PLoS ONE: klinikos reikšmė ir prognozinė vertė laktatdehidrogenazės išraiška skrandžio vėžiu sergantiems pacientams

Anotacija

Įvadas

LDH-A, atsakinga už transformuojant piruvato į laktato fermentas, buvo įrodyta, kad būti iki reguliuojama daugeliu vėžio rūšių ir sukelti daugiau agresyviai elgesys reguliuojant platinimu ir anti-apoptozę. Tačiau, jo išraiška skrandžio vėžio (GC) nebuvo būdinga kruopščiai. Šio tyrimo tikslas buvo išsiaiškinti išraišką ir galimą poveikį LDH-A GC.

Metodai

Mes išnagrinėjome LDH-A išraiška imunohistocheminiu apie GC audinių microarray (TMA) ir naudojant Vakarų dėmė ant šviežių GC audinių ir ląstelių linijų. buvo vertinami prognostinė vertė ir koreliacijos su kitais clinicopathologic veiksnių. Mes perkeltų siRNA į GC ląstelių prieš LDH-A. LDH-A buvo analizuojami Imunoblotingo ir realaus laiko RT-PGR. Ląstelių augimas buvo įvertintas in vitro ir in vivo. Laktato ir ATF gamybą ląstelėse buvo nustatytas.

Rezultatai

buvo reikšmingai didesnis LDH-A karcinoma išraiška nei ne neoplastiniu gleivinės (NNM). Nebuvo teigiama koreliacija LDH-A išraiškos su amžiumi, histologinio tipo ir limfmazgių metastazių. Išgyvenamumo analizė parodė, kad aukštos raiškos LDH-A GC buvo susijęs su mažesniu bendro išgyvenamumo (OS). Kai suskirstyti pagal Lauren lygio ir histologinio klasifikacija, reikšmė pasirodė difuzinio tipo ir nediferencijuotos tipo GC. Be daugiamatis analize, LDH-A išraiška GC buvo nepriklausoma prognostinę rizikos faktorius OS (rizikos santykis = 1,829, 95% PI 1,375-2,433, p < 0,0001). Konkretus siRNR prieš LDH-A GC ląstelių linijos atsilikusi ląstelių augimą in vitro ir pelių modelių. LDH-A nokdaunas taip pat sumažino laktato ir ATF gamybą GC ląsteles.

Išvados

Mūsų tyrimas parodė, kad onkogeninio vaidmenį LDH-A GC. LDH-A išraiška yra nepriklausoma prognostinė rizikos veiksnys GC pacientams ir iki reguliuojama išraiška LDH-A gali būti prognozuoti prastų rezultatų iš difuzinio tipo ir nediferencijuotos tipo GC. Mūsų rezultatai rodo, kad LDH-A gali būti potencialus terapinis taikinys skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Saulė X Saulė Z Zhu Z Guan O Zhang J Zhang Y et al., (2014) klinikos reikšmė ir prognozinė vertė laktatdehidrogenazės išraiška skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. PLoS ONE 9 (3): e91068. Doi: 10,1371 /journal.pone.0091068

Redaktorius: Antanas W.I. Štai Kinijos universiteto Honkonge, Honkongas

Įstojo rugpjūčio 12, 2013 m Priėmė: Vasario 7, 2014 m Paskelbta: Kovo 7, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Saulės et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijas iš mokslinių tyrimų projektų Liaoning provincijoje mokslo ir technologijų departamento (Nr 2007225017, Nr 2009225011-2 ir kodas 2011415052) ir mokslo ir technologijų projektus Shenyang City (Nr F11-264-1-19). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

apykaitos savybes vėžinių ląstelių žymiai skiriasi nuo tų normalių ląstelių, kaip vėžinės ląstelės pirmenybė panaudoti glikolizės vietoj mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo net deguoniui; šis reiškinys yra žinomas kaip Warburg poveikio [1], [2], [3]. Stebėtinai aukštos norma pradėjimo gliukozės ir laktato gamybą navikų dalyvaujant deguoniui pradėta Warburg spėlioti, kad nukrypęs nuo normos, metabolizmo procesai gali būti iš daugelio vėžio [2] priežastis. Tačiau, metabolinio transformacijos privalumas suteikia į vėžinių ląstelių lieka neaišku [4], [5]. Pastaruoju metu tarp onkogenų ir medžiagų apykaitos procesų ryšį atradimas paskatino susidomėjimą Warburg darbo atgimimas. Daugėja įrodymų, kad aerobinio glikolizės pritaikymas vėžinių ląstelių gali palengvinti vėžio plitimą [5]. Vėžys metabolizmas buvo pagal plataus tyrinėjimo atranda naujų veiksmingų gydymo nuo vėžio viltį.

LDH-A yra labai svarbus fermentas, kuris vaidina svarbų vaidmenį galutinio žingsnį Warburg poveikio konvertuojant piruvato į laktatą , Įvairių tipų žmogaus vėžio, buvo iki-reguliuojami LDH-A išraiška [6], [7]. Į stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma, LDH-A buvo reguliuojama į vėžio audinių ir skatinamas auglio ląstelių [8] išgyvenimą. Be to, LDH-A buvo pranešė, siekiant sustiprinti augimą ir migracijos skrandžio vėžio ląstelių [9]. Tačiau pasakymas statusą ir LDH-A funkcija skrandžio vėžiu (GC) vis dar nežinoma.

Šiame tyrime mes išnagrinėjo LDH-A išraiška didelėje kohortos GC egzempliorių ir koreliuoja jos išraiška su klinikiniais patologinių parametrus ir bendrojo išgyvenamumo (OS). Mūsų rezultatai rodo, kad LDH-A išraiška buvo reguliuojama klinikinių skrandžio vėžio mėginiai, ir baltymų raiška koreliavo su amžiumi ir histologinio klasifikacija. Be to, mes nustatėme, kad aukštos LDH-A išraiška buvo susijęs su blogesne prognoze GC pacientams. Kartu paėmus, mūsų tyrimas atskleidė onkogeninio funkciją LDH-A skrandžio vėžio ir pasiūlė LDH-A kaip naujas potencialus prognostinis faktorius ir galimą terapinį tikslą.

Medžiagos ir metodai

Pacientai

Šis tyrimas apėmė 264 pacientai, sergantys GC, kas po chirurginio gydymo nuo 2006 metų sausio iki 2007 gegužės mėn pirmasis filialas ligoninėje Kinijos medicinos universitete. Ši grupė buvo sudaryta iš 194 vyrų ir 70 moterų, kurių amžiaus vidurkis 59 (diapazonas, 29-81) metų. Nė vienas iš pacientų patyrė chemoterapija arba radioterapija prieš operaciją. Tolesni informacija buvo renkama iš visų pacientų.

Etika pareiškimas

Etikos patvirtinimas šio tyrimo buvo gauta iš tyrimų etikos komiteto Kinijos medicinos universitetas, Kinija. Visi pacientai, teikiančios naviko audinį, taip pat normalus skrandžio audinių mėginius pasirašytą sutikimo formą prieš chirurginio pašalinimo skrandžio karcinoma, kad būtų galima šis tyrimas turi būti imamasi. Visi gyvūnų studijų procedūros pagal National Institutes of Health vadovas už rūpestį ir naudojimo laboratoriniams gyvūnams ir buvo atlikta pagal institucinius etikos gaires. Šie laboratoriniai gyvūnai buvo įsigyti iš Šanchajaus filialas centras, instituto laboratorinių gyvūnų mokslo, Kinijos mokslų akademijos medicinos mokslų (taip pat žinomas kaip Šanchajus CAS, sertifikato numeris: SCXK [Hu] 2003-0003). Visi eksperimentiniai procedūros buvo atliktos laikantis įstaigoje patvirtintas gaires priežiūros ir naudojimo laboratoriniams gyvūnams, ir protokolai buvo patvirtintas Institucijų gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto Kinijos medicinos universitetas, Šenjangas, Kinija. buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų.

audinio mėginiai ir patologija

Visos pacientų gautas parafine skrandžio vėžio mėginiai (n = 264) ir jų suderintos NNM pavyzdžiai (2 cm atstumu nuo vėžio n = 209) buvo surinkti iš chirurginio rezekcija ir archyvuojami pagal institucinių apžvalga tarybų First susijusi ligoninės Kinijos medicinos universiteto patvirtintus protokolus. Šviežia skrandžio karcinoma ir greta NNM buvo surinkti ir užšaldyti -80 ° C iki baltymų ekstrahavimo homogenizuoti į Ripa lizės buferiniame tirpale. Histologinę diagnozę ir kiti mikroskopiniai charakteristikos buvo patvirtinta patologai ir TNM sustojimo kiekvieno skrandžio karcinoma buvo įvertintas atsižvelgiant į Sąjungos International Contre Le Vėžys (UICC) sistema naviko išplitimo mastą. Histologinę architektūra skrandžio karcinoma buvo išreikštas Lauren klasifikacija ir Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) klasifikaciją. Be to, naviko dydis, gylis invazija, ir limfinės buvo nustatytas.

Mobilaus ryšio linijos ir kultūra

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas MKN28 (gerai diferencijuotas), AGS, SGC-7901 (vidutiniškai diferencijuoti ), MGC803 (blogai diferencijuotas) ir normalus žmogaus skrandžio ląstelių linija GES-1 perkami iš ląstelių banko Kinijos mokslų akademija. Penki ląstelių linijos ir buvo išlaikytos RPMI 1640 (Hyclone Logan City, Jungtinės Valstijos) papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS). Visi ląstelių linijos buvo 5% CO _{2 sudrėkintas atmosferos 37 ° C temperatūroje.}

Audinių mikrogardeliq (PMA) ir imunohistocheminis

buvo nustatyti tipiniai sritys solidinių navikų ir gretimų NNM į HE-tamsintas skyrius pasirinktų atvejų ir 1,5 mm skersmens audinio šerdis už donoro blokas buvo perforuoti ir perkelti į recipiento blokas su maksimaliu 200 (10 × 20) branduolių, naudojant 1,5 mm skersmens Punch priemonę. Po vėl ištirpsta, sekcijos (4 mkm storio) buvo nuosekliai sumažinti nuo kiekvieno audinio mikrogardeliq blokas, JE Dažymo buvo atliktas PMA patvirtinimo naviko ir gleivinės audinio. Imunohistocheminis analizė buvo atlikta TMA sekcijų, slėgio sterilizatorių tarpininkaujant antigenas paieška buvo atlikta citrato buferio (pH 6.0) 10 min. Dalys buvo inkubuotos su 1:300 praskiedus LDH-A (raumenų subvieneto) Triušis monokloninis antikūnas (epitomics) per naktį 4 ° C, ir tada inkubuojami su ožkos anti-pelės arba anti-triušio Įsivaizduoti sistema plius-HRP (Dako Cytomation) dėl 30 min, esant kambario temperatūroje. Po skalavimo tris kartus PBS kiekvieno 10 min, sekcijos buvo inkubuojami su DAB 1 min, counterstained su Mayer hematoksilinu, dehidratuoti, išvalytas ir sumontuoti. Neveikimas pirminės antikūnų buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė.

Vakarų dėmė analizė

Baltymai koncentracijos mėginių, paimtų iš audinių pavyzdžius ir ląstelių linijų, naudojančių radioimmune kritulių analizė lizės buferiniame tirpale buvo nustatoma naudojant Bradford reagentą ( sigma), pagal gamintojo instrukcijas. Denatūruotas baltymas atskirtas ant natrio laurilsulfatas (SDS) -polyacrylamide gelio (10% akrilamido) ir perkelti į polivinilidenfluorido membranomis (MILLIPORE, Bedford, MA), kuris vėliau buvo užblokuotas 5% neriebios pieno tri-buferio druskų tirpalu (pH 7,5). Už munoblotingu, membrana buvo inkubuojami per naktį su LDH-A (raumenų subvieneto) triušis monokloninis antikūnas (1:1500) (epitomics), esant 4 ° C temperatūroje. Tada, ji buvo skalaujamas pagal TBST ir inkubuojami su antrinių antikūnų 15 minučių. Signalai buvo aptikta glaudesnio cheminės liuminescencijos (Pierce, Rokfordas, Ilinojus).

Tolesni po operacijos

264 pacientai, kuriems buvo atlikta gastroctomy buvo atliktas uždaryti klinikinį stebėjimą, įskaitant krūtinės /pilvo /dubens kompiuterinė mografais (KT) vaizdo CEA lygis, ir kraujo tyrimai ne nuo 2 iki 3 mėnesių intervalais ir kasmet gastroskopija. Tolesni buvo sutarimu su Nacionalinės Išsami Vėžys tinklas (NCCN) praktikos gairių skrandžio vėžio. Bendras išgyvenamumas (BI) norma buvo apibrėžtas kaip intervale nuo pradinės operacijos iki mirties. Pabaigos data tolesnių studijų atlikimo analizę buvo 29 June 2012

vertinimas imunohistocheminį dažymo

reaktyvumas buvo įvertintas nepriklausomai dviejų mokslininkų, kurie buvo apakinti pacientų rezultatus. Buvo įvertintas remiantis dažymo intensyvumo. Dažymo intensyvumas LDH-A pelnytas kaip 0 (neigiamas); 1 (silpnai); 2 (vidutinio sunkumo); ir 3 (stiprus). Egzemplioriai buvo suskirstyti į dvi grupes pagal jų rezultatais: 0 ir 1 yra mažai išraiška grupė; 2 ir 3 aukštai išraiška grupė. Tuo atveju, kai rezultatyviai neatitikimo atveju, skaidrės buvo pakartotinai tirti ir patologai mikroskopu.

kartos mažų trukdančių (SI) RNR triuškinantis Stabilus ląstelių linijų

Remiantis LDH -A seka, shRNR buvo sukurta naudojant siRNA Target Finder (Ambion): nukleotidų seka įdėtoje ShLDH-A buvo 5'-ATCCAGTGGATATCTTGACCTACG TGGCT-3 ". Ląstelių linija generuoja užkrėsti ląsteles su plakta plazmidės buvo naudojamas kaip kontrolės. 10 mikrogramų shRNR ir 25 mikrol Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life technologijos, Carlsbad, CA, USA) buvo sumaišytos su 1350 mikrol, RPMI-1640 terpėje (be FBS), ir tada mišinys buvo transfekuota į MGC-803 skrandžio vėžio ląsteles. Mišinys buvo įtraukta į 25 cm ^{2 kultūros kolbą, kuri anksčiau buvo chromuotas su 1 × 10 6 MSV-803 skrandžio vėžio ląsteles. Kultūrinė terpė buvo pakeistas visiškai RPMI-1640 vidutinio 6 h po suleistas ir 28 h po transfekciją, stabilios ląstelių klonai buvo pasirinktas 2 savaites su neomicinui ir analizuojami munoblotingu.}

RNR gavyba ir realaus laiko kiekybine RT-PGR analizė

iš viso RNR buvo išskirta iš ląstelių, naudojant TRIzol reagentą pagal gamintojo (Invitrogen) instrukcijas, ir 1 mikrogramų RNR buvo apdorojami tiesiogiai į cDNR naudojant atvirkštinę transkripciją rinkinį (PROMEGA, Madison, Viskonsinas), pagal gamintojo nurodymus. Amplifikacijos reakcijos buvo atliktas per 20-ties mikrol tūrio su 0,2 įxL SYBR Green (Bio-Rad, Hercules, California). Šios reakcijos buvo pakartotas tris kartus, naudojant BioRed iCycler (Bio-Rad). beta-Actin buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Naudojami pradmenys buvo taip: LDH-A, 5'-CTCCTGTGCAAAATGGCAAC-3 '(į priekį) ir 5'-CCTAGAGCTCACTAGTCACAG-5' (atgal); andβ-Actin, 5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 "(pirmyn) ir 5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3" (atgal). Iš realaus laiko kiekybine PGR specifiškumas buvo patikrintas tirpsta kreivės analizę ir agarozės gelio elektroforezės.

MTT ir "Colony formavimas Analizės

ląstelių augimo analizė, lygus ląstelių skaičius buvo pasėjamos 48 -well plokštės. Bendras ląstelių skaičius buvo matuojamas kiekvieną dieną pagal MTT pagal gamintojo protokolą (Roche Applied Science). Colony formavimo analize, lygus kontrolinių ląstelių skaičius ir ląstelių triukšmo slopinimo į LDH-A išraiška buvo pasėjamos į 60 mm kultūros patiekalas tris kartus. Ląstelės buvo auginamos 7 dienas, Ląstelių augimas buvo sustabdytas po 7 dienų kultūros pašalinant terpę ir pridedant 0,5% violetinei sprendimą 20% metanoliu. Po to, kai dažymo 5 min, fiksuotos ląstelės buvo išplauti su fosfato-buferio druskų tirpalo (PBS), fotografuojami, ir ištirpinamas su 1% SDS. buvo skaičiuojamas kolonijų kiekvienoje grupėje skaičius.

tumorogeniš- Analizės

MSV-803 GC ląstelių ksenoimplantai buvo gaminami 6 savaičių amžiaus Patelė athymic nuogas pelėmis (Vital River Laboratorijos, Pekinas, Kinijos) injekuojant 5 × 10 ^{6 ląstelių 0,2 ml PBS į kiekvienos pelės krašto (6 peles /grupė). Auglio susidarymą buvo vertinami kiekvieną savaitę. Naviko tūris buvo apskaičiuotas pagal formulę: v. (Mm 3) = a × b 2/2 (kai yra didžiausia paviršutiniškas skersmuo ir b yra mažiausias paviršutiniškas skersmens)}

matavimo laktato koncentracija ir ATP gamybą

Po 48 valandų inkubavimo, laktato ir ATF lygio kultūra žiniasklaidoje buvo matuojamas naudojant rinkoje parduodamus testą rinkiniai (perkamos iš BioVision [Mountain View, California] ir Roche Applied Science , atitinkamai). Rezultatai buvo ištaisyta per galutinį ląstelių kiekį numerį.

Statistinė analizė

Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Bendras išgyvenamumas buvo nustatomas naudojant Kaplan-Meier prognozės, įvykis apibrėžiamas kaip mirties nuo vėžio susijusių priežasčių. Žurnalo-rank testas buvo naudojami siekiant nustatyti skirtumus tarp išgyvenimo kreivių. Be požymį analizės, du-tailed χ ^{2 testai ar du-tailed t testas buvo naudojamas statistinių palyginimų. Ir Cox proporcinio pavojaus modelis buvo naudojamas pagal vieną požymį analizės ir Dispersinės analizės duomenimis, nustatyti reikšmingus veiksnius koreliuoja su prognozė. Dėl visų analizių, tik P vertes. ≪ 0,05 buvo laikomas svarbiu}

Rezultatai

LDH-A išraiška žmogaus skrandžio vėžio audinių

rūšiuojami tamsintas skyriuose TMA GC ir NNM audinio šerdis jų citoplazmos imunohistocheminio dažymo intensyvumo prieš LDH-baltymas. Perskaitomas mėginių 264 skrandžio karcinoma, 209 atitiko NNM. Tipiškas difuzinis citoplazminės dažymo baltymo galima rasti daugelyje skrandžio karcinoma ir normalioms skrandžio audinių, kaip parodyta 1 paveiksle, naviko audinyje parodė teigiamą citoplazminio dažymas, 201 atvejais (76,14%), o tarp 209 atvejais nnm, 131 atvejais ( 62.68%) turėjo LDH-A teigiamą išraiška (1 lentelė). Ištirti išraiška kiekį LDH-A GC mėginių, iš LDH-A išraiška buvo nagrinėjamas Vakarų dėmė analizė septyniose atsitiktinai atrinktų navikų ir suporuotas normaliuose audiniuose. Up-reguliavimo LDH-A buvo stebimas GC mėginių, palyginti su suporuotas normaliuose audiniuose (Pav. 2A). Šie tyrimai parodė, kad LDH-A buvo žymiai aktyvinama visų vėžinių egzempliorių, palyginti su gretimų nevėžinės audiniuose (1 lentelė, p = 0,002).

išraiška analizė LDH-A skrandžio ląstelių linijų

imunoblotingu analizė buvo atlikta skrandžio ląstelių linijų. Vakarų dėmė parodė, kad išraiška LDH-A buvo žymiai stipri blogai diferencijuotu MGC803 ir vidutiniškai diferencijuoti AGS; silpnas vidutiniškai diferencijuotam SGC-7901 ir gerai diferencijuotas MKN28; ir išvykęs į normaliam žmogaus skrandžio ląstelių linijos GES-1 (2 pav. B).

klinikos Kintamieji 264 bylų Skrandžio vėžys

Kaip apibendrinti 2 lentelėje, Mes nustatėme, kad padidėjo išraiška LDH-A buvo reikšmingai susijęs su amžiumi pacientų (p = 0,004) ir histologinis tipas (p = 0,02), limfmazgių metastazių (p = 0,043), bet ne su lytimi (p = 0,072), naviko dydžio (p = 0,086) , gylis invazijos (p = 0,328), limfinės invazija (p = 0,738), Lauren įvertinimas (p = 0,152) arba TNM stadija (p = 0,417).

išgyvenamumo analizė

5 metų trukmės OS kursas 264 pacientams, sergantiems pirmine skrandžio vėžio buvo 46% (122/264), pastebėtą per stebėjimo laikotarpį 142 mirčių. Trukmės mediana tolesnių buvo 50 mėnesiai (diapazonas, 9-78 mėnesių). Išgyvenamumo analizė Kaplan-Meier išgyvenamumo kreivės ir log-rank testas parodė, kad pacientams, sergantiems didelio išraiška LDH-A auglio audinio turėjo žymiai blogiau bendrą išgyvenimą, nei pacientams, sergantiems naviko mažo LDH-A išraiškos (P < 0,001; pav. 3) , Su tyrinėti galimą ryšį tarp LDH-A išraiškos ir įvairių tipų GC prognozės tikslu įvertinome pacientų skirtingų pogrupių išlikimą: Kai statistinė analizė buvo atlikta suskirstyti pagal Lauren lygio ir histologinio klasifikacija, reikšmė pasirodė difuzinis tipas GC ir nediferencijuotos tipas GC (P < 0,001, atitinkamai), bet ne žarnyno (P = 0,179) arba diferencijuotų (p = 0,104) tie. Daugiamatė analizė atlikta naudojant Cox proporcinės rizikos modelį visus reikšmingus kintamuosius į vieną požymį analizė. 3 lentelė rodo reikšmę: koreguotą kitų kintamųjų, rezultatai iš Dispersinės analizės parodė, kad LDH-A išraiška (p < 0,001), limfinės invazija (p = 0,046) ir Laura įvertinimas (p = 0,001), TNM stadija (p = 0,006), bet ne amžius (p = 0,053), naviko dydis (P = 0,111), gylis invazijos (P = 0,598), limfmazgių metastazių (P = 0.089), arba histologinis tipas (P = 0,674), buvo nepriklausoma prognostinė rizikos veiksniai OS (3 lentelė).

triuškinantis ir LDH-A iki siRNA Sumažina LDH-A raišką MSV-803

Pasak Vakarų dėmė rezultatus ir realiu laiku RT -PCR, kad LDH-A išraiška efektyviai sumažėjo LDH-A-siRNA išreikšti MSV-803 ląstelių. Kaip parodyta 4 paveiksle, išraiška LDH-baltymas tiriami Vakarų dėmė buvo sunkiai aptinkamas ir PKM2 iRNR lygis buvo sumažintas 74% į LDH-A-siRNA išreiškiant MSV-803 ląstelių. LDH-A išraiška išliko nepakitęs tiek GC ląstelių linijų ir ląstelių linijas valdiklį siRNA.

triuškinantis iš GC ląstelių linijų MSV-803
LDH-A slopino augimo

Jei įvertinti naviko ląstelių augimą, mes panaudojome MTT ir kolonijų formavimosi tyrimų. Į MTT, triukšmo slopinimo, kad LDH-A išraiška slopino MGC-803 ląstelių proliferaciją (. 5a pav, b). Iš MSV-803 ląstelių išreiškė LDH-A siRNA augimas sumažėjo 64%, po 168 valandų inkubacijos, palyginti su kontrolinių ląstelių (P < 0,05). Nuosekliai, triukšmo slopinimo į LDH-A išraiška susilpnintas tvirtinimo nepriklausomas augimą MSV-803 ląstelių (. 5c pav, D). LDH-A nokdaunas šių ląstelių užkirstas kolonija formavimas, nurodant, kad tvirtinimo priklausoma augimą buvo atkurta. Šie rezultatai dar pasiūlė onkogeninio vaidmenį LDH-A GC vėžio.

triuškinantis iš LŠTA slopino iš svetimo pelės modeliai tumorogeniš-

Šiame tyrime mes išnagrinėjo tumorogeniškas pajėgumą LDH-A in vivo. In vivo su MSV-803 siLDH-A ląstelių ir kontrolinėse duobutėse tumorogeniškumo buvo įvertintas sc injekcijos ląstelių athymic nuogas pelių. Suderinamas su in vitro tyrimais, triukšmo slopinimo į LDH-A išraiška labai silpnos, kad LDH-A ląstelių tumorogeniš- auglio dydį. Dėl visų suderintų audiniuose,, siLDH-A navikai buvo gerokai mažesnis nei kontroliniuose (pav. 5e, F).

triuškinantis ir LDH-A iki siRNA Sumažina laktato ir ATF gamyba Žmogaus GC ląstelių linijų MGC- 803

Kadangi LDH-A yra pagrindinis fermentas pertvarkyti piruvato į laktato, pakeitimas jo raiškos GC ląstelių turi įtakos laktato gamyba ir energijos apykaitą. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes palyginti laktato ir ATF gamybą tarp LDH-siRNR triuškinantis ląstelių ir kontrolinėse duobutėse po 48 valandų inkubacinio. Kai LDH-A buvo partrenkė siRNA, iš ląstelių gebėjimą gaminti laktato ir ATF buvo dramatiškai sumažėjo 61,5% ir 63,3%, esant 48 valandų, atitinkamai (Pav. 6a, b).

Diskusijos

1920 "Warburg pirmasis įrodė, kad vėžio ląstelės užima aukštesnius tarifus gliukozės negu normalios ląstelės ir gaminti energiją beveik aerobinio glikolizės už jų energijos poreikis prisitaikyti aplinkosaugos apribojimus, pavyzdžiui, su pertrūkiais hipoksija [10], [11]. Tačiau šis apykaitos pokyčiai yra ne tik prisitaikymo prie hipoksinio aplinką, bet yra aktyvus ląstelių strategija, kuri suteikia didelį pranašumą dėl neplatinimo ir piktybinių navikų. Dabar Vegran ir kt
. [12], pranešė, kad laktato gali tiesiogiai moduliuoti endotelio ląstelių fenotipo, potencialiai reiškiantis svarbų mechanizmą, pagal kurį navikai kontroliuoti savo kraujo tiekimą per kraujagyslių morfogenezę. Nes aktyvių deguonies formų (ROS) yra natūralus šalutinių produktų mitochondrijų kvėpavimo, buvo pasiūlyta, kad gliukozės kiekis konversijos į laktato gali apsaugoti vėžines ląsteles nuo oksidacinio streso [13]. Neseniai rezultatai rodo, kad atkurti normalų oksidacinio fosforilinimo vėžinių ląstelių gali ne tik slopinti ląstelių augimą ir proliferaciją, bet ir pakenkti metastazavusiu pajėgumą piktybinių ląstelių [14]. Todėl konstitutyviai iki-reguliuojamoje aerobinio glikolizės svarba neseniai buvo pripažintas naviko progresavimo, bet molekulinės mechanizmais, šio fenotipo ir jų indėlį į vėžio išsivystymo dar nėra gerai suprantamos.

LDH-A, fermentas atsakingas už transformuojant piruvato į laktato, vaidina svarbų vaidmenį glikolizės procese. Keletas tyrimų, pranešė, kad iš LDH-A išraiška gali būti sukeltas nuo onkogenų [15] skaičius. Šios ataskaitos remti idėją, kad LDH-A KAITINIMO labai svarbu, kad onkogeninių veiklos šiose onkogenų į vėžines ląsteles.

onkogeninė veikla LDH-A buvo pranešta stemplės vėžio, kasos vėžio ir skrandžio vėžio ląstelių [ ,,,0],8], [9], [16]. Yongjie Zhang ir kt
. Pranešama, kad LDH-sumažinimas gali slopinti žarnyno tipo skrandžio vėžys (ITGC) ląstelių tumorogeniš- iki downregulating Oct4 [17]. Ir ZhiYu Wang ir kt
. Pranešama, kad LDH-triukšmo slopinimo slopina krūties vėžio tumorogeniš- per indukcijos oksidacinio streso tarpininkaujant mitochondrijų rūšyse apoptozės [18]. Čia mes išnagrinėjo formalinu fiksuoto, parafino-embedded naviko audinį iš 264 pacientų už LDH-A žodžio ir pranešė apie LDH-A išraiška žmogaus GC apibūdinimą, ir pateikti jos ryšį su klinikos parametrų ir paciento prognozė. Pirma, mes nustatėme, kad LDH-A išraiška buvo padidėjusi GC mėginių, palyginti su suderintų normaliuose audiniuose. Šis rezultatas gali būti suderinti su ankstesniame tyrime, kad įvairių rūšių žmogaus vėžio, buvo iki-reguliuojami LDH-A išraiška [4], [5]. Naviko audinyje, mūsų tyrimas parodė, kad LDH-A išraiška buvo stipriai koreliuoja su GC clinicopathologic charakteristikas: amžių, limfmazgių metastazių ir histologinis klasifikacija. Todėl mes pasiūlyti, kad iki reguliuojama LDH-A ekspresija gali prisidėti prie platinimo ir GKS vystymosi. Antra, mes toliau analizuojami prognostinę vaidmenį LDH-A bendram išgyvenamumui pacientams, sergantiems GC. Kaplan-Meier analizė parodė reikšmingą ryšį tarp LDH-A saviraiškos ir bendro išgyvenamumo pacientų ir pacientų, sergančių stipresnį LDH-dažymo turėjo mažesnę išgyvenamumas. Kai statistinė analizė buvo atlikta sluoksninė Lauren lygio ir histologinio klasifikacija, reikšmė pasirodė difuzinio tipo GC ir nediferencijuotos tipo GC, bet ne žarnyno ar diferencijuotų tie. Specifinis siRNR prieš LDH-A buvo atliktas MGC803 ląstelių ir uždelsto veikimo ląstelių augimą tiek in vitro ir in pelės modeliai. LDH-A nokdaunas taip pat sumažino laktato ir ATF gamybą GC ląsteles. Todėl, mūsų rezultatai rodo, kad išraiška LDH-A buvo nepriklausomai prognostinis faktorius OS, ir nurodė, kad LDH-A gali turėti onkogeninio vaidmenį auglių vystymuisi, ypač difuzinio tipo GC ar nediferencijuotose tipas GC pacientams. Suderinamas su mūsų tyrimo duomenimis, buvo pranešta, kad beldžiasi žemyn LDH-A išraiška žmogaus kepenų ląstelių karcinoma ląstelių gali sukelti apoptozę [8], ir downregulation iš LDH-A gali padidinti ROS ir citozoliniame Ca2 + signalizacijos gamybą, kuri mažėjimo vidinis mitochondrijų membranos potencialą ir paskatino citochromo C kepenų ląstelių karcinoma ląstelių spaudai.

kartu paėmus, mūsų tyrimas rodo, kad iki reguliuojama išraiška LDH-A suteikia skrandžio vėžio ląstelių augimo privalumais. Tuo pačiu metu, mūsų tyrimas rodo, LDH-A kaip galimą terapinį tikslą.

• PLoS ONE: Padidėjęs MicroRNA-630 raiška Skrandžio vėžys yra susijęs su prastai Survival
• PLoS ONE: individualių ir Kaimynystės socialinės ir ekonominės padėties poveikį skrandžio vėžio Survival