau van hoge RFU waarden, 43.471 en 40.759 respectievelijk. In contrast, maskeren van deze α1-3 Man met α1-2 Man drastisch verminderde de interactie tussen PFL en de glycanen. Dit was het meest duidelijk uit vergelijking van M6 glycan (216) en M7 glycan (211), wanneer de extra α1-2 Man bij D2 arm verminderde de binding potentie tot ongeveer 53%. Evenzo bindingsvermogen van PFL tot M9 glycan (213) werd verminderd (RFU = 8535) vergeleken met zijn tegenhanger M8 glycan (212) ontbreekt D2 terminal α1-2 mens, waarbij slechts 21% van de potentie. Interessant is dat het verwijderen van de reducerende terminale disaccharide, GlcNAc-GlcNAc van hoge mannose glycanen veel drastisch verminderd PFL-bindend. Zo werd de PFL bindingsvermogen vrijwel volledig ingetrokken op glycanen 316 en 317 zonder GlcNAc-GlcNAc-sequentie dat de tegenhanger glycanen 212 en 213, respectievelijk, vertoonde veel hogere potentie. Het belang van eindstandige GlcNAc-GlcNAc werd verder bevestigd door de vergelijking van glycanen 217 en 315, ofschoon de mate van aantasting van PFL-binding was beperkt. Dit lectine miste monosaccharide-bindende waaronder mannose. Bovendien PFL geen interactie met α1-6 Man Man (314) en mannotriose (214), die deel uitmaken van het vertakte gedeelte van hoge mannose glycanen. Pentasaccharide kern van N-glycan (50) werd niet herkend door PFL maar zijn gefucosyleerde tegenhanger (485) weergegeven zwakke interactie (RFU = 746). Deze oligosaccharide binding profielen van PFL waren nauw vergelijkbaar met die van OAA, ESA-2 en KAA-2 die behoren tot een nieuwe anti-HIV lectine familie in lagere organismen [4] - [6]. Anti-influenzavirus activiteit van PFL werd geëvalueerd met twee influenza-virusstammen A /Udorn /72 (H3N2) en de A /Beijing /262/95 (H1N1) door de NR kleurstofopname assay. PFL effectief geremd cytopathisch effect wordt veroorzaakt door zowel influenza virusstammen, met EC 50s van 19,4 ± 1,5 nM en 4,5 ± 0,4 nM, respectievelijk (Fig. 4A). Om te bevestigen dat PFL remde de initiële stap van het influenzavirus binnenkomst in de cellen, verdeling van virale antigenen in de geïnfecteerde cellen werd waargenomen in de aanwezigheid of afwezigheid van PFL middels immunofluorescentie microscopie. Fig. 4B toont de verdeling van het virale antigeen na 24 uur na infectie met A /Udorn /72 gedetecteerd door specifieke anti-hemagglutinine-antilichaam. PFL efficiënt remde influenzavirus binnenkomst in de cellen terwijl de virussen konden binnendringen en repliceren in de gastheercellen in afwezigheid van PFL. Een galactose specifieke lectine PNA van Arachis hypogaea In vitro om het moleculaire mechanisme waarmee PFL induceert celdood van MKN28 cel pakken, celoppervlak molecule (s) waaraan PFL gebonden werden onderzocht. Gebiotinyleerd PFL werd gedurende 2 uur onder MKN28 cellen en de cellen werden gelyseerd met RIPA-buffer bevattende 0,1% SDS. Het celoppervlak molecuul (en) waaraan biotine-PFL gebonden werden gecoprecipiteerd met avidine bedekte korrels. De eiwitten gevangen op korrels werden vervolgens geëlueerd met SDS-PAGE monsterbuffer en geanalyseerd op SDS-PAGE (Fig. 6A). Hoewel een aantal niet-specifieke banden werden gedetecteerd, zagen we een 150 kDa band die specifiek in PFL gedetecteerd behandeld fractie. Deze band werd verder onderworpen aan in-gel digestie van trypsine gevolgd door MALDI-TOF massaspectrometrische analyse. De verkregen peptide mass fingerprinting gegevens (afb. 6B) werden gezocht voor de database en het eiwit werd als integrine geïdentificeerd α2, met de kans op basis van scores van 57 (p < 0,05). Het gedrag van PFL zelf en integrine α2 bij behandeling met PFL werden onderzocht met een confocale fluorescentiemicroscoop. In dit experiment fluorescent gelabelde PFL (Alexa488-PFL) werd gebruikt om PFL lokalisatie volgen. Een Alexa488-PFL werd geïncubeerd met MKN28 cellen gedurende 1, 5 en 24 uur bij doses van 30 ug /ml. Integrine α2 werden gedetecteerd met anti-integrine α2 /CD49b monoklonaal antilichaam gevolgd door Alexa568-geconjugeerd 2de antilichaam. Interessant Alexa488-PFL gebonden aan het celoppervlak en internalisatie geïnitieerd cytoplasma binnen 1 uur (fig. 7). Integrine α2 die voornamelijk werd gelokaliseerd op het celoppervlak bij steady state onderging ook internalisatie, en belangrijker nog, de lokalisatie van integrine α2 viel samen goed met PFL. Na 5 uur incubatie zowel PFL en integrine α2 werden samen gelokaliseerd en verzameld in perinucleaire regio en verdere incubatie eigenlijk niet de locatie van beide eiwitten niet wijzigen. Het is daarom waarschijnlijk dat zodra PFL gebonden α2 integrine, beide eiwitten nooit terug naar het celoppervlak gerecycled. Snelle intracellulair verkeer van PFL-integrine α2 complex opgetreden zelfs op collageen I beklede dekglaasjes (gegevens niet getoond). Evenzo herverdeling van integrine α2 na behandeling met PFL werd waargenomen bij een andere maagkanker cellijn GCIY, maar niet in normale humane cellen hepatocyten, ACBRI 3716 (fig. 8). In ACBRI 3716 cellen, internalisering van PFL werd onmogelijk waargenomen door de lagere expressie van integrine α2 op celoppervlak. Om te testen of cellulaire herverdeling van integrine α2 door PFL kunnen voortkomen uit een specifieke interactie van PFL met hoog mannose glycanen integrine α2 molecule, hebben we het effect van gist mannan op PFL-geïnduceerde integrine α2 internalisatie behulp MKN28 cellen geëvalueerd. Aangezien gist mannan, beide eiwitten ondergingen significant internalisatie (fig. 9A, bovenste panelen). Daarentegen in de aanwezigheid van gist mannan, PFL niet binden aan celoppervlak, en de daaropvolgende intracellulair transport van PFL werd volledig opgeheven (fig. 9A, rechtsonder). Waarbij met deze waarneming integrine α2 heeft de lokalisatie niet veranderen in de aanwezigheid van gist mannan (fig. 9A, linksonder). Deze resultaten geven duidelijk aan dat PFL gebonden aan integrine α2 door de erkenning van de hoge mannose glycanen op integrine α2. Om dat hoge mannose glycanen voor integrine α2 herverdeling verder te bevestigen, hebben we het effect van verschillende lectinen op de cellulaire lokalisatie van integrine α2 getest. Zoals getoond in Fig. 9B, andere lectinen met verschillende specificiteiten, zoals galactose-bindend PNA van Arachis hypogaea In deze studie hebben we de biologische activiteit van de nieuwe bacteriële lectine geëvalueerd PFL van P. fluorescens Om antitumoreffect van PFL onderzoeken, gebruikten we menselijke maagkanker cellijn die MKN28 is ontstaan uit een matig gedifferentieerde intestinale soort tumor. De rode algen lectine ESA-2, die behoort tot dezelfde lectine familie met PFL vertoonde anti-tumor effect zowel In vitro Kopen en In vivo
Pf0-1 en het gen codeert een vermeend lectine werd gekloneerd, tot expressie gebracht in Escherichia coli Kopen en gezuiverd door gelfiltratie één stap. Glycan matrix screening van recombinant lectine, PFL aangeduid, is gebleken dat PFL herkent bij voorkeur hoog mannose glycanen met α1-3 mens die sterk is blootgesteld aan de D2 positie. In tegenstelling, het maskeren van deze α1-3 Man met α1-2 Man enorme schade lectine-koolhydraat interacties. Reducerende terminale disaccharide, GlcNAc-GlcNAc van hoge mannose glycanen was ook essentieel voor de PFL-bindend. PFL vertoonde een krachtige anti-influenzavirus activiteit door remming van de virale infectie in cellen in doses van lage nanomolaire concentraties. Bij micromolaire concentratie of hoger, PFL toonde een cytotoxiciteit bij verlies van de celadhesie tegen menselijke maagkanker MKN28 cellen. Het celoppervlak molecule waaraan PFL gebonden werd gecoprecipiteerd met biotine gelabelde PFL en geïdentificeerd als integrine α2 van peptide mass fingerprinting middels MALDI-TOF massaspectrometrie. Intrigerend na behandeling met exogeen PFL, α2 integrine op het celoppervlak onderging een snelle internalisering naar het cytoplasma en verzameld om perinucleaire regio, samen met de gebonden PFL. De resulterende verlies van cel therapietrouw zou een signaalroute die geïnduceerd anoikis-achtige celdood veroorzaken. Deze gebeurtenissen waren effectief geremd door voorbehandeling van PFL met mannnan, met vermelding van de betrokkenheid van hoge mannose glycanen op PFL-geïnduceerde celdood, dat werd veroorzaakt door PFL-integrine α2 interacties
Pf0-1 Bevordert celdood van Cell maagkanker MKN28 via Interactie met α2 integrine. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10.1371 /journal.pone.0045922
[4] en rode algen ESA-2 vanaf Eucheuma Serra
[5] hebben aangetoond dat het HIV binnenkomst in de gastheercellen te remmen met EC 50s of lage nanomolaire bereik door direct te binden aan gp120 envelop. Bovendien is een rode algen lectine KAA-2 vanaf Kappaphycus alvarezii
, die ook behoort tot deze familie remt infectie van verschillende influenza virusstammen met EC 50s of lage nanomolaire niveaus in een stam-onafhankelijke wijze, door middel van de opname van hoge mannose oligosaccharide op de virale envelop glycoproteïne hemagglutinine (HA) [6].
in vitro groeiremming van tumorcellen [7], [8]. Hoewel de biologische eigenschappen van deze lectine familie worden steeds duidelijker, de eigenschappen van bacteriële orthologen uit Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 en Herpetosiphon aurantiacus
nog steeds worden verduidelijkt.
Pf0-1 en de gecodeerde eiwit lectine (PFL) werd uitgedrukt in Escherichia coli
. Functionele PFL werd succesvol gezuiverd hoge opbrengst en gekenmerkt wat betreft de biologische activiteiten zoals antivirale en antitumoractiviteit. Zoals voorspeld uit intense structurele gelijkenis van PFL met andere leden van deze lectinefamilie, PFL vertoonde exclusieve specificiteit voor hoge mannose oligosaccharide en krachtige antivirale activiteit tegen influenzavirussen. Bovendien PFL geïnduceerde anoikis-achtige celdood van maagkanker cel MKN28 via interactie met celoppervlak integrine α2.
Materialen en methoden
Pf0-1 werd genereus verschaft door Dr. Mark W. Silby (Universiteit van Massachusetts Dartmouth, USA). Influenzavirussen en Madin-Darby hondennier (MDCK) cellen werden genereus verschaft door Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japan): De influenzavirussen werden de chorioallantoïsche vloeistof van 10 dagen oude kippeneieren gekweekt. MDCK-cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline-streptomycine. Een maagkanker cellijn, MKN28 werd ter beschikking gesteld door Prof. Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japan). De cellijn werd in RPMI 1640-medium gehouden (GIBCO, Grand Island, NY) gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum (FBS, GIBCO), 100 IU /ml penicilline G en 100 mg /ml streptomycine sulfaat. Andere maagkanker cellijn GCIY, werd gekocht bij RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japan) en gehandhaafd op dezelfde wijze als hierboven beschreven. Primaire normale menselijke hepatocyten cel (ACBRI 3716) werd gekocht van DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) en onderhouden in CS-C medium kit R (DS Pharma Biomedical).
hemagglutinatietest
Gene klonering en expressie van lectine PFL
Pf0-1 werd gebruikt als een matrijs voor genklonering van PFL gen. Eerst een oligonucleotide primerpaar 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'en 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', gehybridiseerd met die stroomopwaarts en stroomafwaarts van de PFL coderende gebied, respectievelijk, werden toegepast, en de PCR werd uitgevoerd met Prime STAR DNA polymerase (TAKARA). Met de PCR geamplificeerde fragment als een matrijs, werd de volgende PCR uitgevoerd met een voorwaartse primer, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', die CACC extra sequentie moest ATG startcodon van de PFL gen en een reverse primer, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA, overeenkomende met codon van het gen RFL stoppen). De geamplificeerde fragmenten werden geligeerd in pET101 /D-TOPO expressievector. Het recombinante plasmide werd getransformeerd in Escherichia coli
TOP10-cellen (Invitrogen). De verkregen recombinante klonen werden bevestigd op een correcte construct door DNA sequentiebepaling zijn. De functionele klonen werden omgezet in Escherichia coli
BL21 Star (DE3) cellen voor induceerbare expressie van de PFL-gen. IPTG met een eindconcentratie van 0,8 mM toegevoegd aan de getransformeerde kweek de PFL expressie te induceren. Na 6 uur incubatie bij 37 ° C werden de cellen geoogst door centrifugatie bij 8000 rpm gedurende 20 min.
Zuivering lectine PFL
molecuulgewicht Bepaling van PFL
Glycaan array analyse
Anti-influenza-activiteit van PFL
anti-influenza-activiteit van PFL werd bepaald door de neutrale rode (NR) kleurstofopname assay. Verschillende concentraties van PFL werden bereid met DMEM bevattende 10 ug /ml trypsine in een 96-well microplaat. Aan elk putje werd virus toegevoegd als een veelvoud van infectie van ongeveer 0,001 infectieuze deeltjes per cel. Na incubatie bij 37 ° C gedurende 48 uur werd 100 pl NR kleurstof (150 ug /ml in DMEM) toegevoegd en verder geïncubeerd gedurende 2 uur. NR kleurstof opgenomen in de cellen werd geëxtraheerd door toevoeging van 100 pi 1% azijnzuur /50% ethanol. De putjes werden gemeten bij 540 nm met een microplaat reader (1420 multilabel teller, PerkinElmer, MA, USA) als een factor overleven van het virus cytopathische effect.
Immunofluorescentiemicroscopie
Tumor celproliferatie door MTS assay
Cellular lokalisatie van PFL en integrine α2
Resultaten
Pf0-1 een mogelijke homoloog van anti-HIV-lectine gezin dat onlangs werd gevonden in lagere organismen zoals bacteriën, cyanobacteriën en mariene algen [4] bevat. Gebaseerd op de nucleotidesequentie van hypothetische lectine van P. fluorescens
Pf0-1 van de database primersets werden ontworpen om het lectine gen amplificeren. Vermeende lectine gen werd met succes gekloond door directionele TOPO het klonen van het systeem, en de codering eiwit werd heteroloog tot expressie in E. coli
BL21 (DE3). Het tot expressie gebrachte eiwit lectine werd gezuiverd tot homogeniteit door een enkele stap gelfiltratie op Superose 12-kolom (Fig. 1A). De actieve piek met hemagglutinatie-activiteit leverde een enkelvoudige eiwitband van 13 kDa op SDS-PAGE (Fig. 1B). Tot slot, met ingang van 1 nest E. coli
cultuur, hoge opbrengst aan gezuiverde lectine (240 mg) werd verkregen. Het gezuiverde lectine werd genoemd PFL en gebruikt voor verder onderzoek. De molecuulmassa van PFL (13.883,7) bepaald met MALDI-TOF MS werd in overeenstemming met de berekende massa (13.881,1) van de afgeleide aminozuursequentie en de geschatte waarde van de mobiliteit op SDS-PAGE.
, rode algen lectine ESA-2 vanaf Eucheuma Serra
, en bacteriële lectine MBHA van Myxococcus xanthus
(Fig . 2B), die een nieuwe anti-HIV lectinefamilie vormen. De molecuulmassa van PFL en OAA waren vergelijkbaar, 13883,7 en 13924,1, respectievelijk, en beide lectines bestonden uit 132 aminozuren. Zowel de PFL en OAA hebben een gemeenschappelijke eigenschap in zijn sequentie doublures maar OAA toont hogere mate van interne sequentie-identiteit met 75% tussen de twee herhaalde domeinen. Daarentegen ESA-2 en MBHA zijn samengesteld uit vier tandem herhaalde homologe domein van 67 aminozuren. De mate van overeenstemming van OAA ESA-2 en MBHA met PFL in hun N-terminale gedeeltes (elk 132 residuen) van de aminozuursequenties waren 62,1, 61,4 en 62,1% identieke aminozuren, respectievelijk.
Carbohydrate-bindende specificiteit van PFL
Anti- influenza virus activiteit van PFL
niet virus binnenkomst in de cellen te remmen. Deze resultaten suggereren dat de aanwezigheid van hoge mannose glycanen van het virus oppervlak ter plaatse van cruciaal belang voor virus entry in cellen. Nagaan PFL rechtstreeks zou binden aan virale envelop glycoproteïne HA, werd een ELISA-test uitgevoerd met in de handel verkrijgbaar vaccinpreparaat die HA bevatten A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), en B /Brisbane /60/08 als een belangrijke component. Zoals aangetoond in Fig. 4C, dosisafhankelijke binding van HA aan PFL werd waargenomen.
PFL geïnduceerde celdood van menselijke maagkanker cel MKN28
antitumoreffect van PFL op maagkanker cel MKN28 werd geëvalueerd door conventionele MTS assay. Zoals getoond in Fig. 5A (linker paneel), PFL vertoonde een dosis-afhankelijk effect op de proliferatie van cellen MKN28. Op 72 uren volgend PFL-behandeling werd cellevensvatbaarheid significant verminderd bij doses van 0,5 pM of hoger. In tegenstelling, de lage doses van 0,1-0,3 uM, celproliferatie werd enigszins gestimuleerd. De PFL-geïnduceerde celdood van MKN28 cellen ging gepaard met een verlies aan celhechting aan de bodem van kweekplaat, zoals getoond in Fig. 5B wanneer eversie cluster van cellen waargenomen als bruinachtige lijnen. De PFL-geïnduceerde celdood remt effectief in de aanwezigheid van gist mannan, een glycoproteïne dragen hoog mannose oligosacchariden (fig. 5A, rechter paneel). Dit geeft de hoge mannose glycanen op MKN28 cellen te betrekken bij PFL-geïnduceerde cell signaling die uiteindelijk leidt tot celdood. Daarentegen normale menselijke hepatocyten cellen (ACBRI 3716) waren betrekkelijk resistent PFL behandeling tegen MKN28 cellen (Fig. 5A, linkerpaneel).
Isolatie van PFL-bindende molecuul (en) op de menselijke maagkanker cel MKN28
Cellular lokalisatie van exogeen toegevoegde PFL en integrine α2
De betrokkenheid van hoge mannose glycanen op PFL-integrine α2 interactie
, fucose-bindende AOL uit Aspergillus oryzae
, siaalzuurbindende MAM van Maackia amurensis
, D-GlcNAc-bindende UDA van Urtica dioica
beïnvloedde de locatie van integrine α2. Interessant is dat zelfs high mannose bindende lectinen zoals een monocotyle mannose (Man) -bindings lectine, GNA van Galanthus nivalis
leverde geen significante verandering op integrine α2 tonen. In contrast, hoge mannose bindend lectine peulvruchten ConcanavalinA (ConA) vervormd de inrichting van integrine α2 zoals PFL deed.
Discussie
Pf0-1 dat behoort tot de recente gevonden anti-HIV lectine familie in lagere organismen. Het optreden van het verhogen van resistente influenza virusstammen evenals opkomende hoogpathogene virus stammen zoals vogelgriep H5N1 leidde ons naar PFL te verkennen als een nieuwe anti-influenza-agent. PFL vertoonde krachtige anti-influenzavirus activiteit en het mechanisme waarmee PFL remde virusreplicatie werd remming van de initiële stap van het virus binnenkomst in cellen. Het is zeer waarschijnlijk dat PFL uitgeoefend anti-influenza-activiteit door het selectief binden aan hoge mannose glycanen in de virale envelop HA, zoals aangetoond in ELISA [9] assay. In feite is plaatsspecifieke aanwezigheid van hoge mannose oligosaccharide getoond bij het gebied van HA bij de receptor bindingsplaats [10].
[7], [8]. ESA-2 is een eiwit afkomstig van de eetbare zeewier en wordt naar antitumoreffect op maagdarmkanaal kanker uitoefent door orale toediening. Opvallend is dat PFL bevorderd celdood van MKN28 cel, uitsluitend via een erkenning van hoge mannose glycanen op integrine α2 molecule, die voornamelijk gelegen aan celoppervlak bij steady state. Heterodimere integrinen niet alleen werken als verankering molecuul aan cellen hechten aan een geschikte extracellulaire matrix (ECM), maar ook als sensoren van de ECM milieu [11].
Darmimmuuncellen kunnen verantwoordelijk zijn voor veranderingen in het metabolisme, vindt onderzoek
De eerste bevindingen van het Human Microbiome Project leidden tot 'honderden vervolgonderzoeken'
Wetenschappers veranderen bloed van type A in universeel type O,
Mediterraan dieet bevordert gezond ouder worden met gezonder darmmicrobioom
Onderzoekers gebruiken faagtherapie om alcoholische leverziekte met succes te behandelen
Microben kunnen fatale gevolgen voorspellen bij geventileerde COVID-19-patiënten
Anti-coronavirusmoleculen van microben kunnen de sleutel zijn tot nieuwe behandelingen
Microben in de darm die nuttige verbindingen produceren, kunnen de sleutel zijn tot de behandeling van symptomen van coronavirus. Darm microbioom. Image Credit:Anatomy Image/Shutterstock.
Microben kunnen fatale gevolgen voorspellen bij geventileerde COVID-19-patiënten
De aanwezigheid van Mycoplasma speeksel in de lagere luchtwegen van beademde patiënten met een COVID-19-infectie wordt geassocieerd met een verhoogde kans op overlijden. Het resultaat was een onderd
Zure pH verhoogt SARS-CoV-2-infectie door ACE2-receptor op te reguleren
De aanhoudende pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) die wordt veroorzaakt door een nieuw coronavirus, namelijk, ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), heeft wereld