PLoS ONE: Proteomika-identifikavimas ir analizė baltymų susijęs su Helicobacter pylori skrandžio vėžio

Anotacija

Helicobacter pylori
( O
. pylori
) yra spiralės formos gramneigiamų bakterijų, kuri sukelia labiausiai paplitusių lėtinių infekcija žmogaus skrandžio. Maždaug 1% -3% užkrėstų asmenų plėtoti skrandžio vėžiu. Tačiau mechanizmų, kuriuos H
. pylori
skatina skrandžio vėžio nėra iki galo suprantamas. Turima informacija rodo stiprų ryšį tarp virulentiškumo faktorius H
. pylori
, citotoksinas susijęs genas A (CagA) ir skrandžio vėžys. Norėdami papildomai apibūdinti H
. pylori
virulentiškumo, mes sukūrėme tris ląstelių linijas užkrėsti skrandžio vėžio ląstelių linijas SGC-7901 ir AGS su CagA
^{, +
O
. pylori parsisiųsti ir transfekuoja SGC-7901 su vektoriumi, turinčiu visą ilgį CagA
genų. Mes nustatėme, 135 skirtingai išreikštas baltymų iš trijų ląstelių linijų, naudojančių proteomos technologiją ir 10 diferencialinės baltymus bendrus trijų ląstelių linijų buvo atrinkti ir nustatyti LC-MS /MS taip pat tikrina Vakarų dėmė: beta-aktino, L-laktato dehidrogenazės (LDH), dihydrolipoamide dehidrogenazės (DLD), iš anksto iRNR apdorojimo veiksnys 19 homologą (PRPF19), ATP syntazės, kalmodulino (CAM), 64 psl CLCP, bėgo konkrečių GTPase įsijungiantis baltymo (RanGAP), P43 ir calreticulin. Aptikta šių baltymų ir genų, koduojančių šiuos baltymus į žmogaus skrandžio vėžio audiniuose realaus laiko PGR (RT-qPCR) ir Vakarų dėmė išraiška parodė, kad , β-aktino
LDH DLD
PRPF19 parsisiųsti ir Vaizdo
genai buvo iki reguliuojama ir RanGAP
buvo žemyn reguliuoja skrandžio vėžio audiniuose ir /arba metastazavusiu limfmazgiai palyginti su užmiesčio vėžiniai audiniuose. Aukštos genų ekspresijos buvo pastebėta H
. pylori
infekcija skrandžio vėžio audiniuose. Be to, LDH
DLD parsisiųsti ir Vaizdo
genai buvo demetilinamas tuo promotoriaus -2325, -1885 ir -276 svetainėse, atitinkamai, ir RanGAP
genas buvo labai denatūruotas tuo promotoriaus -570 ir -170 svetainių H
. pylori
-infected ir CagA
-overexpressing ląsteles. Šie rezultatai suteikia naujų įžvalgų į molekulinės patogenezę ir gydymo tikslų skrandžio vėžio su H
. pylori
infekcija}

nurodomoji dalis:. Zhou J Wang W Xie Y Zhao Y Chen X Xu W et al., (2016) Proteomika-identifikavimas ir analizė Baltymai Asocijuotas su Helicobacter pylori
skrandžio vėžio. PLoS ONE 11 (1): e0146521. Doi: 10,1371 /journal.pone.0146521

redaktorius: Hiromu Suzuki, Saporas medicinos universitetas, Japonija

Įstojo: rugsėjo 15, 2015; Priimtas 19. Gruodis, 2015 m Paskelbta: Sausis 8, 2016

Visos teisės saugomos: © 2016 Zhou et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. Visa reikalinga duomenys neviršija popieriaus

finansavimas:. darbas parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (81260303, 31560326), Guizhou provincija fondas ([2014] QianJiaoHe 06) ir pagrindiniai projekto mokslo ir technologijų Guizhou provincija (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). Originalioje versijoje, darbas parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (81260303, 31560326) ir pagrindiniai projekto Mokslo ir technologijų Guizhou provincijoje (QianKeHe SY (2011) 3067)

konkuruojančių interesų. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja.

Įvadas

Helicobacter pylori
( O
. pylori
) sukelia labiausiai paplitusi lėtinė skrandžio infekcija žmonėms visame pasaulyje. Maždaug pusė pasaulio gyventojų yra užsikrėtę H
. pylori
, o kolonijos individų dauguma plėtoti besimptomį gastritas. Tarp užsikrėtusių asmenų, maždaug 10% -20% asmenų plėtoti pepsinė opa ligų ir 1% -3% plėtoti skrandžio vėžiu [1,2]. 1994 O
. pylori
buvo klasifikuojamas kaip I tipo kancerogenas skrandžio vėžio Pasaulio sveikatos organizacijos Tarptautinės agentūros vėžio tyrimų.

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių rūšių vėžio, ir daugiau nei 70% naujų atvejų ir mirčių įvyksta besivystančiose šalyse [3]. Nors pasaulinė dažnis mažėjo kelis dešimtmečius, skrandžio vėžys tebėra paplitusi daugelyje besivystančių šalių, įskaitant Japoniją, Pietų Korėja ir Kinija [4-6]. 2012 metais, Kinijos vėžio registras metinis pranešimas parodė, kad skrandžio vėžys sergamumas ir mirtingumas yra antra ir trečia tarp visų piktybinių navikų, atitinkamai.

ir H
dauguma. pylori
padermių nešti PVG
patogeniškumo salą ( PVG
PAI), kuriame yra nuo 27 iki 31 genų, kurie koduoja bakterijų 4 tipo sekrecijos sistemos (T4SS) [7] , Citotoksinas susijęs genas geną ( CagA
), kuris yra įsikūręs ties 3 'galo PVG pervežimas PAI, koduoja tik žinoma bakterijų oncoprotein, CagA, kuri yra pernešami į šeimininko ląsteles iki T4SS po bakterinės tvirtinimo prie pilvo. Kai šeimininko ląsteles viduje, CagA yra tirozino fosforilinamos nariai Abl ir Src kinazės šeimoms ir bendrauja su daugeliu ląstelėje vykdomuosius, todėl į tolesniems signalinės molekulės aktyvavimo [8]. Klinikinių tyrimų metu, CagA
-positive padermės buvo nuosekliai susijęs su sunkesne skrandžio uždegimas ir opos, o maža dalis asmenų plėtoti skrandžio vėžiu [9]. Tačiau mechanizmai, kuriomis remiantis CagA asociacijos vėžio neišaiškintas.

Proteomika tapo perspektyviu technologinės platformos racionalaus identifikuoti biologinius žymenis ir naujų terapinių tikslų ligų ir pagrindinių mechanizmų nustatymo Kancerogeninis poveikis [10]. Tačiau dauguma iš svarbiausių aptiktų proteomikos in vitro baltymų nebuvo patvirtintas atliekant in vivo klinikinių mėginių.

DNR metilinimas ir demetilinimu vaidina svarbų vaidmenį kuriant ir progresavimo vėžio blokuoja transkripcijos veiksnių privalomas DNR ir įvyksta beveik išimtinai geno promotoriaus CpG salomis [11-13]. Tarp organų, skrandžio eksponuoja didžiausią dažnį nenormalus CpG salos metilinimo, galbūt O pervežimas. pylori
sąlygojamą [14-16]. Nors tyrimai DNR metilinimo didėja, geno metilinimo narės sukeltą H
. pylori
dar nėra aišku.

Šiame darbe siekėme nustatyti konkrečius baltymus, susijusias su H
. pylori
infekcija naudojant lyginamuosius proteomikoje ir charakterizuoti genų ekspresiją ir CPG sala metilinimas šių baltymų skrandžio vėžio audiniuose ir ląstelėse.

Medžiagos ir metodai

Žmogaus audinių

Žmogaus audiniai buvo gauti iš chirurgijos pavyzdžius iš 30 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams ir suderinti gretimų vėžio audiniuose ir metastazavusiu limfmazgiai ne Guiyang medicinos ligoninė, Guiyang, Kinija, nuo 2009 sausio ir 2010 metų birželio diagnozės buvo patvirtintos dvi patologai. Tarp pacientų, 23 buvo vyrai ir 7 buvo moterys. Pacientai amžius svyravo nuo 38 iki 77 metų. Dvidešimt dviejų pacientų žarnyno tipo adenokarcinoma ir 8 buvo išplitęs tipo adenokarcinoma. Tyrimo protokolas buvo patvirtintas etikos komiteto Guiyang Medicininės ligoninių, ir visi dalykai pateikiami raštiški informuoti sutikimą.

Mobilusis kultūra

žmogaus skrandžio karcinoma ląstelių linija "AGS (ATCC BEL-1739TM) ir SGC-7901 ląstelės buvo įsigyti tiesiogiai iš Amerikos tipas kultūros kolekcijos (ATCC) ir ląstelių bankas tipas kultūros kolekcijos Kinijos mokslų akademijos (Šanchajus, Kinija), atitinkamai, ir passaged mažiau nei 3 mėnesius mūsų laboratorijoje po gavimo. Ląstelės buvo auginamos Ruzvelo Park Memorial instituto (RPMI) 1640 terpėje, papildytoje 10% šilumos-inaktyvuota vaisiaus galvijų serumo, 100 V /ml penicilino ir 100 mikrogramų /ml streptomicino (Gibco, Grand Island, NY, JAV), esant 37 ° C temperatūroje, drėgnoje inkubatorius su 5% CO _2.

O
. pylori
kultūra

O
. pylori
padermės NCTC11637 (ATCC 43.504, dovana iš Kinijos centras, Helicobacter pylori
padermės valdymas ir saugojimas, Pekinas, Kinija), kuris yra CagA
teigiamas, buvo auginami selektyvios terpės dėl Kolumbijos agaro, esančio lėkštelėje, turinčio 10% serumas iš veršiuko embriono ir H
. pylori
Selective priede (Oxoid Ltd ", Anglija) esant 37 ° C pagal microaerobic sąlygomis.

Mobilusis infekcija H
. pylori

AGS ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląsteles (5 × 10 ^{5) buvo sėjamos 6-duobučių lėkštelėse 24 val ir užsikrėtę H
. pylori
6 val ir 12 h, kai daugiskaitos infekcijos (Mõis) 1: 100, 1: 500 ir 1: 1000, atitinkamai. Ląstelės buvo užsikrėtę 12 valandų esant 1 MOI: 1000 su H
. pylori
virti 15 min, kaip kontrolei.}

Statybos ekspresijos vektorius pcDNA3.1 / CagA

DNR buvo išskirta iš H
. pylori
ir pilnametražis CagA
seka buvo susintetintas PGR ir klonuotas į pMD18-T plazmidžių statyti pMD18-T / CagA
. CagA
genas buvo identifikuojama sekos (GQ161098). pMD18 T / CagA
buvo restrikcijos fermentų Pst
I ir Bam
HI ir CagA
buvo susiūta į pcDNA3.1 /ZEO (-) (Invitrogen, JAV) statyti eukariotinių ekspresijos vektorius pcDNA3.1 / CagA
. Pradmenų sekos yra pateikta 1 lentelėje

Mobilusis transfekcija su pcDNA3.1 / CagA

SGC-7901 ląstelės inkubuojamos 12 h 6-gerai plokštės gauti 80% Susiliejančio ląsteles. Po to ląstelės buvo transfekuota pagal gamintojo instrukcijas. Po to, kai 48 h, ląstelės buvo suskirstyti 1:10 į naujų 6-duobučių lėkštelėse ir inkubuojami už papildomą 24 h ir to palaikomas pasirinktinio zeocin, kurių sudėtyje yra (250 mikrogramų /ml) standartinio terpėje 2 savaites, kol klonas formavimas. Ląstelės Transfekuoti su tuščiu vektoriaus pcDNA3.1 /Zeo (-) buvo naudojami kaip kontrolės

Baltymai gavybos ir Vakarų dėmė

baltymo ekstraktai rengė suplakti ląstelių granules į Ripa buferio arba suliejant 200. mg audinių į Ripa buferį. 30-50 mikrogramų baltymų ekstrakto, kad bendras buvo atliktas ant SDS-PAGE gelyje, perkeltas į polivinilideno difluoridas (PVDF) membranos (Millipore, BILLERICA, MA, JAV) ir pernešama per naktį su pelių monokloninius anti-CagA antikūno (1: 800, SC-28368), pelės monokloninis anti-fosfotirozino antikūnas (PY99, 1: 300, SC-7020), triušių polikloninis anti-beta aktino antikūnas (1: 500, ab189073), triušių polikloninis anti-LDH antikūnas (1: 350 , ab125683), pelės monokloninis anti-DLD (1: 800, SC-376890), triušių polikloninis anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), pelės monokloninis anti-ATP sintazė antikūnas (1: 300, ab54880), triušių polikloninis kovos -calmodulin anbody (1: 250, ab208911), triušių polikloniniu anti-RanGAP antikūnų (1: 200, ab92360), triušių polikloniniu anti-p64CLCP antikūnų (1: 300, ab28722), triušių polikloniniu kovos su calreticulin antikūnų (1: 350, AB4) ir pelės monokloninis anti-gliceraldehido-3-fosfato -dehydrogenase antikūnas (GAPDH, 1: 8000) iš Santa Cruz (CA, JAV), Abcam (Kembridžas, Jungtinė Karalystė) ir CangChen (Šanchajus, Kinija), atitinkamai 5% BSA Tris-buferiniame valgomosios druskos tirpale ir 0,01% Tween-20. Peroksidazės konjuguoto antriniai antikūnai (1: 5000, SC-2371, Santa Krusas, Kalifornija, JAV), buvo naudojami ir išryškintos su chemiluminescencja reagento ECL Plius naudojant Hyperfilm (Amersham biomokslai, Buckinghamshire, Jungtinė Karalystė). Kiekybinis Vakarų dėmės buvo atliekama naudojant kiekį One "programinė įranga. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas 3 kartus, ir atstovas rezultatas yra parodyta.

Baltymų gavybos ir dviejų dimensijų elektroforezės gelyje

Mobilaus ryšio granulės buvo ištirpinta ląstelių lizės buferiniame tirpale per naktį 4 ° C, ir baltymų nusodinama su trimis apimtis ledinio acetono, inkubuojant, esant 4 ° C temperatūroje 2 val. tada mėginiai buvo centrifuguojamas 20.000 apsisukimų per minutę 30 min, ir kad granulės buvo resuspenduotos ląstelių lizės buferiniame tirpale ir saugomi 4 ° C temperatūroje per naktį.

800 mikrogramų baltymų, kad bendras buvo nustatomas taip, kad 250 pL tūrio su rehidratavimo tirpalu ir Izoelektrinis fokusavimas (ief) buvo atliktas naudojant Ettan IPGphor II Izoelektrinis fokusavimas sistemą (Amersham biomokslų) pagal gamintojo instrukcijas. Už ŠNED protokolas buvo 300 V for1 h 500 V, 2,5 h, 1000 V 2 val; 8000 V 8 h 60 KVH (iš viso).

Baigęs ief, kad VVG juostos (Amersham biomokslų) buvo pusiausvyroje ir išlyginimo buferio 15 min ir ant 12% SDS-PAGE gelyje nustatyto dviračių matmenų elektroforezės esant 30 mA /geliu. Gautas SDS-PAGE Gelis fiksuojamas 20% TBS 30 min ir vėliau yra nudažomi su koloidinio Coomassie G-250 [5].

baltymų dėmės ant gelio buvo nuskaitomi ir automatiškai analizuojami. Skirtingai išreikšti baltymų dėmės buvo patvirtinta Vaizdo magistras 2D 5.0 ​​analizės programinės įrangos (Amersham Biosciences). Stjudento t-testas buvo atliekamas kiekybinės analizės 2D gelius. Skirtumas išraiška konkretaus baltymo buvo apibrėžiamas kaip ≥ 2 kartus pasikeitimo vietoje optinio tankio tarp dviejų suderintų rinkinių dublikatų. Tuomet diferencialinės dėmės buvo pašalintų iš SDS-PAGE gelyje tolesniam identifikavimui LC-MS /MS.

RNR gavybos ir kiekybinė PGR

Viso RNR išskirta nuo 50 mg audinio ir apdorojimo su DNaze I (RNazės be). Genai buvo papildyta su SYBR Green (Applied Biosystems, Australija). Hipoksantin guanino fosforiboziltransferazės ( HFRT
) buvo naudojamas kaip normalizavimo kontrolės ir santykiniai iRNR kiekis buvo apskaičiuojamas lyginamasis C _{T metodas naudojant "Step-One" programinė įranga (Applied Biosystems, Australija) [8]. Kiekvienas mėginys buvo tiriami trimis egzemplioriais, o rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD. Naudojami gruntai, yra išvardyti 1 lentelėje}

DNR išskyrimas ir metilinimo analizė CpG salos

DNR buvo išskirta iš ląstelių ir modifikuotas natrio bisulfitu naudojant "EZ DNR Metilinimas-Auksinis rinkinys ^{™ (Zymo tyrimų, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Promotorių CpG salos buvo prognozuojama naudojant metilo gruntas Express programinę įrangą ir amplifikuotas iš bisulfito modifikuotas DNR PGR metodu, naudojant šias procedūras: denatūravimo 96 ° C temperatūroje 10 min, po to 40 ciklų denatūravimo 94 ° C temperatūroje 40 sek, atkaitinimo 60 ° C 40 sek, ir pailgėjimo 72 ° C temperatūroje 40 sek, su paskutinį kartą pratęsti 72 ° C temperatūroje 10 min. Amlifikuoti PGR produktai buvo klonuotas į pMD19-T vektorių ir sekos. Be to, DNR, išskirtas iš navikų audiniuose, buvo naudojamas siekiant aptikti H
. pylori
16S rRNR geno
ir CagA
genas. Grunto sekas, yra išvardyti 2 lentelėje}

Statistinė analizė

Rezultatai išreiškiami naudojant ± SD. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SPSS 15.0 programą. Vienpusis dispersinė analizė (ANOVA) ir Stjudento t-testas buvo naudojamas analizuoti duomenis. P
. ≪ 0,05 (dvipusis) buvo laikoma reikšminga

Rezultatai

Įvadas CagA į skrandžio vėžio ląstelių

Kadangi CagA iš O
. pylori
yra kritinis virulentiškumo faktorius kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio, CagA buvo aptiktas skrandžio vėžio ląstelių linijų RT-PGR ir Vakarų dėmė po infekcijos SGC-7901 ir AGS ląstelių su H
. pylori parsisiųsti ir transfekavimas SGC-7901 ląstelių su CagA pervežimas -vector. CagA baltymų, pradėjo pasirodyti esant ląstelių santykis su bakterijų 1: 500 kultūroje ląstelių ne 6 h, ir turinys buvo didžiausias esant santykiu 1: 1000, praėjus 6 h (pav 1A ir 1B). Tačiau, fosforilinto CagA buvo stebimas ląstelių esant santykiu 1: 500 Paauginus 12 h, ir didžiausias kiekis buvo stebimas ląstelių esant santykiu 1: 1000 po 6 h kultūros. CagA iRNR ir baltymų, taip pat pastebėtas stabiliai, CagA
-overexpressing SGC-7901 ląstelių (pav 1c ir 1d). Šie duomenys rodo, kad CagA buvo sėkmingai pristatė į tris ląstelių linijų ir fosforilinarai.

Cheminės diferencialinių baltymų skrandžio vėžio ląstelių

Po ląstelės buvo užsikrėtę O
. pylori
6 val po 1 MOI: 1000 arba perkeltų su CagA
-vector a PROTEOMIKOS technika buvo naudojama siekiant sukurti šeši dvimatis elektroforezė (2-dE) žemėlapiai iš trijų ląstelių linijos ir jų atitinkamos kontrolės (2 pav), ir 135 diferencialo dėmės buvo aptikta, iš kurių 73 buvo iki reguliuojama ir 62 buvo žemyn reguliuojama. Dešimt skirtumas pamatė bendri visiems trims ląstelių linijų buvo identifikuojami pagal LC- MS /MS patikrino Vakarų dėmė, įskaitant 6 iki reguliuojamų baltymų: beta-aktino, LDH, DLD, PRPF19, ATF sintezės ir kalmodulino (CAM), ir 4 žemyn reguliuojamos baltymai, pvz RanGAP, 64 psl CLCP, P43 ir calreticulin (3 lentelė ir pav 3A).

O
. pylori
infekcija skatina diferencialinių baltymų ekspresiją skrandžio vėžio audiniuose

Kadangi, O
. pylori
selektyviai kolonizuoja žmogaus skrandį aktyvuoti patologinių procesų rinkinys, genų ekspresijos 10 diferencialinių baltymų 30 žmogaus skrandžio vėžio mėginiuose buvo įvertintas kiekybinio RT-PGR. Iš 10 genų, kad , β-aktino
LDH
DLD
PRP19 parsisiųsti ir Vaizdo
išraiška skrandžio vėžio ir /arba metastazavusiu limfmazgiai buvo iki reguliuojama palyginti su užmiesčio vėžiniai audinių, kadangi RanGAP
buvo žemyn reguliuojama išraiška. Panašiai, 6 baltymai buvo taip pat nenormaliai išreiškiami tais pačiais audinių (pav 3b ir 3c). nepastebėta jokių reikšmingų skirtumų tarp kitų genų ekspresiją.

O
. pylori
kolonizacija skrandžio vėžio audiniuose buvo matuojamas nustatant 16S rRNR geno
ir CagA
genas H
. pylori
PGR. O
. pylori
buvo pateikti 20 iš 30 mėginių (teigiamas kurso 67%), ir visi H
. pylori
atmainos yra CagA
teigiamas. MRNR lygiai beta-aktino
LDH
DLD
PRP19 ir Vaizdo
buvo didesnis H
. pylori
-positive audiniai nei neigiamų mėginių (pav 3D).

O
. pylori
skatina netipiško DNR metilinimas skrandžio vėžio ląstelės

Per tris ląstelių linijų, PGR produktai CpG salų pirmiau genų buvo sėkmingai įgytas po bisulfito gydymo ir sekos. Be šių genų LDH
DLD parsisiųsti ir Vaizdo
genai buvo demetilinamas tuo promotoriaus -2325, -1885 ir -276 svetainėse, atitinkamai, ir RanGAP
genas buvo labai denatūruotas tuo promotoriaus -570 ir -170 svetaines (4 pav).

Diskusijos

Kaupiamasis duomenys rodo, kad H
. pylori
infekcija yra svarbus veiksnys H
. pylori
-associated skrandžio ligas ir kad CagA yra skatinti veiksnys skrandžio vėžiui [17,18]. Mes pastatytas tris eksperimentinius ląstelių linijas, įskaitant du skrandžio vėžio ląstelių linijas, užsikrėtusių H
. pylori
( CagA
^{+) ir skrandžio vėžio ląstelių linija ekspresija, CagA
, ir nustatė, kad CagA ėmė atsirasti ląstelių 6 val po užsikrėtimo ir iki 12 val. Vėliau fosforilinarai CagA ėmė atsirasti, suderinamas su injekcija ir po to fosforilinimo CagA į skrandžio epitelinių ląstelių iki H
T4SS. pylori
po užsikrėtimo žmogaus skrandžio gleivinę. Fosforilinamos CagA aktyvuoja pasroviui signalines kelius ir vaidina patologinį vaidmenį. Mes taip pat pastebėjo, CagA ląstelėse stabiliai transfektuotose CagA pervežimas -vector. Šie duomenys patvirtina sėkmingą statybos trijų eksperimentinių ląstelių linijų.}

Proteomika buvo naudojamas studijuoti tarp H
santykius. pylori
infekcija ir skrandžio ligų, ir daugelis skirtingai išreikšti baltymų buvo nustatyta [19-22]. Tačiau šių baltymų su CagA ir jų raiškos žmogaus skrandžio vėžio audiniuose asociacija lieka neaiški. Gavome 135 diferencialinių dėmės iš trijų ląstelių linijų, iš kurių 73 buvo iki reguliuojamų ir 62 buvo žemyn reguliuojamų viso. Dešimt diferencialinės dėmės buvo bendri visiems trims ląstelių linijų, įskaitant 6 iki reguliuojamų baltymų (beta-aktino, LDH, DLD, PRP19, ATF sintezės ir CAM) ir 4 žemyn reguliuojamos baltymų (64 psl CLCP, RanGAP, P43 ir calreticulin) ir 10 baltymų raiška patikrino Vakarų dėmė šių ląstelių linijų. Šie baltymai dalyvauja energijos apykaitos, skeletas pertvarkymo, iš anksto iRNR apdorojimo, signalo perdavime, ir kiti baltymai glaudžiai susijusi su vystymosi ir progresavimo daugelio žmogaus vėžio [23,24]. Mes kiekybiškai aptiko genų, koduojančių šiuos 10 baltymus žmogaus skrandžio vėžio audiniuose išraišką, kuri atskleidė, kad , β-aktino
LDH
DLD
PRP19 parsisiųsti ir Vaizdo
buvo nuolat labai išreiškė ir RanGAP
buvo prastai išreikšta abiejų vėžio audiniuose ir /arba metastazavusiu limfmazgius lyginant su apylinkių vėžiniai audinio. Netipinė išraiška šių baltymų taip pat buvo patikrintas Vakarų dėmė skrandžio vėžiu ir metastazavusiu limfmazgiai. Be to, mes nustatėme, kad CagA
^{+ O
. pylori
kolonizavo iš 20 į 30 skrandžio vėžiu audiniuose ir skatina arba slopina šių genų in vivo išraiška.}

LDH ir DLD yra glaudžiai susijęs su energijos apykaita. Sutrikimas energijos apykaitos laikomas svarbiu veiksniu kuriant ir progresavimo vėžio. Skirtingai normalios ląstelės, vėžinės ląstelės eksponatas padidino priklausomybę nuo glikolizinių keliu pakankamai deguonies, vadinami aerobikos glikolizės. Didelis kiekis piruvo rūgšties, galutinio produkto į kelio, yra konvertuojamas į pieno rūgšties LDH, skatinant glikolizinių kelią ir energijos apykaitos pusiausvyros [25]. Pieno rūgštis taip pat gali sumažinti ląstelių mikroaplinkos pH, taip padidinant neovaskulinės atsakymą angiogenezėje skatinantys veiksniai naviko ląstelių metastazes [26,27]. Suderinamas su mūsų rezultatus LDH
buvo labai išreikštas vėžio audiniuose 61,8% pacientų, sergančių skrandžio vėžiu; pacientams, sergantiems LDH raiškos turėjo trumpesnį išgyvenamumą lyginant su pacientais, žemos raiškos [28]. Kim, ir kt
. [29] pastebėjo, kad DLD
išraiška didėja su naviko progresavimo, tokiu būdu suteikiant daugiau energijos naviko ląstelių augimas. Todėl, aukštos raiškos LDH ir DLD yra esminis veiksnys kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio, ir H
. pylori
infekcija skatina šių dviejų genų ekspresiją skrandžio vėžio audiniuose.

Beta aktino, kurio pagrindinis komponentas citoskeleto, išlaiko struktūrą, judesio ir pasidalijimą ląstelių pagal įprastą būklę. , β-aktino
yra neįprastai išreikšti daugelio ligų [30]. PRPF19 baltymas yra manoma, kad galėtų veikti iš anksto-iRNR sandūrų. Ubiquitination iš PRPF19 gali sukelti DNR pažeidimus, o nenormalus DNR reparacijos yra svarbi priežastis Tumorigenesis [31]. Kalmodulino yra kalcio-surišantis baltymas, kuris reguliuoja daugelį signalines kelius ir tokiu būdu dalyvauja ląstelių proliferaciją, mitozės ir genų transkripcijos. Kalmodulino skatina ląstelių proliferaciją kepenų karcinomos kartu su PI3K ir perėjimą nuo G1 į S etapas, kartu su ciklino E [32]. Kurio kalmodulino sulaikymai ląstelių inhibitorius G1 fazės slopina ląstelių dalijimąsi [33]. Suderinamas su šiais rezultatais, nustatėme, kad H
. pylori
gali dalyvauti vėžio išsivystymo skrandžio audinių, sukeldami didelį išraiška šių trijų baltymų.

Be to, mes nustatėme, žemyn reguliavimą RanGAP pervežimas geno vėžio audiniuose su H
. pylori
infekcija. RanGAP yra GTPase įsijungiantis baltymų. Po hidrolizės GTP su BVP priimtu GTPase, aktyvus RanGTP tampa neaktyvus RanGDP, todėl į ląstelę signalizacijos slopina vėžio progresavimą [34] blokados. Be to, sumažėjo RanGAP veikla sukelia ubiquitination skatina vėžio vystymąsi [35].

DNR metilinimas gali sukelti nenormalų genų ekspresiją. O
. pylori
infekcija padidina metilinimo lygis kai kurių genų ir rezultatų kancerogenezėje skrandžio gleivinės [36,37]. DNR metilinimas paprastai pasirodo CpG salų genų rengėjams. Mes nustatėme, metilinimo statusą CpG salų šių genų pastatytų ląstelių linijų ir nustatė, kad LDH
DLD parsisiųsti ir Vaizdo
genai buvo demetilinamas tuo promotoriaus -2325, -1885 ir -276 svetainėse, atitinkamai, ir RanGAP
genas buvo labai denatūruotas tuo promotoriaus -570 ir -170 vietų, atitiktų aukštą išraiška LDH
, DLD parsisiųsti ir Vaizdo
genų ir mažas išraiška RanGAP pervežimas geno skrandžio vėžio audiniuose su CagA pervežimas ^{+ H
. pylori
infekcija.}

Taigi, šie rezultatai rodo, kad H
. pylori
infekcija, per CagA perkėlimas, gali sukelti netipiško metilinimas šių genų sukelti asocialių genų ekspresijos skrandžio vėžio audiniuose ir ląstelėse. Mūsų rezultatai pateikti naują supratimą apie molekulinę patogenezės skrandžio vėžio su H
. pylori
infekcija. Ateities studijos ištirs šių pakeista metilinimas modelių poveikį skrandžio vėžio patogenezės klinikinių mėginių.

Padėka

padėkoti kinų centras Helicobacter pylori
padermės valdymas ir konservavimas teikti o
. pylori
NCTC11637 ir dr Jonas Wenxiu Wu Jiahong techninei pagalbai.

• PLoS ONE: Asociacija tarp dantų netekimo ir skrandžio vėžys: meta-analizė stebėjimo Studies
• PLoS ONE: Masyvi Endoskopinė patikrinimas, stemplės ir skrandžio vėžio didelės rizikos sritis China