PLoS ONE: Zic1 Promoottori hypermetylaation Plasma DNA on mahdollinen biomarkkereiden mahasyövän ja epiteelinsisäisen Neoplasia

tiivistelmä

Mahasyöpää (GC) on yksi yleisimmistä ruoansulatuskanavan syövät maailmanlaajuisesti; mutta useimmat potilaat esittää myöhäisessä vaiheessa alkudiagnoosin. Zic1
on uusi ehdokas tuumorisuppressorigeeniä joka on epigeneettiseltä vaiennetaan GC. Tässä tutkimuksessa selvitettiin Zic1
promoottori metylaatio plasman DNA uutena molekulaarinen merkkiaine varhaistoteamiseen ja seurantaan GC. Metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio (MSP) määritys suoritettiin havaitsemiseksi Zic1
promoottorin metylaation plasmassa DNA 20 terveillä koehenkilöillä, 50 mahalaukun intraepiteliaalinen neoplasia potilailla, ja 104 GC potilailla. Zic1
promoottori metylaation korko plasmassa näytteitä terveitä kontrolliryhmässä oli 0%, mutta se saavutti 54,0% vuonna intraepiteliaalisten neoplasia ryhmässä ja 60,6% GC ryhmässä. Jälkimmäiset kaksi arvot olivat merkittävästi korkeampia kuin verrattuna terveiden kontrolliryhmässä (p < 0,05), 100% spesifisyys intraepiteliaalisten neoplasia ja GC diagnoosi. Positiivinen ennustearvo plasman Zic1
promoottori metylaation diagnosoimiseksi intraepiteliaalisten neoplasian ja GC oli 100%. Metylaatiostatuksen GC ryhmässä ei merkittävästi liittynyt kasvaimen koko, kasvain eriyttäminen, imusolmuke etäpesäke, TNM pysähdyspaikan tai kasvaimen invaasio (p > 0,05). Arviointi merkitys havaitsemisen Karsinogeenisyys alkion antigeeni (CEA) taso ja Zic1
promoottori metylaatio hinnan GC diagnoosi paljasti, että herkkyys Zic1
promoottori metylaatio oli huomattavasti korkeampi kuin CEA tasoa markkerina ja että yhdistetty mittaus nämä kaksi indeksiä (rinnakkaistestaus) parantunut herkkyys. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että Zic1
promoottori metylaatio kurssi plasmapohjaista DNA on suuri merkitys varhaiseen seulontaan GC ja seurannan kasvaimen. Zic1
promoottori metylaatio voi toimia uutena ei-invasiivisia plasma biomarkkeri varhaisen havaitsemisen GC ja riskinarvioinnin riskiryhmien. Yhdistetty mittaus Zic1
promoottori metylaatio korko ja CEA tasolla (rinnakkainen testaus) voi laajentaa nykyistä suuntaviivat varhainen diagnosointi GC.

Citation: Chen X, Lin Z, Xue M , Si J, Chen S (2015) Zic1
Promoottori hypermetylaation Plasma DNA on mahdollinen biomarkkereiden mahasyövän ja epiteelinsisäisen neoplasian. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10,1371 /journal.pone.0133906

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 02 heinäkuu 2015; Julkaistu: 24 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoittaa National Natural Science Foundation of China (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang Provincial Lääketieteen ja terveydenhuollon yleinen tutkimussuunnitelma (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiangin maakunnan opetusministeriö tutkimussuunnitelma (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn), ja Zhejiangin maakunnassa avain tieteen ja teknologian innovaatioiden joukkue (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). Rahoittajan Shujie Chen suunniteltu ja kokeet tähän käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yksi yleisimmistä ruoansulatuskanavan syövät ja kolmas johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Valtaosa GC potilaista läsnä edennyt pitkälle alkuperäisen diagnoosin. Maailmanlaajuisesti GC kattaa lähes 952000 uutta tapausta vuosittain mukaan Globocan 2012 [2]. Japanissa 5 vuoden pysyvyys varhaisen GC (EGC) on 86% verrattuna 32%: kokeneille GC ilmoituksen mukaan Yhdysvaltojen näkijä ohjelman [3].

Aberrant DNA: n metylaatio on tärkeä epigenetic muutos ja varhainen tapahtuma karsinogeneesissä [4]. Viime aikoina useita tuumorisuppressorigeeneille (APT), mukaan lukien FAM5C
, MYLK
, p16
ja E-kadheriinin
, on raportoitu olevan metyloitu seerumissa /plasma GC potilaista [5-7]. Lisäksi hypermetylaatiota APT pyrkii parannettu etenemistä syövän esiasteista [8-9]. Siksi havaitseminen metyloitua DNA seerumin /plasman voi olla yksi lupaava lähestymistapa varhaiseen toteamiseen GC. Epiteelinsisäisen neoplasia (IN) on mahdollisesti precancerous vaurio, joka antaa suuri vaara GC; Näin, seulonta potilailla on ratkaisevaa diagnoosia ja ennustamista GC. Muutamia raportteja hypermetyloitunut DNA analyysit verinäytettä mahalaukun intraepiteliaalisten neoplasia (GIN) potilaat ovat käytettävissä tasalla.

Kasvava näyttö osoittaa, että Zic1
( Zic
perheenjäsen 1 , pariton-pariksi Drosophila homologi) osallistuu etenemistä useiden syöpien [10-13]. Olemme aikaisemmin havainneet, että Zic1
, uusi TSG, hiljenee kautta promoottori hypermetylaation sekä GC-soluissa ja kudoksissa [14]. Olemme myös osoittaneet, että Zic1
osallistuu estoon GC solujen eloonjäämistä ja heikentynyt solumigraation [15].

Tässä tutkimuksessa määritimme varhaisdiagnostiikan ja ennakoivan potentiaaleja Zic1
hypermetylaation plasmassa GC potilailla. Mittasimme promoottori metylaatiostatuksen Zic1
plasmassa potilailla, joilla GC tai Gin ja normaali kontrolli (NC) aiheita. Yhdistys Zic1
promoottori metylaatio kliinis parametreja arvioitiin myös. Lisäksi olemme luokiteltu laadukkaat IN ja T1 GC EGC ja sijoitti GC ja GIN potilaiden GC plus ryhmässä (GPI). Sitten olemme analysoineet Zic1
hypermetylaation hinnat sekä EGC ja GPI ryhmiä. Edelleen yhdistetty arviointi Karsinogeenisyys alkion antigeeni (CEA) taso ja Zic1
promoottori metylaatio GC diagnoosia arvioitiin käyttäen plasmaa GC ja GIN potilaita.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Plasmanäytteitä otettiin ennen leikkausta Sir Run Run Shaw sairaala, Hangzhou, Zhejiang, Kiina, marraskuu 2012 huhtikuu 2015. Kaikki potilaat mukana tutkimuksessamme kävi gastroendoscopy ja ryhmiteltiin mukaan histopatologia diagnoosin. Plasma kerättiin GC ja GIN potilaita joilla ei ollut parantavia hoitoja, kuten kemoterapiaa, sädehoitoa, ja kirurginen resektio. Poissulkukriteerit mukana ruoansulatuskanavan sairauksien muiden syiden ja tauteja muissa elimissä. Potilaat, joilla on mahalaukun etäpesäkkeitä muista kasvaimista olivat myös ulkopuolelle.

numeroitu näytteiden mukaan siinä järjestyksessä, jossa ne on kerätty ja sitten suoritetaan metylaatiospesifistä polymeraasiketjureaktio (MSP) arvioimaan näytteet numerojärjestyksessä. Näytteet edelleen ryhmitelty patologian tuloksia. Plasma kerättiin 104 GC potilasta, joiden keski-ikä 59,8 vuotta, jotka oli diagnosoitu mukaan Maailman terveysjärjestön kriteerien [16]. Viisikymmentä GIN potilasta, joiden keski-ikä 58,0 vuotta todettiin gastroskopialla. Verinäytteet kerättiin myös 20 tervettä vapaaehtoista NC ryhmässä joiden keski-ikä on 38,5 vuotta.

Ethics selvitys

Hanke sai hyväksynnän Clinical Research eettisen komitean instituutin gastroenterologian Zhejiangin yliopistossa. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ennen näytteen keräämistä. Yksilöt, jotka osallistuivat tähän tutkimukseen antoi kirjallisen tietoisen suostumuksen (kuten hahmoteltu PLoS
suostumuslomake) julkaista nämä runko-osat.

DNA eristys ja bisulfiittimodifikaatio

DNA uutettiin plasmanäytteistä käyttäen QIAamp DNA Veri Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). DNA-konsentraatiot mitattiin spektroskopialla aallonpituudella 260 nm. DNA oli bisulfiitti-käsitelty Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA). Modifioitu DNA säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

MSP määrityksissä

Zic1
promoottorin metylaation tutkittiin suorittamalla MSP määritystä, jossa käytetään edellä mainittua bisulfiitti-modifioitu ilmaiseksi plasma DNA templaattina. MSP suoritettiin 40 sykliä lämpökäsittelylämpötilaan 56 ° C, kuten aikaisemmin on kuvattu [14]. Metylointi alukkeet olivat ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) ja ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG), ja metyloitumattomat alukkeilla olivat ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) ja ZIC1-UR (5' CCCATTAACCACATTAAACA). PCR-protokolla mukana alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 56 ° C: ssa 40 s, alukkeen pidennys 72 ° C: ssa 40 s, ja lopullinen laajennus 72 ° C: ssa 7 min. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesissa 1,5% agaroosigeeleillä, värjättiin Gel Red, ja visualisoitiin UV valaistus.

Serum CEA testaus

Seerumi näytteet lähetettiin kliiniseen laboratorioon Sir Run Run Shaw Hospital for testaus, ja CEA pitoisuus > 5 ng /ml pidettiin epänormaalia.

Tilastolliset analyysit

metylaatio taajuudet ja CEA tasot plasmassa näytteitä verrattiin käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä. Yhdistys välinen kliinis ominaisuuksien ja DNA hypermetylaation analysoitiin käyttäen chi-neliö testi. Diagnostinen arvo yhdistelmän Zic1
promoottori metylaation ja plasman CEA taso oli arvioitu viljelyala vastaanotin toimii ominaiskäyrä (AUC). Herkkyys, spesifisyys, sekä positiiviset ja negatiiviset ennustearvot Patologiassa laskettiin 95%: n luottamusväli Zic1
promoottori metylaatio tai Zic1
promoottori metylaatio yhdistettynä CEA tasolla. Positiiviset ja negatiiviset todennäköisyys tunnusluvut laskettiin myös. Kaikista testeistä, cut-off-arvo p < 0,05: ää käytettiin määrittämään tilastollista merkittävyyttä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 19.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL).

Tulokset

Metylointi tila plasmassa

arvioimiseksi muutoksia Zic1
promoottori metylaatio GC, ensin havainnut metylaatiostatuksen tämän promoottorin 104 potilasta GC, 50 gini, 31 kanssa EGC ja 20 NCS ja suorittaa vertailuja ryhmien kesken. Metylointi hinnat Zic1
promoottori plasmassa näytteet olivat 0% NC ryhmässä (0%), kasvaen 54,0% vuoden GIN ryhmässä ja 60,6% GC (p < 0,001 sekä GIN ja GC vs. NC), jossa on 100% spesifisyys GPI diagnoosi (20/20) (kuvio 1). Positiivinen ja negatiivinen ennustava arvoja ja positiiviset ja negatiiviset todennäköisyys tunnusluvut diagnosoimiseksi IN ja GC oli 100% (90/90), 23,8% (20/84), ääretön ja 0,42, tässä järjestyksessä. Edustavia MSP määrityksen tulokset Zic1
promoottori metylaatio on esitetty kuvassa 2.

Association of kliinis ominaisuuksia Zic1
promoottori metylaation plasmassa GC potilaiden

sitten korreloi kliinis kanssa Zic1
promoottori metylaation korko plasmassa GC potilaiden tunnistaa mahdolliset yhdistyksille. Tulokset paljastivat ole merkittyjä assosiaatioita Zic1
promoottori metylaation määrä ja kliinisten parametrien, kuten kasvaimen koko, erilaistuminen laatu, imusolmuke tila, kasvaimen invaasio syvyys ja TNM-luokitus (p > 0,05) (taulukko 1) .

yhdistettyyn määrittäminen Zic1
hypermetylaation ja CEA tasolla

merkitys yhdistetyn määrittäminen Zic1
hypermetylaation korko ja CEA tasolla toteaminen ja varhainen ennustaminen GC analysoitiin. Mittasimme CEA taso 9 NCS, 24 GIN potilasta ja 71 GC potilasta ennen hoitoa. Herkkyyden CEA tason GC, IN, ja EGC ryhmät olivat 22,5% (16/71), 16,7% (4/24) ja 10,5% (2/19), tässä järjestyksessä. Kaikki 3 ryhmien, herkkyys Zic1
promoottorin metylaation oli merkittävästi korkeampi kuin CEA tason (p < 0,05).

yhdistetyn määrittämisen Zic1
hypermetylaation ja CEA tasolla GC ryhmässä.

GC ryhmässä, herkkyys ja spesifisyys yhdistetyn määrittäminen Zic1
promoottori metylaation määrä ja CEA taso (tandem testaus) oli 16,9 % ja 90,9%, vastaavasti (taulukko 2). Herkkyys yhdistetty analyysi näiden kahden parametrin (rinnakkainen testaus) oli 69,0% (taulukko 2), joka oli suurempi kuin herkkyydet saavutetaan testaamalla joko parametrin yksin. ROC-käyrä analyysi tehtiin merkityksen arvioimiseksi DNA metylaation määrä ja CEA tasolla GC diagnoosia. AUC Zic1
promoottori metylaatio testaus yksinään oli 0,610 (S1 kuvio) ja että yhdistetylle arviointia Zic1
promoottori metylaation ja CEA taso (tandem testaus) oli 0,539 (S2 kuvassa) . Erityisesti kun Zic1
promoottori metylaation ja CEA taso määritettiin rinnakkain, AUC kasvoi 0,633 (kuva 3). Perustuen edellä esitetyt tulokset, yhdistetyn määrittäminen Zic1
promoottori metylaatio korko ja CEA tasolla (rinnakkainen testaus) GC diagnoosi havaittiin olevan synergistinen käyttöön verrattuna kunkin menetelmän yksin.

yhdistetty määrittäminen Zic1
hypermetylaation ja CEA tasolla GPI ryhmässä.

GPI ryhmässä, herkkyys ja spesifisyys yhdistetyn määrittäminen Zic1
promoottori metylaatio rate ja CEA taso (tandem testaus) oli 15,8% ja 100,0% (taulukko 3). Yhdistetty arviointi näitä kahta muuttujaa (rinnakkaistestaus) oli korkein herkkyys 65,3%, positiivinen ennustearvo saavuttaa 98,4% (taulukko 3). ROC-käyrä analyysi tehtiin merkityksen arvioimiseksi DNA metylaation määrä ja CEA tasolla GPI diagnoosia. AUC Zic1
promoottori metylaatio testaus yksinään oli 0,792 (S3 kuvassa), ja että yhdistetylle arviointia Zic1
promoottori metylaation määrä ja CEA taso (rinnakkainen testaus) oli 0,771 (Fig 4). Näin ollen, havaitseminen Zic1
promoottorin metylaation voi olla tehokkaampi vaihtoehto GPI diagnoosia.

Keskustelu

Viime aikoina lukuisia geenejä on havaittu metyloitavaa GC kudoksissa , kuten E-kadheriinin
, RASSF1A
, p16
, GSTP1
, SOCS1
, SFRP1
ja PTEN
[17]. Raportoitu metylaatio taajuudet ovat vaihdelleet 56%: sta 96% [17]. DNA: n metylaatio on havaittu myös verinäytteitä GC potilaista. Useita APT on todettu metyloitavaa verinäytteitä GC potilaalla, joista p16
, E-kadheriinin
, ja RAR
, jossa havaitseminen hinnat 37%: sta 48%: lla [18-21].

Zic1
on poikkeuksellisesti vaimentua tietyntyyppisten syöpä, osoittaa sen tehtävään APT. Meidän edellinen työ on osoittanut, että Zic1
promoottori usein metyloitu ensisijainen mahasyöpä kudoksia, joilla on korkea havaitseminen 94,6%, mutta ei normaalissa mahalaukun kudoksissa [14]. Tuloksemme ovat osoittaneet, että Zic1
on uusi ehdokas TSG joka on vaimentua kautta promoottori hypermetylaation GC. Kuitenkin parhaan tietomme mukaan ole tutkimukset ovat tutkineet plasman Zic1
promoottori metylaation GC tai Gin.

Tässä tutkimuksessa olemme ensimmäinen osoitti, että poikkeava metylaatio Zic1
promoottori voitiin havaita plasmassa GC ja Gin potilaiden taajuuksilla 60,6% ja 54,0%, vastaavasti, jotka olivat merkittävästi korkeammat kuin NCS. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [14]. Vuodesta diagnostinen näkökulmasta, Zic1
promoottori metylaatio näytteillä suuri spesifisyys erotteleva NCS GC ja GIN potilasta (100%). Tuloksemme osoittivat myös, että havaitseminen Zic1
promoottori metylaatio korko oli korkea positiivinen ennustearvo ja positiivinen todennäköisyys suhde ja AUC GC ja GIN diagnoosi, mikä viittaa siihen, että Zic1
promoottori metylaatio arviointi on potentiaali apuohjelma toteaminen ja varhainen ennustaminen GC.

Monet aikaisemmat tutkimukset ovat keskittyneet ääreisverenkierron DNA-metylaation GC sijaan GIN potilailla, joilla vain kourallinen tutkimuksia keskittyen DNA: n metylaation Gin. Kehitys endoskoopeille tekniikoista on mahdollistanut saatavuuden tehokkaampi ja vähemmän invasiivisia hoitoja EGC ja GIN potilaita. Kaiken seulonta GIN edistää seurantaa GC ja vähentäminen GC liittyviä kuolemantapauksia. Eräs mielenkiintoinen esillä olevan tutkimus on, että osoitimme poikkeavaan Zic1
promoottori metylaatio plasmassa GIN potilailla, joiden havaitsemismäärä joka oli huomattavasti korkeampi kuin NC aiheista (p < 0,001). Tulevaisuudessa havaitseminen hypermetylaatiota Zic1
promoottori voitaisiin mahdollisesti käyttää varoitusmerkki tai seuloa GC korkean riskin ryhmiin.

arvioitiin myös Zic1
promoottori metylaatio plasmassa GC potilaista yhdessä eri kliinis parametreja. Tilastollisesti merkitseviä suhteita ei havaittu Zic1
promoottori metylaation ja eri kliinisten parametrien, kuten kasvaimen koko, erilaistuminen laatu, imusolmuke tila, kasvaimen invaasio syvyys ja TNM; kuitenkin edellisessä tutkimuksessa [15], Zic1
metylaatio on todettu olevan mukana GC invasiivisuus. Esillä olevassa tutkimuksessa, useimmat GC potilailla on diagnosoitu ja käsitellään varhaisessa vaiheessa, jotka ovat voineet vaikuttaa lopulliset tulokset. Validation suuremmassa väestö voi tarjota oivalluksia näitä erilaisia ​​tuloksia. Onko korrelaatio poikkeava Zic1
promoottori metylaatio ja GC kliinisiä piirteitä vaatii selvennystä lisäanalyysillä.

CEA on klassinen tuumorimarkkeri joka on yleisesti arvioidaan klinikalla. Tämä merkki pidetään useimmin läsnä myöhään GC potilaille; kuitenkin, monet tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA: n metylaatio voidaan havaita alkaen alkuvaiheessa GC. Meidän olevassa tutkimuksessa, ROC käyrä muodostettiin arvioida merkitystä yhdistetyn ilmaisun Zic1
promoottori metylaatio korko ja CEA tasolla (rinnakkainen testaus) diagnosoimiseksi GC, paljastaen että niiden yhteenlaskettu havaitseminen tuotti enemmän merkittäviä tuloksia kuin havaitsemista kummankaan parametrin yksin. Siksi ehdotamme, että yhdistetty mittaus Zic1
promoottori metylaatio korko ja CEA tasolla voi parantaa diagnoosin GC.

Yhteenvetona tuloksemme ovat osoittaneet, että mittaus Zic1
promoottori metylaation plasmapohjaista DNA on merkitystä varhaisen havaitsemisen GC ja riskinarvioinnin riskiryhmien. Yhdistetty mittaus Zic1
promoottori metylaatio korko ja CEA tasolla (rinnakkainen testaus) voi laajentaa nykyistä suuntaviivat varhainen diagnosointi GC; kuitenkin lisätutkimuksia, joissa suurempi otoskoko ja kliininen validointi tarvitaan.

tukeminen Information
S1 Kuva. Havaitseminen Zic1
promoottori metylaatio mahasyövän (GC) plasma yksilöitä.
ROC käyrä merkitystä arvioitaessa Zic1
promoottori metylaatio testaus GC diagnoosia.
Doi : 10,1371 /journal.pone.0133906.s001
(TIF)
S2 Kuva. Yhdistetty havaitseminen Zic1
promoottori metylaation ja CEA taso (tandem testaus) mahasyövän (GC) plasma yksilöitä.
ROC käyrä merkitystä arvioitaessa yhdistetyn havaitseminen kahden parametrin (tandem testaus ) GC diagnoosia.
doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s002
(TIF)
S3 Fig. Havaitseminen Zic1
promoottori metylaatio mahalaukun intraepiteliaalisten neoplasia (GPI) plasma yksilöitä.
ROC käyrä merkitystä arvioitaessa Zic1
promoottori metylaatio testaus GPI diagnoosia.
doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s003
(TIF) B

• PLoS ONE: Regulatory B Cell Toiminto on tukahdutti Tupakointi ja Liikalihavuus helikobakteeri-infektion saaneilla ja korreloi Kohonneita mahalaukun syövän riski
• PLoS ONE: Exosomal miRNA alkaen peritoneum huuhtelunäytteessä mahdollisina Prognostic biomarkkerit peritoneaalisille Etäpesäke mahasyövän