PLoS ONE: Zic1 Promoter Гиперметилирование в ДНК Plasma является потенциальным биомаркером рака желудка и интраэпителиальной Neoplasia

Абстрактный

Рак желудка (GC) остается одним из наиболее распространенных видов рака органов пищеварения во всем мире; Тем не менее, большинство пациентов представить на продвинутой стадии при начальной диагностике. Zic1
является новым кандидатом опухолей ген-супрессор, который эпигенетически замолчать в GC. В данном исследовании мы исследовали Zic1
промотор метилирование ДНК в плазме в качестве нового молекулярного маркера для ранней диагностики и мониторинга GC. Специфической в ​​отношении метилирования полимеразной цепной реакции (ПНС) Анализ проводили для обнаружения Zic1
метилирования промоторов в плазме ДНК из 20 здоровых субъектов, 50 желудка интраэпителиальной неоплазии больных и 104 больных ГХ. <ЕМ> Zic1
скорость метилирование промотора в образцах плазмы от здоровой контрольной группе составила 0%, но она достигла 54,0% в группе интраэпителиальной неоплазии и 60,6% в группе GC. Последние два значения были значительно выше, чем найденное в здоровой контрольной группе (р &л; 0,05), с 100% специфичностью по отношению к интраэпителиальной неоплазии и диагностики GC. Положительная прогностическая ценность плазмы Zic1
промотор метилирования для диагностики ЦИН и GC составила 100%. статус метилирования в группе GC не был значительно связан с размером опухоли, дифференцировки опухоли, метастазирование узла лимфы, TNM постановки или инвазии опухоли (р > 0,05). Оценка значимости обнаружения carcino-эмбрионального антигена (СЕА) уровня и Zic1
скорость метилирования промотора для диагностики ГХ показал, что чувствительность Zic1
промотор метилирование был значительно выше, чем у уровень СЕА в качестве маркера и что комбинированное измерение этих двух показателей (параллельное тестирование) улучшенной чувствительностью. Взятые вместе, наши результаты свидетельствуют о том, что Zic1
скорость метилирования промотора в основе плазмы ДНК имеет большое значение для раннего скрининга ГХ и мониторинга онкогенеза. Zic1
промотор метилирование может служить в качестве нового неинвазивного плазмы биомаркеров для раннего выявления GC и для оценки риска в группах высокого риска. Комбинированное измерение Zic1
скорость метилирования промотора и уровень СЕА (параллельное тестирование) может улучшить текущие рекомендации по ранней диагностике GC
<р> Образец цитирования:. Чэнь X, Z Лин, Сюэ M , Si J, Чэнь S (2015) Zic1
Promoter Гиперметилирование в ДНК Plasma является потенциальным биомаркером рака желудка и неоплазии. PLoS ONE 10 (7): e0133906. DOI: 10.1371 /journal.pone.0133906
<р> Редактор: Хирому Suzuki, Саппоро медицинский университет, JAPAN
<р> Поступило: 10 апреля 2015 года; Принято: 2 июля 2015 года; Опубликовано: 24 июля 2015
<р> Copyright: © 2015 Чен и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Чжэцзян Провинциальный Медицинский и здоровье вообще план исследований (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), провинции Чжэцзян Департамент плана исследований в области образования (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn), и провинция Чжэцзян ключевой науки и технологических инноваций команда (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). Финансирующей Шуцзе Чен задумал и разработал эксперименты для этой рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных видов рака органов пищеварения и третьей ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний во всем мире [1]. Большинство GC пациентов, присутствующих на продвинутой стадии после первоначального диагноза. Во всем мире, GC составляет около 952000 новых случаев в год в соответствии с Globocan 2012 [2]. В Японии, показатель 5-летней выживаемости для раннего GC (ГКЦ) составляет 86% по сравнению с 32% для продвинутых ГХ, как сообщили в американской программе ГЭЭ [3].
<Р> Аберрантная метилирование ДНК является важным эпигенетическое изменение климата и ранним событием в канцерогенезе [4]. В последнее время некоторые гены-супрессоры опухолей (TSGs), в том числе FAM5C
, MYLK
, p16
и E-кадгерина
, как сообщается, будет метилируется в сыворотке /плазме GC больных [5-7]. Кроме того, гиперметилирование TSGs имеет тенденцию быть повышена с прогрессированием предраковых поражений [8-9]. Таким образом, обнаружение метилированной ДНК в сыворотке /плазме может быть одним из многообещающих подходов для ранней диагностики ГХ. Интраэпителиальной неоплазии (В) представляет собой потенциально предраковое поражение, что дает высокий риск GC; Таким образом, скрининг пациентов в имеет решающее значение для диагностики и прогнозирования GC. Несколько сообщений о гиперметилированы ДНК анализы образцов крови из желудка интраэпителиальной неоплазии (ГИН) пациентов доступны на сегодняшний день.
<Р> Все больше фактов указывает на то, что Zic1
( Зик
члена семьи 1 , нечетная-парные Drosophila гомолог) участвует в прогрессии некоторых форм рака [10-13]. Ранее мы обнаружили, что Zic1
, роман TSG, замалчивается с помощью гиперметилированием промотора в обоих GC клетках и тканях [14]. Мы также показали, что Zic1
участвует в ингибировании выживания GC клеток и нарушению клеточной миграции [15].
<Р> В настоящем исследовании мы определили ранней диагностики и прогнозирования потенциалы Zic1
гиперметилирование в плазме больных ГХ. Мы измерили статус промотора метилирования Zic1
в плазме крови у пациентов с ГХ или джин и нормальное управление (NC) субъектов. Ассоциация Zic1
промотор метилирование с клинико-патологическими параметрами также оценивали. Кроме того, мы классифицировали высококачественную и T1 GC, как ГКЦ и помещают ГХ и джин пациентов в GC плюс в группе (GPI). Затем мы проанализировали Zic1
ставки гиперметилирование как ГКЦ и GPI групп. Кроме того, комбинированная оценка carcino-эмбрионального антигена (СЕА) уровень и Zic1
промотор метилирования для диагностики ГХ оценивали с использованием плазмы из ГХ и джин пациентов.

Материалы и методы <бр>

Клинические образцы
<р> образцы плазмы были получены дооперационно на сэра Run Run Shaw больницы, Ханчжоу, Чжэцзян, Китай, с ноября 2012 по апрель 2015 года Все пациенты, включенные в нашем исследовании, прошли gastroendoscopy и были сгруппированы в соответствии с диагнозом патоморфологическую. Образцы плазмы собирали из ГХ и джин пациентов, которые были наивным лечебных процедур, таких как химиотерапия, лучевая терапия и хирургическое удаление. Критерии исключения были желудочно-кишечные заболевания с другими причинами и заболеваниями в других органах. У больных с желудочными метастазов других опухолей также были исключены.
<Р> Мы пронумерованные образцы в соответствии с порядком, в котором они были собраны, а затем выполняется метилирования специфических полимеразной цепной реакции (MSP) для оценки образцов в цифровом порядке. Образцы были дополнительно сгруппированы в соответствии с результатами патологии. Образцы плазмы были взяты у 104 больных GC со средним возрастом 59,8 лет, которые были диагностированы в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения [16]. Пятьдесят ГИН пациентов со средним возрастом 58,0 лет был диагностирован гастроскопии. Образцы крови были собраны из 20 здоровых добровольцев в группе NC со средним возрастом 38,5 лет.

Этика заявление
<р> Наш проект получил одобрение от клинических исследований по этике Комитета Института гастроэнтерологии Чжэцзян университета. Письменное информированное согласие было получено от каждого пациента до взятия пробы. Лица, принимавшие участие в данном исследовании, дали письменное информированное согласие (как указано в PLOS
формы согласия) опубликовать эти подробности дела.

Выделение ДНК и бисульфит модификация
<р> ДНК экстрагировали из образцов плазмы с использованием QIAamp ДНК крови Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Концентрации ДНК измеряли с помощью спектроскопии при длине волны 260 нм. ДНК-бисульфит обрабатывают Kit Zymo ДНК модификации (Zymo Research, Orange, CA, USA). Модифицированную ДНК хранили при -20 ° С до использования.

MSP анализы

Zic1
промотор метилирование исследовали путем проведения анализа с использованием MSP выше бисульфит модифицированной бесплатно плазма ДНК в качестве матрицы. СМП проводили в течение 40 циклов при температуре отжига 56 ° С, как описано ранее [14]. Метилирования-специфичные праймеры были ZIC1-МФ (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) и ZIC1-МР (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG), и неметилированной-специфичные праймеры были ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) и ZIC1-UR (5'- CCCATTAACCACATTAAACA). Протокол ПЦР включали исходную денатурацию при 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов денатурации при 95 ° С в течение 30 с, отжиг при 56 ° С в течение 40 с, удлинение праймера при 72 ° С в течение 40 с, а окончательное расширение при 72 ° С в течение 7 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле, окрашивали гель красным, и визуализировали с помощью УФ-освещения.

Сыворотка CEA тестирование
<р> Образцы сыворотки были отправлены в клиническую лабораторию сэра Run Run Шоу больница для тестирования, а концентрация СЕА > 5 нг /мл считался ненормальным.

Статистический анализ
<р> Частоты метилирования и уровни CEA в образцах плазмы сравнивали с использованием точного критерия Фишера. Связь между клинико-патологическими характеристиками и гиперметилированием ДНК анализировали с использованием критерия хи-квадрат. Диагностическое значение комбинации Zic1
промотор метилирование и плазменный уровень СЕА оценивали по площади под приемником характеристической кривой (AUC). Чувствительность, специфичность, а также положительные и отрицательные прогностические значения для патологического диагноза были рассчитаны с 95% доверительные интервалы для Zic1
метилирования промоторов или Zic1
метилирования промоторов в сочетании с уровнем СЕА. Положительные и отрицательные отношения правдоподобия были также рассчитаны. Для всех тестов, отрезанной значения р < 0,05 применялся для определения статистической значимости. Все статистические анализы были проведены с использованием SPSS 19,0 программного обеспечения (SPSS Inc., Chicago, IL).

Результаты

статус метилирования в плазме

Для того, чтобы оценить изменения в Zic1
промотор метилирование в GC, мы впервые обнаружили статус метилирования этого промотора в 104 больных с GC, 50 с джин, 31 с ГКЦ и 20 НЦ и проводили сравнение между группами. Скорости метилирования Zic1
промоутер в образцах плазмы были в группе NC (0%) 0%, увеличившись до 54,0% в группе GIN и до 60,6% в группе GC (р &л; 0,001 как для джина и GC против NC), со 100% -ной специфичностью для диагностики GPI (20/20) (рис 1). Положительные и отрицательные значения предсказанием и положительные и отрицательные отношения правдоподобия для диагностики IN и GC были на 100% (90/90), 23,8% (20/84), бесконечный и 0,42, соответственно. Результаты анализа Представитель MSP для Zic1
промотор метилирования показаны на рис 2.

Ассоциация функций с клинико-патологическими Zic1
промотор метилирование в плазме больных GC
<р> затем мы сопоставили особенности клинико-с Zic1
скорость метилирования промотора в плазме больных GC для выявления каких-либо ассоциаций. Результаты не выявили заметные ассоциации между Zic1
скорость промотора метилирования и клинические параметры, включая размер опухоли, дифференциации классов, состояние лимфатических узлов, глубина инвазии опухоли и TNM стадии (р ≫ 0,05) (таблица 1) .

Комбинированный определение Zic1
гиперметилирование и уровень СЕА
<р> значение комбинированного определения Zic1
скорость гиперметилирование и уровень СЕА для была проанализирована диагностика и раннее предсказание GC. Мы измеряли уровень СЕА в 9 НЦ, 24 больных джина и 71 GC пациентов до начала лечения. Чувствительности уровня СЕА в группах GC, IN, и EGC были 22,5% (16/71), 16,7% (4/24) и 10,5% (2/19), соответственно. Во всех 3 группах, чувствительность Zic1
промотор метилирование был значительно выше, чем у уровня СЕА (р &л; 0,05).

Комбинированное определение Zic1 <бр> гиперметилирование и уровень СЕА в GC группе.
<р> в GC группе, чувствительность и специфичность комбинированного определения Zic1
скорости метилирования промотора и уровня СЕА (тестирование тандем) были 16,9 % и 90,9% соответственно (таблица 2). Чувствительность комбинированного анализа этих двух параметров (параллельное тестирование) составила 69,0% (таблица 2), которая была выше, чем чувствительностей, достигнутые тестирования либо одного параметра. анализ кривой ROC было проведено с целью оценки значимости скорости метилирования ДНК и уровень СЕА для диагностики ГХ. АУК Zic1
тестирование промотора метилирования в одиночку был 0,610 (S1 рис) и что для комбинированной оценки Zic1
метилирования промоторов и уровня СЕА (тестирование тандем) был 0,539 (S2 рис) , Следует отметить, что при Zic1
промотор метилирование и уровень СЕА анализировали параллельно, АУК увеличилась до 0.633 (рис 3). На основании приведенных выше результатов, объединенное определение Zic1
скорость метилирования промотора и уровень СЕА (параллельное тестирование) для диагностики GC было установлено, что синергетический по сравнению с использованием только каждого метода.

Комбинированный определение Zic1
гиперметилирование и уровень СЕА в группе GPI.
<р> в группе GPI, чувствительность и специфичность комбинированного определения Zic1
скорости метилирования промотора и уровень СЕА (тандем тестирование) были 15,8% и 100,0% соответственно (таблица 3). Комбинированная оценка этих двух параметров (параллельное тестирование) имели самую высокую чувствительность на 65,3%, с положительной прогностической значимостью, достигающей 98,4% (таблица 3). анализ кривой ROC было проведено с целью оценки значимости скорости метилирования ДНК и уровень СЕА для диагностики GPI. АУК Zic1
тестирование промотора метилирования в одиночку был 0,792 (S3 рис) и что для комбинированной оценки Zic1
скорость метилирования промотора и уровень СЕА (параллельное тестирование) был 0,771 (рис 4). Таким образом, обнаружение Zic1
промотор метилирования может быть более эффективной альтернативой для диагностики GPI.

Обсуждение

В последнее время многочисленные гены были найдены, чтобы быть метилируется в GC тканях , в том числе E-кадгерина
, RASSF1A
, p16
, GSTP1
, SOCS1
, SFRP1 <бр> и PTEN
[17]. Отмеченные частоты метилирования варьировались от 56% до 96% [17]. Метилирование ДНК также наблюдалась в образцах крови от больных ГХ. Несколько TSGs было обнаружено, что метилируется в образцах крови от больных ГЦ, в том числе p16
, E-кадгерина
и RAR
, уровень обнаружения с 37% до 48%, соответственно [18-21].

Zic1
является аберрантно подавляются в определенных типах рака, что указывает на его функции в качестве TSG. Наша предыдущая работа показала, что Zic1
промотор часто метилируется в первичных желудочных тканях карциномы, с высоким уровнем обнаружения 94,6%, но не в нормальных тканях желудка [14]. Наши результаты показали, что Zic1
является новым кандидатом TSG, который подавляются с помощью гиперметилированием промотора в GC. Однако, насколько нам известно, ни одно исследование не исследовали плазмы Zic1
промотор метилирование в ГХ или джин.
<Р> В настоящем исследовании мы впервые показали, что аберрантных метилирования Zic1
промотор может быть обнаружен в плазме от ГХ и джин пациентов на частотах 60,6% и 54,0% соответственно, что было значительно выше, чем у НЦ. Эти результаты согласуются с результатами предыдущих исследований [14]. С диагностической точки зрения, Zic1
промотор метилирование проявляли высокую специфичность для различения НКШ от GC и джин пациентов (100%). Наши результаты также показали, что обнаружение элемента Zic1
скорость метилирования промотора имели высокую прогностическую ценность и положительное отношение правдоподобия и AUC для GC и диагностики ГИН, предполагая, что Zic1
Оценка промотора метилирования имеет потенциальная полезность для диагностики и раннего прогнозирования GC.
<р> Многие предыдущие исследования были сосредоточены на метилирование ДНК периферической крови в GC, а не больных джин, и лишь немногие из исследований, посвященных метилирования ДНК в джин. Развитие эндоскопических методов позволило наличие более эффективных и менее инвазивных методов лечения ГКЦ и джин пациентов. В целом, скрининг на GIN способствует мониторингу GC и сокращения смертности GC связанных. Один интересный аспект настоящего исследования заключается в том, что мы продемонстрировали аберрантное Zic1
промотор метилирование в плазме крови у пациентов джин, со скоростью обнаружения, которая была значительно выше, чем у испытуемых NC (р &л; 0,001). В будущем обнаружение гиперметилирование Zic1
промотор потенциально может быть использован в качестве раннего предупреждения знак или экран для GC в группах высокого риска.
<Р> Мы также оценили Zic1
промотор метилирование в плазме крови у пациентов GC в сочетании с различными клинико-патологическими параметрами. Никаких статистически не наблюдались значимые связи между Zic1
промотор метилирование и различные клинические параметры, включая размер опухоли, дифференциации классов, состояние лимфатических узлов, глубина инвазии опухоли и стадии TNM; Тем не менее, в нашем предыдущем исследовании [15], Zic1
метилирование было обнаружено, что участие в GC инвазивности. В настоящем исследовании, большинство пациентов GC был поставлен диагноз и лечение на ранней стадии, что могло повлиять на окончательные результаты. Проверка в большей части населения может дать представление об этих различных результатов. Существует ли какая-нибудь связь между аберрантное Zic1
промотор метилирование и клинические характеристики GC требует уточнения путем дальнейшего анализа.
<Р> CEA является классическим маркером опухоли, который обычно оценивается в клинике. Этот маркер считается наиболее часто присутствует в конце пациентов GC; Тем не менее, многие исследования показали, что метилирование ДНК можно обнаружить, начиная с ранней стадии ГХ. В нашем настоящем исследовании, кривая ROC была сгенерирована оценить значимость комбинированного обнаружения элемента Zic1
скорость метилирования промотора и уровень СЕА (параллельное тестирование) для диагностики ГХ, показывая, что их комбинированное определение производится более значительные результаты, чем обнаружение либо одного параметра. Таким образом, мы полагаем, что комбинированное измерение Zic1
скорость метилирования промотора и уровень СЕА может улучшить диагноз GC.
<Р> В заключение, наши результаты показали, что измерение Zic1
промотор метилирование полученного из плазмы ДНК имеет значение для раннего выявления GC и для оценки риска в группах высокого риска. Комбинированное измерение Zic1
скорость метилирования промотора и уровень СЕА (параллельное тестирование) может улучшить текущие рекомендации по ранней диагностике GC; Однако дальнейшие исследования с более крупными размерами выборки и клинические проверки необходимы.

Поддержка Информация
S1 Рис. Обнаружение Zic1
промотор метилирования при раке желудка (GC) образцов плазмы.
Кривой ROC для оценки значимости Zic1
тестирования метилирования промоторов для диагностики ГХ.
Дои : 10.1371 /journal.pone.0133906.s001
(TIF)
S2 рис. Комбинированное определение Zic1
промотор метилирование и уровень СЕА (тестирование тандем) при раке желудка (GC) образцов плазмы.
Кривой ROC для оценки значимости комбинированного обнаружения двух параметров (тестирование тандем .) для диагностики ГХ
DOI: 10.1371 /journal.pone.0133906.s002
(TIF)
S3 рис. Обнаружение Zic1
промотор метилирование в желудочном интраэпителиальной неоплазии (GPI) образцов плазмы.
Кривой ROC для оценки значимости Zic1
промоутер метилирования тестирование для диагностики GPI.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0133906.s003
(TIF)

• PLoS ONE: Нормативная B Cell Функция подавлена ​​курение и ожирение в H. Pylori-инфицированных субъектов и коррелируется…
• PLoS ONE: Exosomal микроРНК из брюшины промывной жидкости в качестве прогностического биомаркеров перитонеальные ме…