PLOS ONE: Proteomics-Based Identification et analyse des protéines associées à Helicobacter pylori dans le cancer gastrique

Résumé

Helicobacter pylori
( H
. pylori
) est une bactérie Gram-négatif bactérie en forme de spirale qui provoque la chronique la plus commune infection dans l'estomac humain. Environ 1% à 3% des individus infectés développent un cancer gastrique. Cependant, les mécanismes par lesquels H
. pylori
induit le cancer gastrique ne sont pas complètement compris. Les données disponibles indiquent un lien étroit entre le facteur de virulence de H
.
pylori, le gène associé à la cytotoxine A (CagA) et le cancer gastrique. Pour caractériser davantage H
. pylori
virulence, nous avons établi trois lignées cellulaires en infectant les lignées cellulaires de cancer gastrique SGC-7901 et AGS avec cagA
^{+
H
. pylori
et transfecter SGC-7901 avec un vecteur portant la pleine longueur cagA
gène. Nous détectons 135 protéines différentes exprimées à partir de trois lignées cellulaires en utilisant la technologie du protéome et de 10 protéines différentielles communes aux trois lignées cellulaires ont été sélectionnés et identifiés par LC-MS /MS, ainsi que vérifié par Western Blot: ß-actine, la L-lactate déshydrogénase (LDH), dihydrolipoyl déshydrogénase (DLD), pré-ARNm-facteur de transformation 19 homolog (PRPF19), l'ATP synthase, la calmoduline (CaM), p64 CLCP, spécifique-Ran protéine GTPase-activation (RanGAP), P43 et calréticuline. La détection de l'expression de ces protéines et les gènes codant pour ces protéines dans les tissus de cancer gastrique humains par PCR en temps réel (RT-qPCR) et Western blot a révélé que l'expression de β-actine
, LDH
, DLD
, PRPF19
et CaM
gènes ont été régulés à la hausse et RanGAP
a été régulée à la baisse dans les tissus de cancer gastrique et /ou ganglions lymphatiques métastatique par rapport aux tissus péri-cancéreuse. expression élevée du gène a été observée pour H
. pylori
infection dans les tissus de cancer gastrique. En outre, le LDH
, DLD
et Les gènes de CaM ont été déméthylation au niveau du promoteur -2325, -1885 et -276 des sites, respectivement, et le RanGAP
gène a été fortement méthylé au niveau du promoteur -570 et -170 sites dans H
. pylori
infecté par et cagA
-overexpressing cellules. Ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur la pathogenèse et le traitement des cibles moléculaires pour le cancer gastrique avec H
. infection pylori}

Citation:. Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, Chen X, Xu W, et al. (2016) Proteomics-Based Identification et analyse des protéines associées à Helicobacter pylori
dans le cancer gastrique. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10.1371 /journal.pone.0146521

Editeur: Hiromu Suzuki, Université médicale de Sapporo, JAPON

Reçu 15 Septembre 2015; Accepté le 19 Décembre 2015; Publié: 8 Janvier 2016

Droit d'auteur: © 2016 Zhou et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. Tous pertinents les données sont dans le papier

financement:. le travail a été soutenu par le national Natural science Foundation de Chine (81260303, 31560326), Guizhou fondation province (QianJiaoHe [2014] 06) et projet clé de la science et de la technologie du Guizhou province (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). Dans la version originale, le travail a été soutenu par le National Natural Science Foundation de Chine (81260303, 31560326) et le projet clé de la science et de la technologie de la province du Guizhou (QianKeHe SY (2011) 3067)

Intérêts concurrents:. Le les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent.

introduction

Helicobacter pylori
( H
. pylori
) provoque le plus infection de l'estomac chronique fréquente chez l'homme dans le monde entier. Environ la moitié de la population mondiale est infectée par H
. pylori
, et la majorité des individus colonisés développent gastrite asymptomatique. Parmi les personnes infectées, soit environ 10% à 20% des individus développent des maladies ulcéreux et 1% -3% développent un cancer gastrique [1,2]. En 1994, H
. pylori
a été classé comme un type I carcinogène pour le cancer gastrique par l'Agence internationale pour la recherche sur le cancer de l'Organisation mondiale de la Santé.

Le cancer gastrique est l'un des types les plus communs de cancers, et plus de 70% des nouveaux cas et des décès surviennent dans les pays en développement [3]. Bien que le taux d'incidence global est en baisse depuis plusieurs décennies, le cancer gastrique reste répandue dans la plupart des pays en développement, y compris le Japon, la Corée et la Chine [4-6]. En 2012, le rapport annuel du Registre du cancer chinois a indiqué que la morbidité du cancer gastrique et la mortalité sont deuxième et troisième parmi toutes les tumeurs malignes, respectivement.

La majorité des H
. pylori
souches portent le cag
îlot de pathogénicité ( cag
PAI), qui contient 27 à 31 gènes qui codent pour un système bactérien de sécrétion de type 4 (T4SS) [7] . Le gène associé à la cytotoxine un gène ( cagA
), qui est située à l'extrémité 3 ' cag
PAI, code pour l'oncoprotéine bactérienne connue uniquement, CagA, qui est transporté dans des cellules hôtes par T4SS après la fixation des bactéries à l'estomac. A l'intérieur des cellules hôtes, CagA est la tyrosine phosphorylée par les membres de la famille de la kinase Src et Abl et interagit avec de nombreux effecteurs intracellulaires, conduisant à l'activation de molécules de signalisation en aval [8]. Dans les études cliniques, souches -positif de cagA ont été constamment liée à l'inflammation et des ulcères gastriques plus sévère, et une petite fraction des individus de développer un cancer gastrique [9]. Cependant, les mécanismes sous-jacents à l'association des CagA avec le cancer n'a pas été élucidé.

Proteomics a émergé comme une plate-forme technologique prometteuse pour l'identification rationnelle de biomarqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies et la détermination des mécanismes sous-jacents de cancérogenèse [10]. Cependant, la plupart des protéines importantes détectées par la protéomique in vitro ont pas été confirmée in vivo dans des échantillons cliniques.

méthylation de l'ADN et la déméthylation joue un rôle important dans le développement et la progression des cancers en bloquant la liaison des facteurs de transcription à l'ADN et est produit presque exclusivement dans le promoteur du gène îlots CpG [11-13]. Parmi les organes, l'estomac présente la plus haute fréquence de méthylation de l'îlot CpG anormale, peut-être H
. pylori
médiée [14-16]. Bien que les études de méthylation de l'ADN augmentent, les états de méthylation des gènes induits par H
. pylori
ne sont pas encore claires.

Dans ce travail, nous avons cherché à identifier les protéines spécifiques liées à H
. pylori
infection en utilisant protéomique comparative et de caractériser l'expression des gènes et la méthylation CpG île de ces protéines dans les tissus de cancer gastrique et des cellules.

tissus humains Matériel et méthodes

Les tissus humains ont été obtenus à partir d'échantillons de chirurgie de 30 patients atteints de cancer gastrique et appariés tissus cancéreux adjacents et les ganglions lymphatiques métastatiques au Hospital Medical Guiyang, Guiyang Chine, entre Janvier 2009 et Juin 2010. Les diagnostics ont été confirmés par deux pathologistes. Parmi les patients, 23 étaient des hommes, et 7 étaient des femmes. Les patients étaient âgés de 38 à 77 ans. Vingt-deux patients avaient-type intestinal adénocarcinome, et 8 avait-type diffus adénocarcinome. Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'éthique de l'hôpital médical Guiyang, et tous les sujets prévus consentement éclairé écrit.

culture
Cell

La gastrique lignée cellulaire de carcinome humain AGS (ATCC CRL-1739TM) et cellules SGC-7901 ont été achetés directement auprès de American type Culture Collection (ATCC) et la banque de cellules de type Culture Collection de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine), respectivement, et repiquées pendant moins de 3 mois dans notre laboratoire après réception. Les cellules ont été cultivées dans Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640 milieu additionné de 10% de sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur, 100 U /ml de pénicilline et 100 pg /ml de streptomycine (Gibco, Grand Island, NY, USA) à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO _2.

H
. pylori
culture

H
. souche pylori
NCTC11637 (ATCC 43504, un don du Centre chinois de Helicobacter pylori
Gestion de la souche et la conservation, Beijing, Chine), qui est cagA
positif, a été cultivées dans un milieu sélectif sur une plaque de gélose Columbia contenant 10% de sérum de veau foetal et H
. pylori
supplément sélectif (Oxoid Ltd, Angleterre) à 37 ° C dans des conditions de microaérobiose.

infection cellulaire avec H
. pylori

AGS et des cellules SGC-7901 (5 × 10 ^{5) ont été ensemencées dans des plaques 6 puits pendant 24 h et infectés par H
. pylori
pendant 6 h et 12 h à des multiplicités d'infection (MOI) différentes de 1: 100, 1: 500 et 1: 1000, respectivement. Les cellules ont été infectées pendant 12 h à une MOI de 1: 1000 avec H
. pylori
bouillir pendant 15 min en tant que témoins.}

Construction du vecteur pcDNA3.1 d'expression / cagA

ADN a été extrait de H
. pylori
, et la pleine longueur cagA
séquence a été synthétisé par PCR et clone dans pMD18-T des plasmides pour construire pMD18-T / cagA
. Le gène cagA de a été identifié par séquençage (GQ161098). pMD18-T / cagA
a été digéré par les enzymes de restriction Pst
I et Bam
HI, et cagA
a été ligaturé dans pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, USA) pour construire le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3.1 / cagA
. Les séquences des amorces sont fournies dans le tableau 1.

Cellule transfection avec pcDNA3.1 / cagA

cellules SGC-7901 ont été incubées pendant 12 h à 6 puits des plaques pour obtenir 80% de cellules confluentes. Les cellules ont ensuite été transfectées selon les instructions du fabricant. Au bout de 48 h, les cellules ont été divisées 1:10 dans de nouvelles plaques à 6 puits et incubées pendant 24 h supplémentaires, puis maintenues dans sélectif contenant de la zéocine (250 pg /mL) moyenne standard pendant 2 semaines, jusqu'à la formation de clones. Les cellules transfectées avec le vecteur vide pcDNA3.1 /Zeo (-) ont été utilisés comme témoins

extraction de protéines et western blot

Des extraits protéiques ont été préparés par la remise en suspension des culots cellulaires dans un tampon RIPA ou homogénéisant 200. tissus mg dans un tampon RIPA. Un total de 30-50 pg d'extrait de protéine a été soumis à une électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, transférés à un polyfluorure de vinylidène (PVDF) membrane (Millipore, Billerica, MA, USA) et épongé nuit avec anticorps monoclonal de souris anti-CagA (1: 800, SC-28368), anticorps monoclonal de souris anti-phosphotyrosine (PY99, 1: 300, sc-7020), anticorps polyclonal de lapin anti-bêta-actine (1: 500, ab189073), anticorps polyclonal de lapin anti-LDH (1: 350 , ab125683), anticorps monoclonal de souris anti-DLD (1: 800, SC-376890), polyclonal de lapin anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), anticorps monoclonal de souris anti-ATP anticorps synthase (1: 300, ab54880), polyclonal de lapin anti -calmoduline anbody (1: 250, ab208911), anticorps polyclonal de lapin anti-RanGAP (1: 200, ab92360), anticorps polyclonal de lapin anti-p64CLCP (1: 300, ab28722), anticorps polyclonal de lapin anti-calréticuline (1: 350, ab4) et de l'anticorps déshydrogénase monoclonal de souris anti-glycéraldéhyde-3-phosphate (GAPDH, 1: 8000) de Santa Cruz (CA, USA), Abcam (Cambridge, Royaume-Uni) et CangChen (Shanghai, Chine), respectivement, dans 5% BSA dans une solution saline tamponnée au Tris et 0,01% de Tween-20. anticorps conjugué à la peroxydase secondaire (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, USA) ont été utilisés et développés avec l'ECL réactif de chimioluminescence Plus en utilisant hyperfilm (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Royaume-Uni). Quantification des western blots a été réalisée en utilisant un logiciel Quantité. Chaque expérience a été effectuée 3 fois, et un résultat représentatif est montré.

L'extraction des protéines et électrophorèse bidimensionnelle sur gel

Les culots cellulaires ont été dissous dans un tampon de lyse cellulaire pendant une nuit à 4 ° C, et la protéine a été précipité avec trois volumes d'acétone glacée par incubation à 4 ° C pendant 2 h. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 20.000 tpm pendant 30 minutes et les culots ont été remis en suspension dans du tampon de lyse cellulaire et stockées à 4 ° C jusqu'au lendemain.

Un total de 800 pg de protéine a été ajustée à un volume de 250 ul avec une solution de réhydratation, et une focalisation isoélectrique (IEF) a été réalisée en utilisant un système Ettan IPGphor II isoélectrofocalisation (Amersham Biosciences) selon les instructions du fabricant. Le protocole de IEF était de 300 V for1 h, 500 V pendant 2,5 h, 1 000 V pendant 2 h; 8000 V pendant 8 h, 60 KVH (au total).

Après avoir terminé l'IEF, les bandes IPG (Amersham Biosciences) ont été équilibrées dans un tampon d'équilibration pendant 15 minutes et placé sur un gel SDS-PAGE à 12% pour les deux électrophorèse bidimensionnelle à 30 mA /gel. Le gel SDS-PAGE résultant a été fixé dans TCA à 20% pendant 30 min, puis colorées avec Coomassie colloïdal G-250 [5].

Les taches de protéines sur le gel ont été numérisées et analysées automatiquement. taches de protéines différentiellement exprimées ont été confirmés par imagerie 2D Maître 5.0 logiciel d'analyse (Amersham Biosciences). Le test t de Student a été réalisé pour l'analyse quantitative des gels 2D. L'expression différentielle d'une protéine spécifique a été définie comme un changement de ≥2 fois la densité optique spot entre les deux ensembles appariés en doublons. Les taches différentielles ont ensuite été excisés à partir des gels de SDS-PAGE pour une identification supplémentaire par LC-MS /MS.

Extraction d'ARN et RT-PCR quantitative

ARN total a été extrait de 50 mg de tissu et traité avec de la DNase I (RNase). Les gènes ont été amplifiés avec SYBR Green (Applied Biosystems, Australie). Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase ( HPRT
) a été utilisé comme témoin de normalisation, et les niveaux d'ARNm relatifs ont été calculés par un _{méthode de t en utilisant Step-un logiciel comparatif C (Applied Biosystems, Australie) [8]. Chaque échantillon a été analysé en triple exemplaire et les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± écart-type. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 1.}

extraction de l'ADN et l'analyse de la méthylation des îlots CpG

ADN a été isolé à partir de cellules et modifié avec du bisulfite de sodium en utilisant un EZ DNA Kit méthylation-Gold ^{™ (Zymo Research, CA, USA) selon les instructions du fabricant. Promotrices ilôts CpG ont été prédits en utilisant le logiciel de méthyle Primer Express et amplifiés à partir d'ADN au bisulfite a été modifiée par PCR en utilisant les procédures suivantes: dénaturation à 96 ° C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 40 secondes, annelage à 60 ° C pendant 40 s et allongement à 72 ° C pendant 40 secondes, avec une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. Les produits de PCR amplifiés ont été clones dans pMD19-T des vecteurs et séquences. En outre, l'ADN isolé à partir de tissus tumoraux a été utilisée pour détecter H
. pylori
16S ARNr de gène et cagA
gène. Les séquences d'amorces sont énumérées dans le Tableau 2.}

L'analyse statistique

Les résultats sont exprimés en tant que moyen ± SD. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SPSS 15.0. analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et le test t de Student ont été utilisés pour analyser les données. P
<. 0,05 (recto-verso) était considérée comme significative

Résultats

Introduction de CagA dans les cellules de cancer gastrique

Parce que CagA de H
. pylori
est un facteur de virulence essentiel dans le développement et la progression du cancer gastrique, CagA a été détecté dans l'estomac des lignées de cellules de cancer par RT-PCR et Western blot après infection de SGC-7901 et les cellules AGS avec H
. pylori
et transfection de cellules SGC-7901 avec cagA
-vector. La protéine CagA a commencé à apparaître dans un rapport de cellules à des bactéries de 1: 500 dans des cellules cultivées à 6 h, et le contenu est le plus élevé à un rapport de 1: 1000 à 6 heures (figure 1A et 1B). Cependant, CagA phosphorylée a été observée dans les cellules à un rapport de 1: 500 après la mise en culture pendant 12 h, et le contenu le plus élevé a été observé dans les cellules à un rapport de 1: 1000 après 6 h de culture. CagA ARNm et la protéine ont également été observées dans de manière stable cagA
-overexpressing cellules SGC-7901 (figure 1C et 1D). Ces données suggèrent que CagA a été introduit avec succès dans les trois lignées cellulaires, et phosphorylée.

Identification des protéines différentielles dans les cellules cancéreuses gastriques

Après que les cellules ont été infectées avec H
. pylori
pendant 6 h à une MOI de 1: 1000 ou transfectées avec cagA de la -vector, une technique protéomique a été utilisé pour créer six électrophorèse bidimensionnelle (2-dE) Cartes des trois lignées cellulaires et leurs témoins respectifs (figure 2), et 135 points différentiels ont été détectés, dont 73 ont été régulés à la hausse et 62 ont été régulés à la baisse. Dix différentiel voit commune à tous les trois lignées cellulaires ont été identifiés par LC- MS /MS et vérifiées par western blot, dont 6 protéines régulés à la hausse: ß-actine, LDH, DLD, PRPF19, ATP synthase et la calmoduline (CaM), et 4 protéines down-réglementés tels que RanGAP, p64 CLCP, P43 et calréticuline (tableau 3 et la figure 3A).

H
. infection pylori
favorise l'expression des protéines différentielles dans les tissus de cancer gastrique

Comme H
.
pylori colonise l'estomac humain de manière sélective pour activer un ensemble de processus pathologiques, l'expression des gènes de 10 protéines différentielles dans les 30 échantillons de cancer gastrique humain a été évaluée par RT-PCR quantitative. Parmi les 10 gènes, l'expression de β-actine
, LDH
, DLD
, PRP19
et CaM
dans cancers gastriques et /ou ganglions métastatiques ont été régulée à la hausse par rapport aux tissus péri-cancéreuses, tandis que l'expression de RanGAP
a été régulée à la baisse. De manière similaire, les 6 protéines ont également été anormalement exprimés dans les mêmes tissus (figure 3B et 3C). Aucune différence significative dans l'expression des autres gènes ont été observées.

H
. pylori
la colonisation dans les tissus de cancer gastrique a été mesurée en détectant les 16S ARNr de gène et cagA
gène de H
. pylori
par PCR. H
. pylori
était présent dans 20 des 30 échantillons (taux positif de 67%), et l'ensemble de H
. pylori
souches sont cagA
positif. Les taux d'ARNm de β-actine
, LDH
, DLD
, PRP19 et CaM
étaient plus élevés dans H
. pylori
tissus -positifs que dans les échantillons négatifs (figure 3D).

H
. pylori
induit aberrante la méthylation de l'ADN dans les cellules cancéreuses gastriques

Dans trois lignées cellulaires, les produits de PCR des îlots CpG des gènes ci-dessus ont été acquis avec succès après un traitement bisulfite et séquencés. Dans ces gènes, LDH
, DLD
et Les gènes de CaM ont été déméthylation au niveau du promoteur -2325, -1885 et -276 des sites, respectivement, et le le gène RanGAP de a été fortement méthylé au niveau du promoteur -570 et -170 sites (figure 4).

Discussion

preuves accumulative indique que H
. infection pylori
est un facteur important pour H
. pylori
-Associated maladies gastriques et que CagA est un facteur favorisant le cancer gastrique [17,18]. On a construit trois lignées cellulaires expérimentales, y compris deux lignées de cellules de cancer gastrique infectées avec H
. pylori
( cagA
^{+) et une lignée cellulaire de cancer gastrique surexprimant cagA
, et a déterminé que CagA a commencé à apparaître dans les cellules 6 h après l'infection et pour jusqu'à 12 h. Par la suite, CagA phosphorylée a commencé à apparaître, en accord avec l'injection et la phosphorylation ultérieure de CagA dans les cellules épithéliales gastriques par le T4SS de H
. pylori
après infection de la muqueuse gastrique humaine. Phosphorylée CagA active des voies de signalisation en aval et joue un rôle pathologique. Nous avons également observé CagA dans les cellules transfectées de façon stable avec le cagA
-vector. Ces données confirment la construction réussie des trois lignées cellulaires expérimentales.}

Proteomics a été utilisé pour étudier la relation entre H
. infection pylori
et des maladies gastriques, et de nombreuses protéines différentiellement exprimés ont été identifiés [19-22]. Cependant, l'association de ces protéines avec CagA et leur expression dans les tissus cancéreux gastriques humaines restent peu claires. Nous avons obtenu un total de 135 points différentiels des trois lignées cellulaires, dont 73 ont été régulés à la hausse et 62 ont été régulés à la baisse. Dix points différentiels sont communs à toutes les trois lignées cellulaires, y compris 6 régulés à la hausse des protéines (β-actine, LDH, DLD, PRP19, ATP synthase et CaM) et 4 protéines down-régulés (p64 CLCP, RanGAP, P43 et calréticuline) , l'expression et les 10 protéines ont été vérifiées par western blot dans ces lignées cellulaires. Ces protéines sont impliquées dans le métabolisme énergétique, le réarrangement squelette, le traitement pré-ARNm, la transduction du signal, et d'autres protéines étroitement associés au développement et à la progression de nombreux cancers humains [23,24]. Nous quantitativement détecté l'expression des gènes codant pour ces 10 protéines dans les tissus de cancer gastrique de l'homme, qui a révélé que β-actine
, LDH
, DLD
, PRP19
et CaM
étaient toujours fortement exprimés et RanGAP
a été mal exprimé dans les deux tissus cancéreux et /ou les ganglions lymphatiques métastatiques par rapport aux tissus péri-cancéreuses. L'expression aberrante de ces protéines a également été vérifiée par Western Blot dans le cancer gastrique et les ganglions lymphatiques métastatiques. Ensuite, nous avons constaté que cagA
^{+ H
. pylori
colonisées dans 20 des 30 tissus de cancer gastrique et promus ou inhibé l'expression de ces gènes in vivo.}

LDH et DLD sont étroitement corrélées avec le métabolisme énergétique. Un trouble du métabolisme énergétique est considérée comme un facteur important pour le développement et la progression du cancer. Contrairement aux cellules normales, les cellules cancéreuses présentent une dépendance accrue de la glycolyse avec suffisamment d'oxygène, dite glycolyse aérobie. Une grande quantité d'acide pyruvique, d'un produit final de la voie, est converti en acide lactique par la LDH, de la promotion de la voie glycolytique et le déséquilibre du métabolisme énergétique [25]. L'acide lactique peut également diminuer le pH du microenvironnement cellulaire, augmentant ainsi la réponse néovasculaire à des facteurs d'angiogénèse pour favoriser la métastase des cellules tumorales [26,27]. Conformément à nos résultats, LDH
a été fortement exprimée dans les tissus cancéreux dans 61,8% des patients atteints de cancer gastrique; les patients atteints de LDH surexpression avaient une survie plus courte par rapport aux patients avec une faible expression [28]. Kim et al
. [29] ont observé que l'expression de DLD augmente avec la progression de la tumeur, permettant ainsi plus d'énergie pour la croissance des cellules tumorales. Par conséquent, une forte expression de la LDH et DLD est un facteur crucial pour le développement et la progression du cancer de l'estomac, et H
. infection pylori
favorise l'expression de ces deux gènes dans les tissus de cancer gastrique.

Beta-actine, un élément clé du cytosquelette, maintient la structure, le mouvement et la division des cellules dans des conditions normales. β-actine
est anormalement exprimé dans de nombreuses maladies [30]. La protéine PRPF19 est censé fonctionner en pré-épissage de l'ARNm. Ubiquitination de PRPF19 pourrait conduire à des dommages de l'ADN et la réparation de l'ADN anormal est une cause importante de la tumorigenèse [31]. Calmoduline est une protéine liant le calcium qui régule de nombreuses voies de signalisation et participe à la prolifération cellulaire, la mitose et la transcription du gène ainsi. Calmoduline favorise la prolifération cellulaire dans les cancers du foie, en combinaison avec la PI3K et la transition de G1 à la phase S, en combinaison avec la cycline E [32]. Un inhibiteur de cellules arrestations de calmoduline en phase G1 pour inhiber la division cellulaire [33]. Conformément à ces résultats, nous avons déterminé que H
. pylori
peut participer au développement du cancer des tissus gastriques en induisant l'expression élevée de ces trois protéines.

De plus, nous avons observé une régulation négative de la RanGAP
gène dans tissus cancéreux avec H
. infection pylori
. RanGAP est une protéine GTPase d'activation. Après hydrolyse du GTP en GDP par une GTPase, RanGTP actif devient inactif RanGDP, ce qui conduit au blocage de la signalisation pour inhiber la progression du cancer [34] cellule. De même, une diminution de l'activité RanGAP induite par ubiquitination favorise le développement du cancer [35].

méthylation de l'ADN peut induire l'expression du gène anormal. H
. infection pylori
augmente les niveaux de certains gènes et les résultats de méthylation dans la carcinogenèse de la muqueuse gastrique [36,37]. Méthylation de l'ADN apparaît habituellement dans les îlots CpG de promoteurs de gènes. Nous avons détecté l'état de méthylation des îlots CpG de ces gènes dans les lignées cellulaires construites et déterminé que le LDH
, DLD
et Les gènes de CaM ont été déméthylation au niveau du promoteur -2325, -1885 et -276 des sites, respectivement, et le gène RanGAP de a été fortement méthylés au niveau du promoteur -570 et -170 sites compatibles avec l'expression élevée de la LDH
, DLD
et CaM
gènes et la faible expression de la RanGAP
gène dans les tissus de cancer gastrique avec cagA
^{+ H
. pylori
infection.}

En conclusion, ces résultats suggèrent que H
. infection pylori
, via CagA translocation, peut induire la méthylation aberrante de ces gènes pour conduire à l'expression du gène dysfonctionnel dans les tissus et les cellules de cancer gastrique. Nos résultats fournissent une nouvelle compréhension de la pathogenèse moléculaire du cancer gastrique avec H
. infection pylori
. Les études futures examineront les effets de ces modèles de méthylation modifiés sur la pathogenèse du cancer gastrique dans des échantillons cliniques.

Remerciements

Nous remercions le Centre chinois de Helicobacter pylori
souche de gestion et la conservation pour fournir H
. pylori
NCTC11637 et le Dr Yang Wenxiu et Wu Jiahong pour l'assistance technique.

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