PLoS ONE: Clinicopathological Bedeutung und prognostischen Wert von Lactatdehydrogenase A Expression in Magenkrebs Patients

Abstrakt

Einführung

LDH-A, das Enzym, das für die Pyruvat in Lactat-Transformation, hat sich gezeigt, hochreguliert in vielen Arten von Krebs und zu verursachen aggressiveres Verhalten zu sein, indem die Proliferation und anti-Apoptose regulieren. Allerdings hat seine Expression in Magenkrebs (GC) nicht gründlich charakterisiert. Der Zweck dieser Studie war es, die Expression und die möglichen Auswirkungen von LDH-A in GC zu klären.

Methoden

Wir LDH-A-Expression mittels Immunhistochemie auf GC Tissue Microarray (TMA) untersucht und mit Hilfe Western-Blot auf frischen GC Geweben und Zelllinien. Die prognostische Wert und die Korrelation mit anderen klinisch-pathologische Faktoren wurden ausgewertet. Wir transfizierten siRNA in Zellen GC gegen LDH-A. LDH-A wurde durch Western-Blot-und Echtzeit-RT-PCR analysiert. Das Zellwachstum wurde in vitro und in vivo bewertet. Lactat und die ATP-Produktion von Zellen bestimmt.

Ergebnisse |

Es war signifikant höher LDH-A-Expression in Karzinom als in nicht-neoplastische Schleimhaut (NNM). Es gab eine positive Korrelation von LDH-A-Expression mit dem Alter, histologischen Typ und Lymphknotenmetastasen. Survival-Analyse zeigte, dass eine hohe Expression von LDH-A in GC wurde mit einer geringeren Gesamtüberleben (OS) zugeordnet ist. Wenn von Lauren Grad und histologischen Klassifikation geschichtet, erschien Bedeutung in diffuse Art und undifferenzierten Typ GC. In der multivariaten Analyse der LDH-A-Expression in GC war ein unabhängiger prognostischer Risikofaktor für OS (Hazard Ratio = 1,829, 95% CI 1,375-2,433, P < 0,0001). Spezifische siRNA gegen LDH-A in GC-Zelllinie verzögert das Zellwachstum sowohl in vitro als auch in Maus-Modellen. LDH-A Zuschlags auch Laktat und die ATP-Produktion in GC-Zellen reduziert.

Schlussfolgerungen

Unsere Studie die onkogene Rolle von LDH-A in GC zeigte. LDH-A-Expression ist ein unabhängiger prognostischer Risikofaktor bei der GC-Patienten und hochregulierte Expression von LDH-A könnte in diffusen Typ und undifferenzierten Typ GC prädiktiv für schlechte Ergebnisse sein. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass LDH-A könnte ein mögliches therapeutisches Ziel bei Magenkrebs sein

Citation. Sun X, Sun Z, Zhu Z, Guan H, Zhang J, Zhang Y et al. (2014) Clinicopathological Bedeutung und prognostischen Wert von Lactatdehydrogenase A Expression in Magenkrebs-Patienten. PLoS ONE 9 (3): e91068. doi: 10.1371 /journal.pone.0091068

Editor: Anthony W. I. Lo, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong

Received: 12. August 2013 beginnen; Akzeptiert: 7. Februar 2014; Veröffentlicht am: 7. März 2014

Copyright: © 2014 Sun et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus den Forschungsprojekten in der Provinz Liaoning Abteilung Wissenschaft und Technologie (Nr 2007225017, Nr 2009225011-2 und Nr 2011415052) und Wissenschaft und Technologie-Projekte in der Stadt Shenyang (Nr F11-264-1-19) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

die metabolischen Eigenschaften von Krebszellen divergieren erheblich von denen von normalen Zellen, wie Krebszellen, bevorzugt Glykolyse anstelle der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung verwenden, sogar in Gegenwart von Sauerstoff; Dieses Phänomen ist als der Warburg-Effekt [1], [2], [3] bekannt. Die überraschend hohe Rate der Glucose- und Lactat-Produktion in Tumoren in Gegenwart von Sauerstoff geführt Warburg Aufnahme zu spekulieren, dass aberrante Stoffwechsel die Ursache für viele Krebsarten werden [2]. Der Vorteil der metabolischen Umwandlung verleiht, um Krebszellen bleibt jedoch unklar, [4], [5]. Vor kurzem hat zu einem Wiederaufleben des Interesses führte die Entdeckung der Verbindung zwischen Onkogenen und Stoffwechselprozesse in Warburgs Arbeit. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Anpassung der aeroben Glykolyse von Krebszellen könnte Krebs Proliferation [5] erleichtern. Krebs Stoffwechsel hat sich in der Hoffnung auf die Entdeckung neuer wirksamer Therapien für Krebs unter umfangreichen Exploration gewesen.

LDH-A, ist eine entscheidende Enzym, das eine wichtige Rolle in der letzten Stufe der Warburg-Effekt spielt durch Pyruvat-Umwandlung zu Laktat . In verschiedenen Arten von Krebserkrankungen des Menschen, wurde die Expression von LDH-A hochreguliert [6], [7]. In Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus, war LDH-A in Krebsgewebe hochreguliert und förderte das Überleben von Tumorzellen [8]. Zusätzlich LDH-A wurde berichtet, das Wachstum und die Migration von Magenkrebszellen [9] zu verbessern. Jedoch bleiben die Expressionsstatus und die Funktion der LDH-A in Magenkrebs (GC) noch unbekannt.

In dieser Studie haben wir die Expression von LDH-A in einer großen Gruppe von GC Proben untersucht und ihre korrelierte Expression mit klinischen pathologischen Parametern und Gesamtüberleben (OS). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Expression von LDH-A wurde in den klinischen Magenkrebsproben hochreguliert, und die Proteinexpression wurde nach Alter und histologische Klassifizierung korreliert. Darüber hinaus fanden wir, dass hohe LDH-A-Expression mit einer schlechteren Prognose bei GC Patienten in Verbindung gebracht wurde. Zusammengenommen unsere Studie zeigte die onkogene Funktion von LDH-A bei Magenkrebs und schlug vor, LDH-A als neue potenzielle prognostischer Faktor und ein mögliches therapeutisches Ziel.

Materialien und Methoden

Patienten

die vorliegende Studie umfasste 264 Patienten mit GC, die kurative Operation von Januar 2006 bis Mai 2007 im Ersten Affiliated Hospital der China Medical University gefolgt. Die Gruppe bestand aus 194 Männern und 70 Frauen mit einem mittleren Alter von 59 (Bereich 29-81) Jahre. Keiner der Patienten unterzog sich einer Chemotherapie oder Strahlentherapie vor der Operation. Follow-up-Daten wurden von allen Patienten gesammelt.

Ethik Statement

Ethische Genehmigung für diese Forschung wurde von der Forschungsethikkommission der China Medical University, China erhalten. Alle Patienten Tumorgewebe sowie normale Magen-Gewebeproben Bereitstellung unterzeichnet, eine Einverständniserklärung vor der chirurgischen Entfernung des Magenkarzinom zu ermöglichen diese Forschung durchgeführt werden. Alle der Tierstudie Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden nach den institutionellen ethischen Richtlinien durchgeführt. (: SCXK [Hu] 2003-0003 auch als Shanghai CAS, Zertifikat-Nummer bekannt) Diese Versuchstiere wurden aus Shanghai Branch Center, Institut für Labortierkunde, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften erworben. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Use Committee in China Medical University, Shenyang, China genehmigt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, Leiden zu minimieren.

Gewebeproben und Pathologie

Alle Patienten stammenden Paraffin Magenkrebs Proben eingebettet (n = 264) und ihre ausgeglichenen NNM Proben (2 cm vom Karzinom n = 209) wurden von chirurgischen Resektion gesammelt und archiviert unter der Institutional Review Boards des Ersten Affiliated Hospital China Medical University genehmigten Protokollen. Frisches Magenkarzinom und benachbarte NNM wurden in -80 ° C bis zur Proteinextraktion durch Homogenisierung in RIPA Lysepuffer gesammelt und eingefroren. Die histologische Diagnose und anderen mikroskopischen Eigenschaften wurden für jede Magenkarzinom durch Pathologen und die TNM-Staging bestätigt wurde nach der Union International contre le Cancer (UICC) -System für das Ausmaß der Tumorausbreitung bewertet. Die histologische Architektur des Magenkarzinoms wurde in Lauren-Klassifikation und der Weltgesundheitsorganisation (WHO) Klassifikation ausgedrückt. Darüber hinaus Tumorgröße, Tiefe der Invasion, und lymphatischen bestimmt.

Zelllinien und Kultur

Die menschliche Zelle Magenkrebs Linien MKN28 (gut differenziert), AGS, SGC-7901 (mäßig differenzierten ), MGC803 (schlecht differenziert) und der normalen menschlichen Magen-Zelllinie GES-1 aus der Zellbank der chinesischen Akademie der Wissenschaften erworben. Fünf Zellinien wurden gehalten in RPMI 1640 (Hyclone, Logan City, USA), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Alle Zelllinien wurden in einem 5% CO _{2 befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C.}

Tissue Microarray (TMA) und Immunhistochemie

Repräsentative Bereiche von soliden Tumoren und benachbarten NNM wurden identifiziert in HE-gefärbten Schnitten der ausgewählten Fälle und eine 1,5-mm-Durchmesser Gewebekern pro Spenderblock wurde gestanzt und mit maximal 200 an einen Empfänger Block übertragen (10 × 20) Kerne mit einer 1,5-mm-Durchmesser Stanzinstrument. Nach der erneuten geschmolzen, Abschnitte (4 &mgr; m dick) aus jedem Gewebe Microarray-Block geschnitten nacheinander wurden die Färbung Er wurde am TMA zur Bestätigung der Tumor und Mukosa-Gewebe durchgeführt. Immunhistochemische Analyse auf TMA Abschnitte durchgeführt wurde, Pressure cooker vermittelte Antigen-Retrieval wurde in Citratpuffer (pH 6,0) für 10 min durchgeführt. Schnitte wurden mit 1:300 Verdünnung von LDH-A (Muskeluntereinheit) Kaninchen-monoklonalem Antikörper (Epitomics) über Nacht bei 4ºC inkubiert und dann mit Ziegen-anti-Maus- oder anti-Kaninchen-Envision System Plus-HRP (Dako Cytomation) inkubiert 30 min bei Raumtemperatur. Nach dreimaligem Spülen in PBS für 10 min jeweils, wurden die Schnitte mit DAB inkubiert für 1 min, gegengefärbt mit Hämatoxylin Mayer, dehydratisiert, geklärt und montiert. Weglassen des primären Antikörpers wurde als negative Kontrolle verwendet.

Western Blot Analyse

Proteine ​​Konzentrationen von Proben aus Gewebeproben extrahiert und Zelllinien unter Verwendung von Radioimmunfällungsassay Lysepuffer wurden unter Verwendung von Bradford-Reagenz bestimmt ( Sigma) gemß den Anweisungen des Herstellers. Denaturierte Protein wurde auf einem Natriumdodecylsulfat (SDS) -Polyacrylamid-Gel (10% Acrylamid) und an Polyvinylidenfluorid-Membranen (Millipore, Bedford, MA) abgetrennt, die dann in 5% fettfreie Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung blockiert wurde (pH 7,5). Für Immunoblotting wurde die Membran über Nacht mit LDH-A (Muskeluntereinheit) Kaninchen-monoklonalem Antikörper (1:1500) (Epitomics) bei 4 ° C inkubiert. Dann wurde es durch TBST gespült und mit Sekundärantikörper für 15 Minuten inkubiert. Die Signale wurden durch verstärkte Chemilumineszenz nachgewiesen (Pierce, Rockford, IL).

Follow-up nach der Operation

Die 264 Patienten, die gastroctomy unterzog wurden einer klinischen Beobachtung zu schließen, einschließlich Brust- /Bauch /Becken Computertomographie (CT) Bildgebung, CEA Ebene und Bluttests bei 2 bis 3 Monats-Intervallen und eine jährliche Gastroskopie. Follow-up war in Übereinstimmung mit National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Practice Guidelines in Magenkrebs. Das Gesamtüberleben (OS) Rate wurde als das Intervall von der ersten Operation in den Tod definiert. Das Enddatum des Follow-up-Studie für die Durchführung der Analyse war der 29. Juni 2012.

Evaluierung von immunhistochemischen Färbung

Die Immunreaktivität wurde von zwei Forschern unabhängig bewertet, die Patienten Ergebnis geblendet wurden. Die Auswertung wurde auf der Färbungsintensität basiert. Färbeintensität für LDH-A wurde als 0 (negativ) erzielt; 1 (schwach); 2 (mäßig); und 3 (stark). Die Proben wurden in zwei Gruppen eingeteilt nach ihren Noten: 0 und 1 sind niedrige Expression-Gruppe; 2 und 3 sind eine hohe Expression Gruppe. Im Falle einer Diskrepanz in Scoring wurden die Objektträger von beiden Pathologen unter dem Mikroskop überprüft.

Generation von small interfering (si) RNA Sturz stabilen Zelllinien

Auf der Grundlage der LDH 5'-ATCCAGTGGATATCTTGACCTACG TGGCT-3 'wurde die Nucleotidsequenz des inserierten ShLDH-A: -A-Sequenz wurde unter Verwendung von shRNA siRNA Ziel Finder (Ambion) ausgelegt. Die Zelllinie, die durch Zellen, die mit Plasmid verwürfelten Infizieren wurde als Kontrolle verwendet. 10 ug shRNA und 25 &mgr; l Lipofectamin 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) wurden gemischt, zusammen mit 1350 &mgr; l RPMI-1640-Medium (ohne FBS), und dann wurde die Mischung in MGC-803 Magenkrebs-Zellen transfiziert. Das Gemisch wurde in einen 25-cm ^{2 Kulturflasche, die mit 1 × 10 zuvor plattiert wurde 6 MGC-803 Magenkrebszellen. Das Kulturmedium wurde mit vollständigem RPMI-1640-Medium 6 h nach der Beimpfung und nach 28 h nach der Transfektion, stabile Zellklone ersetzt wurden für 2 Wochen mit Neomycin und analysiert durch Immunoblotting ausgewählt.}

RNA Extraktion und quantitative Echtzeit RT-PCR-Analyse

Gesamt-RNA aus Zellen isoliert wurde unter Verwendung von TRIzol Reagens gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen) und 1 &mgr; g RNA wurde direkt an cDNA verarbeitet unter Verwendung eines Reverse-Transcription Kit (Promega, Madison, Wisconsin), nach den Anweisungen des Herstellers. Amplifikationsreaktionen wurden in einem 20 ul-Volumen mit 0,2 ul SYBR Green (Bio-Rad, Hercules, California) durchgeführt. Diese Reaktionen wurden dreifach unter Verwendung eines BioRad iCycler (Bio-Rad) durchgeführt. ß-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Die verwendeten Primer waren wie folgt: LDH-A, 5'-CTCCTGTGCAAAATGGCAAC-3 '(vorwärts) und 5'-CCTAGAGCTCACTAGTCACAG-5' (rückwärts); andβ-Actin, 5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 '(vorwärts) und 5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3' (rückwärts). Die Spezifität der quantitativen Echtzeit-PCR wurde durch Schmelzkurvenanalyse und Agarosegelelektrophorese verifiziert.

MTT und Koloniebildungstest

für das Zellwachstum Analyse, eine gleiche Anzahl von Zellen in 48 ausgesät -well Platten. Die Gesamtzahl der Zellen wurde nach jeden Tag durch den MTT-Assay gemessen Protokoll des Herstellers (Roche Applied Science). Für die Koloniebildung Analyse wurden in dreifacher Ausfertigung ausgesät in 60 mm Kulturschale gleiche Anzahl von Kontrollzellen und Zellen die Expression von LDH-A zum Schweigen zu bringen. Zellen für 7 Tage kultiviert wurden, Zellwachstum wurde nach 7 Tagen in Kultur gestoppt, indem das Medium entfernt und 0,5% Kristallviolett-Lösung in 20% Methanol-Zugabe. Nach Anfärbung für 5 min wurden die fixierten Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), fotografiert und gelöst und mit 1% SDS gewaschen. Die Anzahl der Kolonien in jeder Gruppe gezählt.

Tumorigenität Assay

Die MGC-803 GC-Zellen Xenotransplantate auf 6-Wochen alte weibliche athymische Nacktmäuse (Vital River Laboratories, Beijing produziert wurden, China) durch Injektion von 5 x 10 ^{6 Zellen in 0,2 ml PBS in die Flanke jeder Maus (6 Mäuse /Gruppe). Die Tumorbildung wurde jede Woche bewertet. Das Tumorvolumen wurde berechnet nach der Formel: v. (Mm 3) = a × b 2/2 (wobei a die größte oberflächlichen Durchmesser und b ist der kleinste Durchmesser oberflächlicher)}

die Messung der Laktatkonzentration und die ATP-Produktion

Nach 48 Stunden Inkubation, Lactat und ATP-Spiegel in den Kulturmedien wurden gemessen, im Handel erhältlichen Test-Kits (erworben von BioVision [Mountain View, Kalifornien] und Roche Applied Science , beziehungsweise). Die Ergebnisse wurden für die endgültige Zellzahl Zahl korrigiert.

Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen mit Hilfe der SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) durchgeführt wurden. Die Gesamtüberlebensraten wurden mit der Kaplan-Meier-Schätzer bestimmt, ein Ereignis wie der Tod für krebsbedingte Ursache definiert. Der Log-Rank-Test wurde verwendet, um Unterschiede zwischen den Überlebenskurven zu identifizieren. In univariaten Analyse, two-tailed χ ^{2 Tests oder zweiseitigen t-Test für statistische Vergleiche verwendet wurden. Und Proportional-Hazard-Modell Cox wurde in univariaten Analyse und multivariate Analyse, die wesentlichen Faktoren mit der Prognose korreliert zu identifizieren. Für alle Analysen, nur P-Werte. ≪ 0,05 wurden als signifikant betrachtet}

Ergebnisse |

LDH-A Expression in menschlichen Magenkarzinomgewebe

Wir gefärbten Schnitten von TMAs von GC abgestuft und NNM Gewebekerne für ihre zytoplasmatischen immunhistochemischen Färbeintensität gegen LDH-A-Protein. Die lesbaren Proben enthielten 264 Magenkarzinom und 209 angepasst NNM. Die typische diffuse cytoplasmatische Anfärbung des Proteins kann in vielen Magenkarzinom und normalem Magengewebe gefunden werden, wie in Abbildung 1, Krebsgewebe gezeigt, zeigten positive zytoplasmatische Färbung auf 201 Fällen (76,14%), während bei 209 Fällen von NNM, 131 Fällen ( 62,68%) hatten LDH-A-positiven Ausdruck (Tabelle 1). Um die Expressionsmenge von LDH-A in GC-Proben, die Expression von LDH-A untersuchen, wurde durch Western-Blot-Analyse in sieben zufällig ausgewählte Tumoren und den paarigen normalen Geweben untersucht. Hochregulierung von LDH-A wurde in GC-Proben im Vergleich mit den zusammengepaßten normalen Geweben (Fig. 2a) beobachtet. Diese Studien zeigten, daß LDH-A signifikant in Krebsproben hochreguliert wurde, im Vergleich zu benachbarten, nicht kanzerösen Gewebe (Tabelle 1 p = 0,002).

Expressionsanalyse von LDH-A in Gastric Zellinien

Western-Blot-Analyse wurde in Magen-Zelllinien durchgeführt. Der Western-Blot zeigte, dass die Expression des LDH-A in schlecht differenzierten MGC803 signifikant stark war und mäßig AGS differenziert; mäßig differenzierten SGC-7901 schwach und gut MKN28 differenziert; und abwesend in normalen menschlichen Magen-Zelllinie GES-1 (Abb. 2 b).

Clinicopathological Variablen in 264 Fälle von Magenkarzinom

Wie in Tabelle 2 zusammengefasst, fanden wir, dass die erhöhte Expression von LDH-A war signifikant mit dem Alter der Patienten (P = 0,004) und histologischen Typ (P = 0,02), Lymphknotenmetastasen (P = 0,043) verbunden, aber nicht mit dem Geschlecht (P = 0,072), die Tumorgröße (P = 0,086) , Tiefe der Invasion (P = 0,328), Lymph-Invasion (P = 0,738), Lauren Klasse (P = 0,152) oder TNM-Stadium (p = 0,417).

Überlebensanalyse

Die 5 -Jahr OS Rate der 264 Patienten mit primären Magenkrebs betrug 46% (122/264), mit 142 Todesfälle während des Follow-up-Periode beobachtet. Die mittlere Dauer des Follow-up betrug 50 Monate (Bereich: 9-78 Monate). Survival-Analyse von Kaplan-Meier-Überlebenskurve und Log-Rank-Test zeigte, dass Patienten mit einer hohen Expression von LDH-A im Tumorgewebe hatte eine deutlich schlechtere Gesamtüberlebenszeit als Patienten mit Tumor niedrigen LDH-A-Expression (p < 0,001; Abb. 3) . Mit dem Ziel, das Potenzial Beziehung zwischen der Expression von LDH-A zu erkunden und die Prognose in verschiedenen Arten von GC, untersuchten wir das Überleben der Patienten in verschiedenen Untergruppen: Bei der statistischen Analyse wurde von Lauren Grad geschichtet und histologischen Klassifikation, erschien Bedeutung diffusen Typ GC und GC undifferenzierten Typ (P < 0,001), aber nicht in intestinal (P = 0,179) oder differenziert (P = 0,104) diejenigen. Multivariate Analyse wurde mit dem Cox-Proportional-Hazards-Modell für alle wesentlichen Variablen in der univariaten Analyse durchgeführt. Tabelle 3 zeigt die Bedeutung: Bereinigt um andere Kovariaten, die Ergebnisse der multivariaten Analyse zeigte, dass LDH-A Expression (p < 0,001), Lymph-Invasion (P = 0,046) und Lauren Klasse (P = 0,001), TNM-Stadium (p = 0,006), aber nicht das Alter (p = 0,053), die Tumorgröße (P = 0,111), der Tiefe der Invasion (P = 0,598), Lymphknotenmetastasen (P = 0,089) oder histologischen Typ (P = 0,674) wurden prognostische unabhängige Risikofaktoren für OS (Tabelle 3).

Preissturz von LDH-A durch siRNA reduziert die Expression von LDH-A in MGC-803

nach den Western-Blot-Ergebnisse und real-time RT -PCR, die Expression von LDH-A vermindert effektiv in der LDH-A-siRNA MGC-803-Zellen exprimiert. Wie in 4 gezeigt ist, die Expression von LDH-A-Proteins durch Western-Blot untersucht war kaum detektierbar, und die PKM2 mRNA-Ebene wurde in der LDH-A-siRNA exprimierenden MGC-803-Zellen um 74% reduziert. LDH-A-Expression blieb unverändert in beiden GC-Zelllinien und Zelllinien eine Steuerung zum Ausdruck siRNA.

Preissturz von LDH-A hemmte das Wachstum von GC-Zelllinien MGC-803

Tumor Zur Beurteilung Zellwachstum, verwendeten wir MTT und Koloniebildungstests. In dem MTT-Assay, um die Expression von LDH-A-Silencing, die Proliferation von MGC-803-Zellen hemmte (Fig. 5a, b). Das Wachstum der MGC-803-Zellen, die LDH-A siRNA verringerte sich um 64%, nach 168-stündiger Inkubation im Vergleich mit derjenigen der Kontrollzellen (P < 0,05). Konsequent, schwächte die Expression von LDH-A zum Schweigen zu bringen, die Verankerung-unabhängiges Wachstum von MGC-803-Zellen (Abb. 5c, d). LDH-A Zuschlag in diesen Zellen die Koloniebildung verhindert, was darauf hinweist, dass die adhärenten Wachstum wiederhergestellt wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, weiter die onkogene Rolle von LDH-A in GC-Krebs.

Preissturz von LDHA hemmte die Tumorigenität in Xenograft Mausmodelle

In dieser Studie haben wir die tumorigenen Kapazität von LDH-A geprüft in vivo. Die Tumorigenität in vivo von MGC-803 siLDH-A-Zellen und Kontrollzellen wurde durch sc Injektion von Zellen in athymischen Nacktmäusen untersucht. In Übereinstimmung mit den in-vitro-Studien, schwächte die Expression von LDH-A-Silencing dramatisch die Tumorigenität von LDH-A-Zellen in der Tumorgröße. Für alle abgestimmt Xenotransplantate wurden siLDH-A-Tumoren signifikant kleiner als die der Kontrollgruppe (Abb. 5e, f).

Preissturz von LDH-A durch siRNA Reduziert Laktat und die ATP-Produktion in humanen Zelllinien GC MGC- 803

Da LDH-A das Schlüsselenzym ist Pyruvat in Lactat für die Transformation, Veränderung seiner Expression in GC-Zellen sollten Laktatproduktion und Energiestoffwechsel beeinflussen. Um diese Hypothese zu testen, haben wir verglichen Lactat und ATP-Produktion zwischen LDH-A siRNA Knockdown-Zellen und Kontrollzellen nach einer 48-stündigen Inkubation. Wenn LDH-A wurde von siRNA, die Fähigkeit der Zelle, Lactat produzieren umgeworfen und wurde ATP um 61,5% und 63,3% bei 48 Stunden drastisch verringert, bzw. (Fig. 6a, b).

Diskussion

In den 1920er Jahren zeigte Warburg zunächst, dass Krebszellen nehmen höhere Glucoseraten als normale Zellen und produzieren Energie fast durch aerobe Glykolyse für ihre Energiebedarf Umweltauflagen anzupassen wie die intermittierende Hypoxie [10], [11]. Jedoch ist dieses Stoffwechseländerung nicht nur eine Anpassung an eine hypoxische Umgebung jedoch ist eine aktive zelluläre Strategie, die einen deutlichen Vorteil für die Proliferation und malignen Erkrankungen verleiht. Jetzt Vegran et al
. [12] haben berichtet, dass Laktat direkt den Phänotyp von Endothelzellen modulieren kann, was möglicherweise einen wichtigen Mechanismus darstellt, durch die Tumore ihre eigene Blutversorgung über vaskuläre Morphogenese steuern. Weil reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Nebenprodukte der mitochondrialen Atmung natürlich sind, ist vorgeschlagen worden, dass die Umwandlung von Glukose zu Laktat Krebszellen vor oxidativer Beanspruchung schützen können [13]. Vor kurzem Ergebnisse deuten darauf hin, dass in Krebszellen normale oxidative Phosphorylierung Wiederherstellung kann nicht nur das Zellwachstum und Proliferation hemmen, sondern auch die metastatischen Kapazität von malignen Zellen beeinträchtigt [14]. Daher hat die Bedeutung von konstitutiv hochreguliert aerobe Glykolyse kürzlich in Tumorprogressions erkannt worden, aber die molekularen Mechanismen dieser Phänotyp führt und ihre Beiträge zu der Entwicklung von Krebs sind nicht gut verstanden.

LDH-A, das Enzym, verantwortlich für die Pyruvat in Lactat Transformation spielt eine wichtige Rolle im Prozess der Glykolyse. Mehrere Studien haben berichtet, dass die Expression von LDH-A durch eine Reihe von Onkogenen, [15] ausgelöst werden könnte. Diese Berichte unterstützen die Idee, dass LDH-A Induktion für die onkogene Aktivität dieser Onkogene in Krebszellen entscheidend ist.

Die onkogene Aktivität von LDH-A hat in Ösophaguskarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Magenkrebszellen berichtet [ ,,,0],8], [9], [16]. Yongjie Zhang et al
. berichtet, dass LDH-A Reduktion der Tumorigenität von Magenkrebs (ITGC) Zellen Darm-Typ durch Herunterregulieren Oct4 [17] unterdrücken kann. Und Zhiyu Wang et al
. berichtet, dass LDH-A-Silencing Brustkrebs tumorigenicity durch Induktion von oxidativem Stress vermittelte mitochondriale Weg Apoptose [18] unterdrückt. Hier untersuchten wir in Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorgewebe von 264 Patienten für die Expression von LDH-A und berichteten über die Charakterisierung von LDH-A-Expression in humanen GC und präsentieren ihre Korrelation mit klinischen Parametern und Patienten Prognose. Erstens fanden wir, dass die Expression von LDH-A in GC-Proben im Vergleich mit den angepassten normalen Geweben erhöht wurde. Dieses Ergebnis kann mit früheren Studie konsistent sein, dass bei verschiedenen Arten von Krebserkrankungen des Menschen, wurde die Expression von LDH-A hochreguliert [4], [5]. Im Tumorgewebe, unsere Studie zeigte, dass LDH-A-Expression stark mit GC klinisch-pathologische Merkmale korreliert: Alter, Lymphknotenmetastasen und histologischen Klassifikation. So schlagen wir vor, dass die hochreguliert LDH-A-Expression auf die Proliferation und die Entwicklung von GCs beitragen können. Zweitens haben wir analysiert weiterhin die prognostische Bedeutung von LDH-A auf das Gesamtüberleben von Patienten mit GC. Kaplan-Meier-Analyse zeigte eine signifikante Assoziation zwischen LDH-A-Expression und das Gesamtüberleben von Patienten und Patienten mit stärkeren LDH-A-Färbung hatte eine geringere Überlebensrate. Wenn die statistische Analyse geschichtet wurde durchgeführt von Lauren Grad und histologischen Klassifikation, erschien Bedeutung in diffusen Typ GC und undifferenzierten Typ GC, aber nicht in Darm oder differenzierten. Spezifische siRNA gegen LDH-A wurde in MGC803 Zellen und verzögerte Zellwachstum sowohl in vitro als auch in Maus-Modellen durchgeführt. LDH-A Zuschlags auch Laktat und die ATP-Produktion in GC-Zellen reduziert. Daher legen unsere Ergebnisse nahe, dass die Expression von LDH-A ein unabhängig prognostischer Faktor von OS war, und darauf hingewiesen, dass LDH-A könnte eine onkogene Rolle bei der Tumorentstehung, vor allem in diffusen Typ GC oder undifferenzierten Typ GC-Patienten. In Übereinstimmung mit unserer Studie wurde berichtet, dass die Expression von LDH-A in humanen hepatozellulären Karzinom-Zellen umzuwerfen konnte Apoptose [8], und Herabregulation von LDH-A induzieren könnte die Produktion von ROS und cytosolischen Ca2 + Signal erhöhen, was die verringerte inneren Mitochondrienmembranpotential und in hepatozellulären Karzinomzellen zur Freisetzung von Cytochrom C geführt.

zusammen~~POS=TRUNC unsere Studie zeigt, dass die Expression von LDH-A hochreguliert Magenkrebszellen mit Wachstumsvorteile bietet. Zur gleichen Zeit, unsere Studie legt nahe, LDH-A als potentielles therapeutisches Ziel.

• PLoS ONE: Erhöhte MicroRNA-630 Expression in Magenkrebs ist im Zusammenhang mit schlechten Gesamt Survival
• PLoS ONE: Die Wirkung von Einzel- und Neighborhood sozio-ökonomischen Status auf Magenkrebs Survival