PLoS ONE: kliinis merkitys ja ennusteen arvioinnissa laktaattidehydrogenaasin ilmentäminen mahasyöpäpotilaista

tiivistelmä

Johdanto

LDH-A, vastaava entsyymi muuttamassa pyruvaatti osaksi laktaattia, on osoitettu olevan säädelty monissa syöpätyyppien ja aiheuttaa aggressiivisempia käyttäytymistä säätelemällä lisääntymistä ja anti-apoptoosin. Kuitenkin sen ilmentyminen mahasyövän (GC) ei ole selvitetty perusteellisesti. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selkeyttää ilmaisun ja mahdollisia vaikutuksia LDH-A GC.

Methods

Tutkimme LDH-A ilme immunohistokemiallisesti GC kudosten microarray (TMA) ja käyttämällä Western blot tuoreen GC kudoksissa ja solulinjoissa. Ennusteen arvioinnissa ja korrelaatio muiden ennusteeseen viittaavia tekijöitä arvioitiin. Transfektoimme siRNA osaksi GC soluihin vastaan ​​LDH-A. LDH-A analysoitiin Western-blottauksella ja reaaliaikainen RT-PCR: llä. Solujen kasvua arvioitiin in vitro ja in vivo. Laktaatin ja ATP tuotannon solut määritettiin.

Tulokset

Ei ollut merkittävästi korkeampi LDH-A ilmentyminen carcinoma kuin ei-neoplastisia limakalvon (NNM). Oli positiivinen korrelaatio LDH-A ilmaisu iän, histologinen tyyppi ja imusolmukemetastaaseja. Survival analyysi osoitti, että korkea ilmentyminen LDH-A GC oli heikompi yleinen (OS). Kun ositettu Lauren laatu ja histologinen luokitus, merkitys ilmestyi hajanainen tyyppi ja erilaistumaton tyyppi GC. Vuonna Monimuuttuja-analyysissä, LDH-A ilmentymistä GC oli itsenäinen ennustetekijöitä riskitekijä OS (riskisuhde = 1,829, 95% CI 1,375-2,433, P < 0,0001). Erityiset siRNA vastaan ​​LDH-A GC solulinjassa hidastumista solujen kasvua sekä in vitro ja hiiren malleissa. LDH-A Knockdown vähensi myös laktaatin ja ATP tuotantoa GC soluissa.

Johtopäätökset

Tutkimuksemme osoitti kasvaimia synnyttävän roolia LDH-A GC. LDH-A ilme on itsenäinen ennustetekijöitä riskitekijä GC potilaiden ja sääteli ilmentyminen LDH-A voi ennustaa huono tulosten hajanainen tyyppi ja erilaistumaton tyyppi GC. Meidän tulokset viittasivat siihen, että LDH-A voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde mahasyövän.

Citation: Sun X, Sun Z, Zhu Z, Guan H, Zhang J, Zhang Y, et ai. (2014) kliinis merkitys ja ennusteen arvioinnissa laktaattidehydrogenaasin ilmentäminen mahasyöpäpotilaista. PLoS ONE 9 (3): e91068. doi: 10,1371 /journal.pone.0091068

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 12 elokuu 2013; Hyväksytty: 07 helmikuu 2014; Julkaistu: 07 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Sun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta tutkimushankkeiden Liaoningin maakunnassa Science and Technology osasto (nro 2007225017, nro 2009225011-2 ja nro 2011415052) ja tieteen ja teknologian hankkeita Shenyang (nro F11-264-1-19). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

metaboliset ominaisuudet syöpäsolujen välillä on eroja normaalien solujen, kuten syöpäsolujen edullisesti käyttää glykolyysin sijaan mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation jopa hapen läsnäollessa; tämä ilmiö tunnetaan Warburg vaikutus [1], [2], [3]. Yllättävän korkea aloittamisesta glukoosin ja laktaatin tuotannon kasvaimia hapen läsnäollessa johti Warburg spekuloida, että poikkeava aineenvaihdunta saattaa olla syynä moniin syöpiin [2]. Kuitenkin, se etu, että metabolisen transformaation antaa syöpäsoluja jää epäselväksi, [4], [5]. Äskettäin löytö välisen yhteyden onkogeenien ja metabolisia prosesseja on johtanut elpyminen kiinnostusta Warburg työtä. On yhä enemmän näyttöä siitä, että sovitus aerobinen Glykolyysivaiheen syöpäsolujen voisi helpottaa syövän leviämisen [5]. Syöpä aineenvaihdunta on ollut laaja etsintä toivossa löytää uusia tehokkaita hoitomuotoja syöpään.

LDH-A, on ratkaiseva entsyymi, joka on tärkeä rooli lopullisessa vaiheessa Warburg vaikutus muuntamalla pyruvaatin laktaatti . Erilaisten ihmisen syöpien, ilmentymisen LDH-A säädeltiin [6], [7]. Ruokatorven okasolusyöpä, LDH-A oli säädellään ylöspäin syövän kudoksissa ja edistää selviytymistä kasvainsolujen [8]. Lisäksi LDH-A kerrottiin parantaa yritysten kasvua ja migraatiota mahalaukun syöpäsolujen [9]. Ilmaisulla tila ja toiminta LDH-A mahasyövän (GC) ovat edelleen tuntemattomia.

Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus LDH-A suuren ikäluokan GC yksilöitä ja korreloivat sen ilmaisutapoja kliinisiä patologisia parametreja ja yleistä (OS). Tuloksemme osoittavat, että ilmentyminen LDH-A oli säädelty kliinisessä mahasyövän näytteitä, ja proteiinin ilmentyminen korreloi iän ja histologisten luokitus. Lisäksi olemme havainneet, että korkea LDH-A ilmentyminen liittyi huonompi ennuste GC potilailla. Yhdessä meidän tutkimus paljasti kasvaimia synnyttävän funktion LDH-A mahasyövän ja ehdotti LDH-A uutena potentiaalinen ennustetekijä ja potentiaalinen terapeuttinen kohde.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

Tämä tutkimus mukana 264 potilasta, joilla GC jotka seurasivat parantava leikkaus tammikuusta 2006 toukokuuhun 2007 ensimmäisen sidoksissa sairaalaan Kiinassa Medical University. Ryhmä koostui 194 urosta ja 70 naarasta, joiden keski-ikä oli 59 (vaihteluväli 29-81) vuotta. Kukaan potilaista koki kemoterapian tai sädehoidon ennen leikkausta. Seuranta tiedot oli kerätty kaikilta potilailta.

Ethics lausunto

Eettinen hyväksyntä Tutkimuksen saatiin Research Ethics komitean Kiinan Medical University, Kiina. Kaikki potilaat tarjoavat kasvain kudosta sekä normaali mahan kudosnäytteitä allekirjoittivat suostumuslomakkeen ennen kirurgista poistoa mahakarsinooman jotta tämä tutkimustoimintaan. Kaikki eläimen tutkimuksen menettelyt olivat mukaisia ​​National Institutes of Health Guide for Care ja koe-eläinten käyttöä ja tehtiin mukaan institutionaalisten eettisten ohjeiden. Nämä laboratorio- eläimet ostettiin Shanghai Branch Center, Institute of Laboratory Animal Science, Kiina Academy of Medical Science (tunnetaan myös nimellä Shanghai CAS, todistuksen numero: SCXK [Hu] 2003-0003). Kaikki kokeelliset menetelmät suoritettiin mukaisesti hoitokäytännön hoitoon ja koe-eläinten käyttöä, ja protokollia hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Kiinassa Medical University, Shenyang, Kiina. Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Tissue Näytteet ja patologia

Kaikki potilaasta johdettujen parafiiniin Mahasyöpää näytteitä (n = 264) ja niiden yhteensovitettujen NNM yksilöitä (2 cm: n päässä karsinooma n = 209) kerättiin kirurgisen resektion ja arkistoidaan protokollien hyväksymien Institutional Review Boards ensimmäisen sidoksissa Hospital China Medical University. Tuore mahakarsinoo- ja viereisen NNM kerättiin ja jäädytettiin -80 ° C, kunnes proteiiniuutto homogenoimalla RIPA lyysipuskuria. Histologinen diagnoosi ja muut mikroskooppiset ominaisuudet varmistettiin patologien ja TNM lavastus kunkin mahakarsinoo- arvioitiin mukaan Union International Contre le Cancer (UICC) järjestelmä laajuudesta kasvaimen leviäminen. Histologinen arkkitehtuuri mahakarsinooman ilmaistiin Lauren luokittelun ja Maailman terveysjärjestön (WHO) luokituksen. Lisäksi kasvaimen koko, syvyys hyökkäystä, ja imusuonten määritettiin.

Solulinjat ja kulttuurin

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjoissa MKN28 (no eriytetty), AGS, SGC-7901 (kohtuullisesti erilaistunut ), MGC803 (huonosti eriytetty) ja ihmisen normaali mahan solulinjaa GES-1 ostettu solusta pankin Kiinan tiedeakatemia. Viisi solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640 (Hyclone, Logan kaupunki, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Kaikki solulinjat olivat 5% CO _{2 kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa.}

Tissue Microarray (TMA) ja immunohistokemia

edustaja alueita kiinteiden kasvainten ja viereisen NNM tunnistettiin HE leikkeitä valitun tapauksissa ja 1,5 mm: n läpimittaiset kudoksen ydin per luovutuslohkon lyötiin ulos ja siirretään vastaanottajalle lohko enintään 200 (10 x 20) ytimet käyttäen 1,5 mm: n halkaisijan painin- väline. Sen jälkeen uudelleen sulatettu, osat (4 pm paksu) on peräkkäin leikattiin kustakin kudoksesta microarray lohko, HE-värjäys suoritettiin TMA vahvistusta kasvain ja limakalvon kudos. Immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin TMA osia, Painekattila välittämä antigeenin haku suoritettiin sitraattipuskurilla (pH 6,0) 10 minuutin ajan. Leikkeitä inkuboitiin 1:300 laimennus LDH-A (lihas-alayksikkö) Rabbit Monoclonal Antibody (epitomics) yön yli 4 ° C: ssa, ja sitten inkuboitiin vuohen anti-hiiri tai anti-kani-Envision System Plus-HRP: tä (Dako Cytomation) ja 30 min huoneen lämpötilassa. Huuhtelun jälkeen kolmesti PBS 10 minuuttia kutakin, leikkeitä inkuboitiin DAB 1 min, vastavärjätään Mayer hematoksyliinillä, kuivattu, poistetaan ja asennetaan. Poisjättäminen ensisijainen vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina.

Western blot -analyysi

proteiinit pitoisuudet näytteistä uutetaan kudosnäytteet ja solulinjoissa käyttämällä radioimmuunisaostuspuskurissa määritystä hajotuspuskuria määritettiin käyttämällä Bradford-reagenssia ( Sigma) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Denaturoitu proteiini erotettiin natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -polyacrylamide geeliä (10% akryyliamidi) ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja (Millipore, Bedford, MA), joka sen jälkeen estetty 5% rasvaton maito Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,5). Immunoblottausta, kaivoa inkuboitiin yön yli LDH-A (lihas-alayksikkö) Rabbit Monoclonal Antibody (1:1500) (epitomics) 4 ° C: ssa. Sitten huuhdottiin TBST: ssä ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineita 15 minuutin ajan. Signaalit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin (Pierce, Rockford, IL).

jatkotoimet Surgery

264 potilasta, joille tehtiin gastroctomy tehtiin tarkka kliininen seuranta, mukaan lukien rinta /vatsan /lantion tietokonetomografia tomographic (CT), CEA tasolla, ja verikokeiden 2-3 kuukautta välein ja vuosittain gastroskopialla. Seuranta oli sopusoinnussa National Kattava Cancer Network (NCCN) Practice Guidelines mahasyövän. Kokonaiselinaika (OS) korko määriteltiin aikaväli alkuperäisestä leikkauksen kuolemaan. Lopussa päivämäärä seurantatutkimuksen johtamiseksi analyysi oli 29. kesäkuuta 2012.

arviointi immunohistokemiallinen värjäys

immunoreaktiivisuus arvioitiin riippumattomasti kaksi tutkijaa, jotka olivat sokaissut potilaiden hoitotuloksiin. Arviointi perustui värjäytymisen intensiteettiä. Värjäytymisvoimakkuus LDH-A pisteytettiin 0 (negatiivinen); 1 (heikko); 2 (kohtalainen); ja 3 (voimakas). Yksilöt jaettiin kahteen ryhmään niiden tulokset: 0 ja 1 ovat alhaiset ilmaus ryhmä; 2 ja 3 ovat korkeat ilme ryhmä. Jos poikkeamasta pisteytys, levyt tutkittiin uudelleen sekä patologit mikroskoopilla.

Generation of Small häiritsevien (si) RNA Knockdown stabiilit solulinjat

Perustuu LDH -A-sekvenssi, shRNA suunniteltiin käyttäen siRNA Target Finder (Ambion): n nukleotidisekvenssi on lisätty ShLDH-A oli 5'-ATCCAGTGGATATCTTGACCTACG TGGCT-3 '. Luodut solulinjat infektoimalla solut salattu plasmidia käytettiin kontrollina. 10 ug shRNA ja 25 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) sekoitettiin yhdessä 1350 ui RPMI-1640-alustassa (ilman FBS: ää), ja sitten seos transfektoitiin MGC-803 mahalaukun syöpäsoluja. Seos lisättiin 25-cm ^{2 kulttuuri pulloon, joka oli aiemmin päällystetty 1 x 10 6 MGC-803 mahalaukun syöpäsoluja. Elatusaine korvattiin täydellistä RPMI-1640-alustassa 6 tuntia inokulaation jälkeen ja 28 h transfektion jälkeen, stabiili solu- kloonit valittiin 2 viikkoa neomysiinin kanssa ja analysoitiin immunoblottauksella.}

RNA uuttaminen ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol reagenssia mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen), ja 1 ug RNA: ta käsiteltiin suoraan cDNA käyttämällä käänteisen transkription kit (Promega, Madison, Wisconsin), mukaan valmistajan ohjeiden. Monistusreaktiot suoritettiin 20 ul: n tilavuus 0,2 ui SYBR Green (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia). Nämä reaktiot suoritettiin kolminkertaisina käyttäen BioRad iCycler (Bio-Rad). p-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: LDH-A, 5'-CTCCTGTGCAAAATGGCAAC-3 '(eteenpäin) ja 5'-CCTAGAGCTCACTAGTCACAG-5' (käänteinen); andβ-Actin, 5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 '(eteenpäin) ja 5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3' (reverse). Spesifisyyden reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää varmistettiin sulamiskäyräanalyysillä ja agaroosigeelielektroforeesilla.

MTT ja Colony muodostumisen määritys

solun kasvun analyysi, joka on yhtä suuri määrä soluja siirrostettiin 48 -kuoppaiset levyt. Kokonaismäärä solujen mitattiin päivittäin MTT-määritystä mukaan valmistajan protokollan (Roche Applied Science). Pesäkkeiden muodostumisen analyysi, yhtä monta valvontaa solujen ja solujen hiljentäminen ilmentymistä LDH-A ympättiin 60 mm viljelymalja kolmena kappaleena. Soluja viljeltiin 7 päivää, Cell kasvua lopetettiin 7 päivää viljelmässä poistamalla väliaine ja lisäämällä 0,5% kristalliviolettia liuos 20% metanolia. Värjäyksen jälkeen 5 minuuttia, kiinteä solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), kuvattiin, ja liuotettiin 1% SDS. Pesäkkeiden lukumäärä kussakin ryhmässä laskettiin.

tuumorigeenisyystesti Pitoisuus

MGC-803 GC solut -ksenografteja tuotettiin 6-viikkoisen naaras-kateenkorvattomia nude-hiirten (Vital River Laboratories, Peking, Kiina) injektiolla 5 x 10 ^{6 solua 0,2 ml: ssa PBS: ää kylkeen kunkin hiiren (6 hiirtä /ryhmä). Kasvaimen muodostuminen arvioitiin viikoittain. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: V (mm 3) = a x b 2/2 (jossa on suurin pinnallinen halkaisija ja b on pienin pinnallinen halkaisija).}

mittaus laktaattipitoisuuden ja ATP Production

Kun oli inkuboitu 48 tuntia, laktaatti, ja ATP-tasot viljelyalustassa mitattiin käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa määritystä sarjat (ostettu BioVision [Mountain View, California], ja Roche Applied Science , vastaavasti). Tulokset korjattiin Lopullisessa solumäärä numero.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Kaiken eloonjäämisluvut määritettiin käyttäen Kaplan-Meier estimaattori, tapahtuman ollessa määritetty kuolemaan syöpään liittyvien syy. Log-rank-testi käytettiin tunnistamaan erot eloonjäämiskäyrien. Vuonna univariate analyysi, kaksihäntäinen χ ^{2 testejä tai kaksisuuntaisia ​​t-testiä käytettiin tilastolliseen vertailuun. Ja Coxin suhteellisen riskin malliin käytettiin yhden muuttujan analyysin ja Monimuuttuja-analyysissä tunnistaa merkittäviä tekijöitä korreloivat ennusteeseen. Kaikissa analyyseissä, ainoastaan ​​P-arvot < 0,05 pidettiin merkittävinä.}

Tulokset

LDH-A Expression in Human mahasyövän Tissue

porrastettu värjätään osia TMA GC ja NNM kudoksen ytimet niiden sytoplasman immunohistokemiallisella värjäyksellä intensiteetti vastaan ​​LDH-proteiini. Luettava näytteet ovat 264 mahakarsinoo- ja 209 Hyväksytty NNM. Tyypillinen diffuusi sytoplasman värjäytyminen proteiini voidaan monissa mahakarsinooman ja normaali mahan kudoksissa, kuten on esitetty kuviossa 1, syöpäkudoksessa positiivisesti sytoplasmista värjäytymistä 201 tapauksessa (76,14%), kun taas muun 209 tapausta NNM, 131 tapausta ( 62,68%) oli LDH-positiivinen ekspressio (taulukko 1). Ilmentymisen tutkimiseksi määrä LDH-A GC näytteiden ilmentymisen LDH-A tutkittiin Western blot -analyysillä seitsemän satunnaisesti valitun kasvaimia ja pariksi normaaleissa kudoksissa. Ylössäätöä LDH-A havaittiin GC näytteissä verrattuna pariksi normaaleissa kudoksissa (Fig. 2a). Nämä tutkimukset osoittivat, että LDH-A oli merkittävästi yläreguloituja syöpä- yksilöitä verrattuna viereiseen ei-syöpä kudoksiin (Taulukko 1. p = 0,002).

Expression Analyysi LDH-A Mahalaukun Cell Lines

Western blotting -analyysi suoritettiin mahalaukun solulinjoissa. Western blot osoitti, että ilmaus LDH-A oli merkitsevästi voimakas huonosti eriytetty MGC803 ja kohtuullisesti erilaistunut AGS; heikkoa kohtalaisen eriytetty SGC-7901 ja hyvin eriytetty MKN28; ja poissa ihmisen normaali mahan solulinjaa GES-1 (Fig. 2 b).

kliinis muuttujat 264 Tapauksia mahakarsinooman

Kuten yhteenveto taulukossa 2, Huomasimme, että lisääntynyt ilmentyminen LDH-A merkitsevästi yhteydessä potilaiden iästä (P = 0,004) ja histologinen tyyppi (P = 0,02), imusolmuke etäpesäke (P = 0,043), mutta ei sukupuolta (P = 0,072), kasvaimen koko (P = 0,086) , syvyys invaasio (P = 0,328), lymfaattinen invaasio (P = 0,738), lauren grade (P = 0,152) tai TNM (P = 0,417).

Survival Analysis

5 vuotisen OS nopeudella 264 primaarisessa mahasyöpä oli 46% (122/264), jossa on 142 kuolemantapausta havaittu seuranta-aikana. Mediaani seuranta-aika oli 50 kuukautta (vaihteluväli 9-78 kuukautta). Survival analyysi Kaplan-Meier selviytymisen käyrä ja log-rank-testi osoitti, että potilailla, joilla on korkea ilmentymisen LDH-A kasvainkudoksessa oli huomattavasti huonompi kokonaiselossaoloaikaa kuin potilailla, joiden kasvain alhainen LDH-A ilmentymistä (P < 0,001; Fig. 3) . Jonka tarkoituksena on selvittää mahdollisuudet suhde ilmaus LDH-A ja ennusteen erityyppisissä GC, arvioimme potilaiden selviytymiseen eri alaryhmiin: Kun tilastollinen analyysi suoritettiin ositettiin Lauren laatu ja histologinen luokitus, merkitys ilmestyi hajanainen tyyppi GC ja erilaistumaton tyyppi GC (P < 0,001, vastaavasti), mutta ei suoliston (P = 0,179) tai eriytetty (P = 0,104) niistä. Monimuuttuja-analyysi suoritettiin käyttäen Coxin suhteellisten riskien mallia kaikille muuttujat yksiulotteista analyysiin. Taulukossa 3 on esitetty merkitys: oikaistu muut covariates, tulokset monimuuttuja-analyysi osoitti, että LDH-A lauseke (P < 0,001), lymfaattinen invaasio (P = 0,046) ja Lauren laatu (P = 0,001), TNM (P = 0,006), mutta ei ikä (P = 0,053), kasvaimen koko (P = 0,111), syvyys invaasio (P = 0,598), imusolmuke etäpesäke (P = 0,089), tai histologinen tyyppi (P = 0,674), olivat riippumattomia ennustetekijöitä riskitekijöitä OS (taulukko 3).

knockdovvn LDH-A siRNA Vähentää Expression LDH-A MGC-803

mukaan western blot tulokset ja reaaliaikaisen RT -PCR: n ilmentyminen LDH-A väheni tehokkaasti LDH-A-siRNA ilmentävät MGC-803-soluja. Kuten kuviossa 4 on esitetty, ilmentyminen LDH-proteiini määritettiin western blot oli tuskin havaittavissa, ja PKM2 mRNA-tasolla väheni 74%, että LDH-A-siRNA ilmentävät MGC-803-soluja. LDH-A ilmaisu pysyivät muuttumattomina molemmissa GC solulinjoissa ja jotka ilmentävät ohjaus siRNA.

knockdovvn LDH-A inhiboivat GC Cell Lines MGC-803

arvioimiseksi kasvain solujen kasvua, käytimme MTT ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset. MTT-määrityksessä, hiljentäminen ilmentymisen LDH-A inhiboivat MGC-803-solut (Fig. 5a, b). Kasvu MGC-803 soluja, jotka ilmentävät LDH-A siRNA laski 64%, kun 168 tunnin inkuboinnin verrataan kontrollisoluihin (P < 0,05). Johdonmukaisesti, hiljentäminen ilmentymisen LDH-A vaimensi kiinnittymisestä riippumattoman kasvun MGC-803-solut (Fig. 5c, d). LDH-knockdown näissä soluissa esti pesäkkeen muodostumista, mikä osoittaa, että ankkurista riippuva kasvu palautui. Nämä tulokset viittasivat myös siihen, kasvaimia synnyttävän roolia LDH-A GC syöpään.

knockdovvn LDHA esti tuumorigeenisyyteen vierassiirrekokeissa Mouse Models

Tässä tutkimuksessa selvitimme tuumorigeenisen kapasiteetin LDH-A in vivo. Tuumorigeenisyyden in vivo MGC-803 siLDH-A-soluja ja kontrollisoluja arvioitiin sc solujen injektointia kateenkorvattomissa nude-hiirissä. Yhdenmukainen in vitro-tutkimuksissa, hiljentäminen ilmaus LDH-Dramaattisesti lievensi tuumorigeenisyyteen LDH-A solujen kasvaimen koon. Kaikkien Hyväksytty ksenografteissa, siLDH-A kasvaimet olivat merkittävästi pienempiä kuin valvonnan (Fig. 5e, f).

knockdovvn LDH-A siRNA Vähentää Lactate ja ATP: n tuotantoa ihmisen GC Cell Lines MGC- 803

Koska LDH-A on keskeinen entsyymi muuntamaan pyruvaatti osaksi laktaattia, muuttuminen ilmaisunsa GC soluissa pitäisi vaikuttaa laktaattituotanto ja energia-aineenvaihduntaa. Tämän hypoteesin testaamiseksi, vertasimme laktaatin ja ATP tuotannon välillä LDH-A siRNA pudotus solujen ja kontrollisolujen jälkeen 48 tunnin inkubaation. Kun LDH-A, joka pudotettiin siRNA, kyky solun tuottamaan laktaattia ja ATP dramaattisesti laski 61,5% ja 63,3% 48 tuntia, vastaavasti (Fig. 6a, b).

Keskustelu

1920, Warburg ensimmäinen osoitti, että syöpäsolut vievät korkeampia glukoosia kuin normaalit solut ja tuottavat energiaa lähes aerobinen Glykolyysivaiheen heidän energiantarpeesta sopeutua ympäristön asettamat rajoitukset, kuten ajoittainen hypoksiaa [10], [11]. Tämä metabolinen muutos ei ole pelkästään mukautuminen hapenpuuteympäristössä mutta on aktiivinen solu strategia, joka on merkittävä etu varten lisääntymistä ja maligniteetti. Nyt Vegran et al
. [12] ovat raportoineet, että laktaatti voi suoraan moduloida fenotyyppi endoteelisolujen, mahdollisesti se on tärkeä mekanismi, jonka avulla kasvaimia hallita omaa verenkiertoa kautta verisuonten morfogeneesin. Koska reaktiivisen hapen (ROS) ovat luonnollisia sivutuotteita mitokondrion hengitystä, on ehdotettu, että glukoosin konversio laktaatin voisi suojata syöpäsolujen oksidatiivisen stressin [13]. Äskettäin, tulokset viittaavat siihen, että palauttamalla normaali oksidatiivisen fosforylaation syöpäsoluissa voi paitsi estävät solujen kasvua ja proliferaatiota, mutta myös heikentää metastaattinen kapasiteetti pahanlaatuisten solujen [14]. Siksi on tärkeää konstitutiivisesti ajan säännelty aerobinen Glykolyysivaiheen on hiljattain tunnustettu syövän etenemiseen, mutta molekyylitason mekanismeja johtivat tähän fenotyypin ja heidän panoksensa syövän kehitystä ei ymmärretä hyvin.

LDH-A, entsyymi vastuulla on muutoksen pyruvaatti osaksi laktaattia, on tärkeä rooli prosessissa Glykolyysivaiheen. Useat tutkimukset ovat raportoitu, että ilmaisu LDH-A voitiin indusoida useat onkogeenien [15]. Nämä raportit tukevat sitä ajatusta, että LDH-A induktio on kriittinen onkogeeninen aktiivisuus näiden onkogeenien syöpäsoluissa.

kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden LDH-A on raportoitu ruokatorven karsinooma, haimasyöpä ja mahasyöpä soluihin [ ,,,0],8], [9], [16]. Yongjie Zhang et al
. raportoitu, että LDH-alentaminen voi estää tuumorigeenisyyden suoliston-tyypin mahalaukun syöpä (ITGC) solujen vähen- tämisessä Oct4 [17]. Ja Zhiyu Wang et al
. kertoi, että LDH-A hiljentäminen estää rintasyövän tuumorigeenisyystesti kautta induktion oksidatiivisen stressin välittämää mitokondrion reitin apoptoosin [18]. Tässä me tutkimme formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kasvainkudoksen 264 potilaiden ilmentymisen LDH-A: n ja ilmoitetaan karakterisointia LDH-A ilmentymistä ihmisen GC, ja esittää korrelaatio kliinis parametrien ja potilaiden ennusteeseen. Ensimmäinen, olemme huomanneet, että ilmentyminen LDH-A koholla GC näytteissä verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Tämä tulos saattaa olla yhdenmukainen edellisessä tutkimuksessa että erilaisissa ihmisen syövissä, ilmaus LDH-A sääteli [4], [5]. Kasvainkudoksessa, meidän tutkimus osoitti, että LDH-A-ilmentyminen korreloi voimakkaasti GC ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia: ikä, imusolmuke etäpesäke ja histologista luokitusta. Niinpä ehdotamme, että säädelty LDH-A ilmentyminen voi osaltaan lisääntymistä ja kehittymistä GC. Toiseksi, me edelleen analysoineet ennustetekijöiden roolia LDH-A eloonjäämiseen potilaiden GC. Kaplan-Meier-analyysi osoitti merkittävää yhdistyksen välillä LDH-A ilmaisun ja eloonjäämisaste potilaiden, ja potilaille, joilla on vahvempi LDH-A värjäys oli alempi eloonjäämisaste. Kun tilastollinen analyysi tehtiin ositettu Lauren laatu ja histologinen luokitus, merkitys esiintyi hajanainen tyyppi GC ja erilaistumaton tyyppi GC, mutta ei suoliston tai erilaistuneet. Erityiset siRNA vastaan ​​LDH-A suoritettiin MGC803 soluissa ja myöhäisempi solujen kasvua sekä in vitro ja hiiren malleissa. LDH-A Knockdown vähensi myös laktaatin ja ATP tuotantoa GC soluissa. Siksi tulokset viittaavat siihen, että ilmentyminen LDH-A oli itsenäisesti ennustetekijä OS, ja osoitti, että LDH-A saattaa olla onkogeenisessä rooli kasvainten kehittymistä, erityisesti hajanainen tyyppi GC tai erilaistumaton tyyppi GC potilaille. Yhdenmukainen Tutkimuksessamme se on raportoitu, että kaatamalla ilmentymistä LDH-A ihmisen maksasyövän solut voivat aiheuttaa apoptoosin [8], ja downregulation LDH-A voisi lisätä tuotantoa ROS ja sytosolin Ca2 + signalointi, mikä vähensi sisempi mitokondrion kalvon potentiaalia ja johti vapauttamaan sytokromi C maksasolukarsinoomassa soluissa.

yhdessä Tutkimuksemme osoittaa, että sääteli ilmentyminen LDH-A tarjoaa mahasyövän solujen kasvua etuja. Samaan aikaan, myös tutkimus viittaa LDH-A mahdollisena terapeuttisena kohteena.

• PLoS ONE: Lisääntynyt MicroRNA-630 Expression mahasyövän liittyy Poor Overall Survival
• PLoS ONE: Vaikutus Yksilöllinen ja Seudun sosioekonominen asema on mahasyövän Survival