PLoS ONE: Zic1 Promoter Hypermethylering in Plasma DNA is een potentiële biomarker voor maagkanker en intra-epitheliale Neoplasia

Abstract

Maagkanker (GC) blijft een van de meest voorkomende vormen van kanker wereldwijd spijsvertering; Echter, de meeste patiënten presenteren in een vergevorderd stadium bij de eerste diagnose. Zic1
is een nieuwe kandidaat tumor suppressor gen dat epigenetisch wordt het zwijgen opgelegd in GC. In deze studie hebben we onderzocht Zic1
promoter methylering in plasma DNA als een nieuwe moleculaire marker voor de vroege diagnose en monitoring van GC. Methylatie-specifieke polymerase kettingreactie (MSP) assay werd uitgevoerd om te detecteren Zic1
promoter methylatie in plasma DNA van 20 gezonde personen, 50 maag intra-epitheliale neoplasie patiënten en 104 GC patiënten. De Zic1
promoter methylering tarief in de plasma monsters van de gezonde controlegroep was 0%, maar het bereikte 54,0% in de intra-epitheliale neoplasie-groep en 60,6% in de GC-groep. De laatste twee waarden waren significant hoger dan in de gezonde controlegroep (p < 0,05), met een specificiteit van 100% intra-epitheliale neoplasie en GC diagnose. De positief voorspellende waarde van plasma Zic1
promoter methylering voor de diagnose van intra-epitheliale neoplasie en GC was 100%. Methylatie status van de GC-groep was niet significant geassocieerd met tumorgrootte, tumor differentiatie, lymfeklieren metastase, TNM staging, of tumor invasie (p > 0,05). De beoordeling van het belang van opsporing van het carcino-embryonaal antigeen (CEA) niveau en de Zic1
promoter methylering tarief voor GC diagnose bleek dat de gevoeligheid van Zic1
promoter methylering was significant hoger dan die van de de CEA niveau als een marker en dat de gecombineerde meting van deze twee indices (parallel testing) verbeterde gevoeligheid. Samen, onze resultaten suggereren dat de Zic1
promoter methylatie tarief in plasma-afgeleide DNA is van groot belang voor de vroegtijdige opsporing van GC en de monitoring van het ontstaan ​​van tumoren. Zic1
promoter methylering kan dienen als een nieuwe niet-invasieve plasma biomarker voor de vroege opsporing van GC en voor de risicobeoordeling in hoog-risicogroepen. De gecombineerde meting van de Zic1
promoter methylering beoordelen en CEA-niveau (parallel testing) kan de huidige richtlijnen te verbeteren voor de vroegtijdige diagnose van GC

Visum:. Chen X, Lin Z, Xue M , Si J, Chen S (2015) Zic1
Promotor Hypermethylering in Plasma DNA is een potentiële biomarker voor maagkanker en intra-epitheliale neoplasie. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10.1371 /journal.pone.0133906

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medische Universiteit, JAPAN

Ontvangen: 10 april 2015; Aanvaard: 2 juli 2015; Gepubliceerd: 24 juli 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang provinciale Geneeskundige en gezondheid algemeen onderzoeksplan (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiang provinciale ministerie van Onderwijs onderzoeksplan (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn), en provincie Zhejiang belangrijke wetenschappelijke en technologische innovatie team (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). De financier Shujie Chen bedacht en ontwierp de experimenten van dit manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende digestieve kanker en de derde belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. De meerderheid van de GC-patiënten aanwezig zijn in een vergevorderd stadium bij de eerste diagnose. Wereldwijd GC goed voor bijna 952.000 nieuwe gevallen per jaar volgens GLOBOCAN 2012 [2]. In Japan, de 5-jaarsoverleving voor de vroege GC (EGC) is 86%, vergeleken met 32% voor geavanceerde GC, zoals gerapporteerd door de Amerikaanse SEER programma [3].

Aberrant DNA-methylatie is een belangrijke epigenetische verandering en een vroege gebeurtenis bij carcinogenese [4]. Onlangs heeft een aantal tumorsuppressorgenen (GTS), met inbegrip van FAM5C
, MyLK
, p16 Kopen en E-cadherine
, zijn gemeld te zijn gemethyleerd in het serum /plasma van GC patiënten [5-7]. Bovendien hypermethylatie van GTS'en vaak wordt aangevuld met de progressie van voorstadia van kanker [8-9]. Daarom kan de detectie van gemethyleerd DNA in serum /plasma een veelbelovende benadering voor de vroege diagnose van GC zijn. Intra-epitheliale neoplasie (IN) is een potentieel precancerous laesie die een hoog risico GC verleent; dus de screening van patiënten cruciaal voor de diagnose en voorspelling van GC. Er zijn maar weinig meldingen van hypermethylated DNA-analyses van bloedmonsters van de maag intra-epitheliale neoplasie (GIN) patiënten zijn beschikbaar tot op heden.

Het kweken van bewijsmateriaal wijst erop dat Zic1
( Zic
familielid 1 , oneven gepaarde Drosophila homoloog) deel aan de progressie van verschillende kankers [10-13]. We hebben eerder ontdekt dat Zic1
, een roman GTS, wordt het zwijgen opgelegd via promoter hypermethylatie in zowel GC cellen en weefsels [14]. We hebben ook aangetoond dat Zic1
is betrokken bij de remming van GC celoverleving en bijzondere waardevermindering van de cel migratie [15].

In de huidige studie, hebben we de vroegtijdige diagnose en voorspellende mogelijkheden van Zic1
hypermethylatie in het plasma van patiënten GC. We meten de promotor methylatie status van de Zic1
in het plasma van patiënten met GC of GIN en normale controle (NC) onderwerpen. De associatie van Zic1
promoter methylering met klinisch-pathologische parameters werd ook beoordeeld. Daarnaast ingedeeld we hoogwaardige IN en T1 GC als EGC en plaatste de GC en GIN patiënten in een GC plus IN groep (GPI). Vervolgens analyseerden we de Zic1
hypermethylatie prijzen in zowel de EGC en GPI groepen. Verder is de gecombineerde evaluatie van het carcino-embryonaal antigeen (CEA) niveau en de Zic1
promoter methylering voor GC diagnose werd beoordeeld met behulp van plasma van de GC en GIN patiënten.

Materialen en methoden

Klinische monsters

Plasma monsters werden preoperatief verkregen bij Sir Run Run Shaw Ziekenhuis, Hangzhou, Zhejiang, China, van november 2012 tot april 2015. Alle patiënten opgenomen in onze studie ondergingen gastroendoscopy en werden gegroepeerd volgens histopathologische diagnose. Plasma monsters werden verzameld uit GC en GIN patiënten die naïef curatieve behandelingen, zoals chemotherapie, radiotherapie en chirurgische resectie waren. De uitsluitingscriteria waren gastrointestinale ziekten met andere oorzaken en ziekten in andere organen. Patiënten met maag metastasen van andere tumoren werden eveneens uitgesloten.

We telden de monsters in de volgorde waarin ze werden verzameld en vervolgens uitgevoerd methylering-specifieke polymerase kettingreactie (MSP) de monsters in numerieke volgorde beoordelen. De monsters werden verder gegroepeerd naar pathologieresultaten. Plasma monsters werden verzameld van 104 GC patiënten met een gemiddelde leeftijd van 59,8 jaar die volgens de World Health Organization criteria [16] werden gediagnosticeerd. Vijftig GIN patiënten met een gemiddelde leeftijd van 58,0 jaar werden gediagnosticeerd door gastroscopie. Bloedmonsters werden ook verzameld van 20 gezonde vrijwilligers in de NC-groep met een gemiddelde leeftijd van 38,5 jaar.

Ethics statement

Onze project kreeg de goedkeuring van de Clinical Research Ethics Committee van het Institute of Gastroenterology van Zhejiang University. Schriftelijke toestemming werd verkregen van elke patiënt vóór monstername. De personen die deelnamen aan dit onderzoek gaven schriftelijk informed consent (zoals beschreven in de PLOS
toestemmingsformulier) om deze zaak gegevens te publiceren.

DNA isolatie en bisulfiet modificatie

DNA werd geëxtraheerd uit de plasmamonsters met een QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland). DNA concentraties werden bepaald door spectroscopie bij een golflengte van 260 nm. DNA werd bisulfiet-behandeld met een Zymo DNA Modificatie Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA). Het gemodificeerde DNA werd opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.

MSP assays

Zic1
promoter methylatie werd door het uitvoeren MSP analyse met gebruik onderzoek van bovenstaande bisulfiet-gemodificeerd vrij plasma DNA als de matrijs. MSP werd uitgevoerd gedurende 40 cycli bij een hybridisatietemperatuur van 56 ° C zoals eerder [14] beschreven. De methylatie-specifieke primers waren ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) en ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG) en de ongemethyleerde specifieke primers waren ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) en ZIC1-UR (5' CCCATTAACCACATTAAACA). De PCR-protocol Initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 seconden, hybridisatie bij 56 ° C gedurende 40 s, primerverlenging bij 72 ° C gedurende 40 s en laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 7 min. De PCR-producten werden geëlektroforeerd op 1,5% agarose gels, gekleurd met Red gel en zichtbaar gemaakt door belichting met UV.

Serum CEA testen

De serummonsters werden naar het klinisch laboratorium van Sir Run Run Shaw ziekenhuis voor testen en een CEA concentratie van > 5 ng /mL werd beschouwd als abnormaal.

Statistische analyses

De methylering frequenties en CEA niveaus in de plasmamonsters werden vergeleken met behulp van Fisher's exact test. De associatie tussen de klinisch-pathologische kenmerken en DNA Hypermethylering werd geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraat test. De diagnostische waarde van de combinatie van de Zic1
promoter methylering en het plasma CEA-niveau werd geëvalueerd volgens de oppervlakte onder de receiver operating characteristic curve (AUC). De sensitiviteit, specificiteit en positief en negatief voorspellende waarden voor pathologische diagnose werden berekend met 95% betrouwbaarheidsintervallen voor Zic1
promoter methylering of Zic1
promoter methylering in combinatie met de CEA-niveau. Positieve en negatieve likelihood ratio's werden ook berekend. Voor alle tests, een cut-off waarde van p < 0,05 werd op statistische significantie te bepalen. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS 19.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultaten

methylatie status van het plasma

Om veranderingen te beoordelen in Zic1
promoter methylering in GC, we eerst de methylatie status van deze promotor ontdekt in 104 patiënten met GC, 50 met GIN, 31 met EGC en 20 NC's en uitgevoerd vergelijkingen tussen de groepen. De methylering van de tarieven Zic1
promoter in de plasmamonsters werden 0% in de groep NC (0%), oplopend tot 54,0% in de groep GIN en 60,6% in de GC (p < 0,001 zowel GIN en GC vs. NC), met 100% specificiteit voor GPI diagnose (20/20) (figuur 1). De positieve en negatieve voorspellende waarden en positieve en negatieve likelihood ratio voor de diagnose IN en GC waren 100% (90/90), 23,8% (20/84), oneindig en 0,42 respectievelijk. Representatieve MSP test resultaten voor Zic1
promoter methylering zijn weergegeven in figuur 2.

Vereniging van clinicopathologische functies met Zic1
promoter methylering in het plasma van GC patiënten

We vervolgens gecorreleerd de klinische en functies met de Zic1
promoter methylering tarief in het plasma van de GC patiënten om verenigingen te identificeren. De resultaten lieten geen duidelijke associaties tussen de Zic1
promoter methylering koers en de klinische parameters, waaronder tumorgrootte, differentiatiegraad, lymfeklierstatus, tumor invasie diepte en TNM stadium (p > 0,05) (tabel 1) .

gecombineerde bepaling van Zic1
hypermethylatie en CEA-niveau

de betekenis van de gecombineerde bepaling van de Zic1
hypermethylering koers en de CEA-niveau voor de diagnose en voorspelling van GC geanalyseerd. We meten de CEA-niveau in 9 NC, 24 GIN patiënten en 71 GC patiënten voor behandeling. De gevoeligheden van de CEA niveau in de GC, IN en EGC groepen was 22,5% (16/71), 16,7% (4/24) en 10,5% (2/19) respectievelijk. In alle 3 van de groepen, de gevoeligheid van Zic1
promoter methylering was significant hoger dan die van de CEA-niveau (p < 0,05).

gecombineerde bepaling van Zic1
hypermethylering en CEA-niveau in GC-groep.

in het GC-groep, de gevoeligheid en specificiteit van de gecombineerde bepaling van de Zic1
promoter methylering koers en de CEA-niveau (tandem testing) waren 16,9 % en 90,9%, respectievelijk (tabel 2). De gevoeligheid van de gecombineerde analyse van deze twee parameters (parallel tests) was 69,0% (Tabel 2), die hoger zijn dan de resultaten van het testen van een van de parameters alleen gevoeligheden was. ROC curve analyse werd uitgevoerd om de betekenis van de DNA methylatie snelheid en CEA-niveau GC diagnose beoordelen. De AUC voor Zic1
promoter methylering testen alleen was 0.610 (S1 figuur), en dat voor de gecombineerde beoordeling van de Zic1
promoter methylering en de CEA-niveau (tandem testing) was 0,539 (S2 Afb) . Met name wanneer Zic1
promoter methylering en de CEA-niveau werden in parallel getest, de AUC verhoogd tot 0,633 (figuur 3). Op basis van bovenstaande resultaten, de gecombineerde bepaling van de Zic1
promoter methylatie snelheid en CEA niveau (parallel tests) GC diagnose bleek synergistisch is vergeleken met het gebruik van alleen elke methode.

gecombineerde bepaling van de Zic1
hypermethylatie en CEA niveau GPI groep.

in de GPI-groep, de gevoeligheid en specificiteit van de gecombineerde bepaling van de Zic1
promoter methylering rate en CEA niveau (tandem test) waren 15,8% en 100,0%, respectievelijk (tabel 3). De gecombineerde beoordeling van deze twee parameters (parallelle test) had de hoogste gevoeligheid 65,3%, met een positieve voorspellende waarde bereikt 98,4% (Tabel 3). ROC curve analyse werd uitgevoerd om de betekenis van de DNA methylatie snelheid en CEA-niveau GPI diagnose beoordelen. De AUC voor Zic1
promoter methylering testen alleen was 0,792 (S3 figuur), en dat voor de gecombineerde beoordeling van de Zic1
promoter methylering koers en de CEA-niveau (parallel testing) was 0,771 (Fig 4). Daarom is de detectie van Zic1
promoter methylatie kan een alternatief voor GPI diagnose.

Discussie

Recent zijn talrijke genen bleken gemethyleerd in GC weefsels , met inbegrip van E-cadherine
, RASSF1A
, p16
, GSTP1
, SOCS1
, sFRP1
en PTEN
[17]. Gerapporteerde methylatie frequenties variëren van 56% tot 96% [17]. DNA methylatie is ook waargenomen in bloedmonsters van patiënten GC. Verschillende GTS gevonden in bloedmonsters te worden gemethyleerd van GC-patiënten, met inbegrip van p16
, E-cadherine
en RAR
, met detectie percentages van 37% tot 48%, respectievelijk [18-21].

Zic1
wordt aberrantly neerwaarts gereguleerd in bepaalde vormen van kanker, een indicatie van zijn functie als TSG. Onze vorige werk is gebleken dat de Zic1
promotor wordt vaak gemethyleerd in het primair maagcarcinoom weefsels, met een hoge detectie-tarief van 94,6%, maar niet in normale maag weefsels [14]. Onze resultaten hebben aangetoond dat Zic1
is een nieuwe kandidaat TSG die wordt neerwaarts gereguleerd via promoter hypermethylering in GC. Echter, om het beste van onze kennis, geen studies hebben onderzocht plasma Zic1
promoter methylering in GC of GIN.

In de huidige studie hebben we eerst aangetoond dat de afwijkende methylering van de Zic1
promoter kan worden gedetecteerd in plasma van GC en GIN patiënten bij een frequentie van 60,6% en 54,0%, respectievelijk, die aanzienlijk hoger is dan die van de NC's waren. Deze resultaten zijn consistent met die van eerdere studies [14]. Vanuit een diagnostisch oogpunt, Zic1
promoter methylering vertoonden een hoge specificiteit voor het onderscheiden van de NC's van het GC en GIN patiënten (100%). Onze resultaten toonden ook aan dat de detectie van de Zic1
promoter methylering tarief had een hoge positief voorspellende waarde en een positieve likelihood ratio en AUC voor GC en GIN diagnose, wat suggereert dat Zic1
promoter methylering evaluatie heeft potentiële bruikbaarheid voor de diagnose en voorspelling van GC.

Veel eerdere studies hebben zich gericht op perifeer bloed DNA methylatie in GC plaats GIN patiënten met slechts een handvol studies gericht op DNA methylatie in GIN. De ontwikkeling van endoscopische technieken is toegestaan ​​voor de beschikbaarheid van efficiëntere en minder invasieve behandelingen voor EGC en GIN patiënten. Over het algemeen, het screenen voor GIN draagt ​​bij aan de bewaking van GC en de vermindering van GC-gerelateerde sterfgevallen. Een interessant aspect van deze studie is dat we aangetoond afwijkende Zic1
promoter methylatie in plasma van patiënten GIN, met een detectiegraad die significant hoger zijn dan die van de NC patiënten (p < 0,001) was. In de toekomst, detectie van hypermethylatie van de Zic1
promoter zou kunnen worden gebruikt als een early warning sign of om te screenen op GC in hoog-risicogroepen.

We hebben ook geëvalueerd Zic1
promoter methylering in plasma van GC patiënten in samenwerking met diverse klinische en pathologische parameters. Geen statistisch significante relatie waargenomen tussen Zic1
promoter methylering en de verschillende klinische parameters, waaronder tumorgrootte, differentiatiegraad, lymfeklierstatus, tumor invasie diepte en TNM stadium; In onze vorige studie [15], Zic1
methylatie is gevonden betrokken te zijn bij GC invasiviteit. In deze studie, de meeste GC patiënten werden gediagnosticeerd en behandeld in een vroeg stadium, waardoor de uiteindelijke resultaten kunnen hebben beïnvloed. Validatie in groter populatie kan inzicht in deze verschillende resultaten. Of er verband bestaat tussen afwijkende Zic1
promoter methylering en GC klinische kenmerken moet worden opgehelderd door verdere analyse.

CEA is een klassiek tumormarker die vaak in de kliniek wordt beoordeeld. Deze markering wordt beschouwd als de meest frequent aanwezig in de late GC patiënten te zijn; echter, hebben vele studies aangegeven dat DNA methylering gedetecteerd in een vroeg stadium van GC. In onze huidige studie werd een ROC-curve gegenereerd om de betekenis van de gecombineerde detectie van de evaluatie van de Zic1
promoter methylering beoordelen en CEA-niveau (parallel testing) voor de diagnose van GC, waaruit blijkt dat hun gecombineerde detectie produceerde meer significante resultaten dan de opsporing van het parameter alleen. Daarom stellen wij voor dat de gecombineerde meting van de Zic1
promoter methylering beoordelen en CEA-niveau kan de diagnose van GC te verbeteren.

Tot slot hebben onze resultaten bleek dat de meting van de Zic1
promoter methylatie in-plasma-afgeleide DNA is van belang voor de vroegtijdige opsporing van GC en voor de risicobeoordeling in hoog-risicogroepen. De gecombineerde meting van de Zic1
promoter methylering beoordelen en CEA-niveau (parallel testing) kan de huidige richtlijnen voor de vroege diagnose van GC te verbeteren; Echter, verdere studies met grotere steekproeven en klinische validatie vereist.

Ondersteunende informatie
S1 Fig. Detectie van Zic1
promoter methylering bij maagkanker (GC) plasma specimens.
Een ROC curve voor het evalueren van de betekenis van de Zic1
promoter methylering testen voor GC diagnose.
Doi : 10.1371 /journal.pone.0133906.s001
(TIF)
S2 Afb. Gecombineerde detectie van Zic1
promoter methylatie en CEA niveau (tandem testen) bij maagkanker (GC) plasmamonsters.
Een ROC curve voor beoordeling van de relevantie van de gecombineerde detectie van de twee parameters (tandem testen .) voor GC diagnose
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s002
(TIF)
S3 Fig. Detectie van Zic1
promoter methylering in de maag intraepithelial neoplasie (GPI) plasma specimens.
Een ROC curve voor het evalueren van de betekenis van de Zic1
promoter methylering testen voor GPI diagnose.
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s003
(TIF)

• PLoS ONE: Regelgeving B cel functie wordt onderdrukt door roken en obesitas in H. pylori-geïnfecteerde personen en is gecorreleerd met een verhoogd risico op maagkanker
• PLoS ONE: exosomaal miRNAs van Peritoneum spoelvloeistof als potentiële prognostische Biomarkers van peritoneale metastasen bij maagkanker