PLoS ONE: Proteomics-basierte Identifikation und Analyse von Proteinen mit Helicobacter pylori in Magenkrebs

Abstrakt

Helicobacter pylori
( H
. pylori
) ist eine spiralförmige Gram-negative Bakterium, das die häufigste chronische verursacht Infektionen im menschlichen Magen. Etwa 1% -3% der infizierten Personen entwickeln Magenkrebs. Allerdings sind die Mechanismen, durch die H
. pylori
induziert Magenkrebs sind nicht vollständig verstanden. Die verfügbaren Daten zeigen eine starke Verbindung zwischen dem Virulenzfaktor von H
. pylori
, Cytotoxin-assoziierte Gen A (CagA) und Magenkrebs. Um weiter zu charakterisieren H
. pylori
Virulenz, haben wir drei Zelllinien durch die Magenkrebszelllinien SGC-7901 und AGS infizieren mit cagA
^{+
H
. pylori
und Transfizieren SGC-7901 mit einem Vektor in voller Länge cagA
Gen tragen. Wir haben festgestellt 135 unterschiedlich exprimierten Proteine ​​aus den drei Zelllinien Proteom-Technologie und 10 Differential Proteine ​​gemeinsam für die drei Zelllinien wurden ausgewählt und identifiziert durch LC-MS /MS als auch durch Western-Blot überprüft: &bgr; -Actin, L-Lactat Dehydrogenase (LDH), Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (DLD), pre-mRNA-Verarbeitung Faktor 19 homolog (PRPF19), ATP-Synthase, Calmodulin (CaM), p64 CLCP, Ran-spezifische GTPase-aktivierendes Protein (RanGAP), P43 und Calretikulin. Nachweis der Expression dieser Proteine ​​und Gene, die diese Proteine ​​kodieren in menschlichen Magenkrebsgewebe durch Echtzeit-PCR (RT-qPCR) und Western-Blot zeigte, dass die Expression von β-Actin
, LDH
, DLD
, PRPF19
und CAM-Gene wurden hochreguliert und RanGAP
wurde herunterreguliert im Magenkrebsgewebe und /oder Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu peri-Krebsgewebe. Hohe Genexpression wurde für H
beobachtet. pylori
Infektion im Magen-Krebsgewebe. Darüber hinaus ist die LDH
, DLD
und CAM-Gene an der Promoter -2325, -1885 und -276 Websites demethyliert wurden, bzw., und die RanGAP
Gen wurde an erster Stelle im Promotor methyliert -570 und -170-Sites in H
. pylori
infiziertem und cagA
-überexprimierende Zellen. Diese Ergebnisse liefern neue Einblicke in die molekularen Pathogenese und Behandlung Ziele für Magenkrebs mit H
. pylori
Infektion}

Citation:. Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, Chen X, Xu W, et al. (2016) Proteomics-basierte Identifikation und Analyse von Proteinen mit Helicobacter pylori
in Magenkrebs. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10.1371 /journal.pone.0146521

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Empfangen: 15. September 2015; Akzeptiert: 19. Dezember 2015; Veröffentlicht am: 8. Januar 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Alle relevanten Daten sind in der Papier

Finanzierung:. die Arbeit von National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326), Guizhou Provinz Stiftung (QianJiaoHe [2014] 06) und Key-Projekt für Wissenschaft und Technologie von Guizhou unterstützt wurde Province (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). In der ursprünglichen Version wurde die Arbeit von National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326) und Key-Projekt für Wissenschaft und Technologie der Provinz Guizhou (QianKeHe SY (2011) 3067) unterstützt

Konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Einführung

Helicobacter pylori
( H
. pylori
) bewirkt, dass die meisten häufige Infektion bei chronischen Magen Menschen weltweit. Etwa die Hälfte der Weltbevölkerung ist mit H
infiziert. pylori
, und die Mehrheit der kolonisierten Menschen entwickeln asymptomatischen Gastritis. Unter infizierten Personen, ca. 10% -20% der Patienten entwickeln Magengeschwür Krankheiten und 1% -3% entwickeln Magenkrebs [1,2]. Im Jahr 1994 H
. pylori
wurde als Typ I für Magenkrebs von der Weltgesundheitsorganisation Internationale Agentur für Krebsforschung krebserzeugend eingestuft.

Magenkrebs ist eine der häufigsten Krebsarten ist, und mehr als 70% der neuen Fälle und Todesfälle ereignen sich in Entwicklungsländern [3]. Obwohl die globale Inzidenzrate für mehrere Jahrzehnte rückläufig ist, bleibt Magenkrebs vorherrschend in den meisten Entwicklungsländern, darunter Japan, Korea und China [4-6]. Im Jahr 2012 gab die chinesische Krebsregister Jahresbericht, dass Magenkrebs Morbidität und Mortalität sind zweite und dritte unter allen bösartigen Tumoren, respectively.

Die Mehrheit der H
. pylori
Stämme tragen die cag
Pathogenitätsinsel ( cag
PAI), die 27 bis 31 Gene enthält, die eine bakterielle Typ 4-Sekretionssystem (T4SS) [7] kodieren . Das Cytotoxin-assoziierte Gen ein Gen ( cagA
), die am 3'-Ende liegt cag
PAI codiert die einzige bekannte bakterielle Onkoprotein, CagA, die in Wirtszellen transloziert wird von T4SS nach der bakteriellen Bindung an den Magen. Einmal in der Wirtszellen wird CagA Tyrosin von Mitgliedern der Abl und Src kinase phosphoryliert Familien und interagiert mit einer Vielzahl von intrazellulären Effektoren, was zur Aktivierung nachgeschalteter Signalmoleküle [8]. In klinischen Studien cagA
-positiver Stämme wurden zu schweren Magen-Entzündungen und Geschwüre konsequent verbunden sind, und ein kleiner Teil der Individuen entwickeln Magenkrebs [9]. Allerdings haben sich die Mechanismen, die die Assoziation von CagA mit Krebs zugrunde liegenden nicht aufgeklärt worden.

Proteomics hat sich als vielversprechende technologische Plattform für die rationelle Identifizierung von Biomarkern und neue therapeutische Ziele für Krankheiten und der Bestimmung der zugrundeliegenden Mechanismen entstanden aus Karzinogenese [10]. Jedoch haben die meisten der wichtigen Proteine ​​durch Proteomik in vitro nachgewiesen nicht in vivo in klinischen Proben bestätigt.

DNA Methylierung und Demethylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Progression von Krebs durch die Bindung von Transkriptionsfaktoren blockiert an DNA und tritt fast ausschließlich in Genpromotor CpG islands [11-13]. Unter Organe zeigt der Magen die höchste Frequenz von abnormalen CpG-Insel-Methylierung, möglicherweise H
. pylori
-vermittelte [14-16]. Obwohl Studien der DNA-Methylierung zunehmen, die Methylierung des Gens Staaten von H
induziert. pylori
sind noch nicht klar.

In dieser Arbeit werden wir spezifische Proteine ​​zu identifizieren, soll im Zusammenhang mit H
. pylori
Infektion mit vergleichende Proteomik und zu charakterisieren, die Genexpression und CpG-Insel-Methylierung dieser Proteine ​​bei Magenkrebs Gewebe und Zellen.

Materialien und Methoden

Menschliche Gewebe

Menschliche Gewebe wurden von der Operation Proben von 30 Patienten mit Magenkrebs erhalten und neben Krebsgewebe und metastatischen Lymphknoten in Guiyang Medical Hospital, Guiyang China abgestimmt, zwischen Januar 2009 und Juni 2010 Die Diagnosen von zwei Pathologen bestätigt wurden. Unter den Patienten, 23 waren männlich und 7 weiblich. Die Patienten waren im Alter von 38 bis 77 Jahre. Zweiundzwanzig Patienten Darm-Typ Adenokarzinom hatte, und 8 hatten diffuse-type Adenokarzinom. Das Studienprotokoll von der Ethikkommission der Guiyang Medizinischen Klinik genehmigt wurde, und alle vorgesehenen Themen informierte Zustimmung geschrieben.

Zellkultur

Die menschlichen Magenkarzinomzelllinie AGS (ATCC CRL-1739TM) und SGC-7901-Zellen wurden direkt von der American Type Culture Collection (ATCC) und Cell Bank of Type Culture Collection der chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben haben, bzw., und für weniger als 3 Monate in unserem Labor nach Erhalt agierten. Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 100 U /ml Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.

H
. pylori
Kultur

H
. pylori
Stamm NCTC11637 (ATCC 43504, ein Geschenk aus dem Chinesischen Zentrum von Helicobacter pylori
Stamm-Management und Erhaltung, Beijing, China), die cagA
positiv, wurde in selektivem Medium auf einer Columbia-Agarplatte, enthaltend 10% fötales Kälberserum und H
gezüchtet. pylori
Selektiv-Supplement (Oxoid Ltd, England) bei 37 ° C unter mikroaerobe Bedingungen.

Zell Infektion mit H
. pylori

AGS und SGC-7901-Zellen (5 x 10 ^{5) wurden für 24 h in 6-Well-Platten ausgesät und infiziert mit H
. pylori
für 6 h und 12 h bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 1: 100, 1: 500 und 1: 1000, respectively. Die Zellen wurden für 12 h bei einer MOI von 1: 1000 mit H
. pylori
15 min als Kontrollen gekocht.}

Konstruktion des Expressionsvektor pcDNA3.1 / cagA

wurde DNA extrahiert aus H
. pylori
und die in voller Länge cagA
Sequenz wurde durch PCR synthetisiert und kloniert in pMD18-T-Plasmide pMD18-T / cagA
zu konstruieren. Die cagA
Gen wurde durch Sequenzierung (GQ161098) identifiziert. pMD18-T / cagA
wurde mit den Restriktionsenzymen verdaut Pst
I und Bam
HALLO, und cagA
wurde in pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, USA), um den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3.1 / cagA
zu konstruieren. Die Sequenzen der Primer, die in der Tabelle zur Verfügung gestellt werden 1.

Zell Transfektion mit pcDNA3.1 / cagA

SGC-7901-Zellen für 12 h inkubiert wurden in 6-Well Platten 80% konfluenten Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden dann transfiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach 48 h wurden die Zellen 01.10 in neue Platten mit 6 Vertiefungen inokuliert und für weitere 24 h geteilt, und dann in selektiver Zeocin enthaltenden (250 ug /ml) Standardmedium für 2 Wochen bis clone Bildung gehalten. Zellen, die mit leerem Vektor pcDNA3.1 transfiziert /Zeo (-) wurden als Kontrollen verwendet

Proteinextraktion und Western-Blot

Proteinextrakte durch Resuspendieren Zellpellets in einem RIPA hergestellt wurden, Puffer oder 200 homogenisiert. mg Gewebe in einem RIPA-Puffer. Insgesamt 30-50 ug Proteinextrakt wurde einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese unterworfen, auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran (Millipore, Billerica, MA, USA) und über Nacht mit monoklonalem Maus-anti-CagA-Antikörper (1 geblottet: 800, SC-28368), Maus monoklonaler anti-Phosphotyrosin-Antikörpers (PY99, 1: 300, sc-7020), polyklonalem Kaninchen-anti-beta-Actin-Antikörper (1: 500, ab189073), polyklonalem Kaninchen-anti-LDH-Antikörper (1: 350 , ab125683), monoklonaler Maus-anti-DLD (1: 800, sc-376890), polyklonalem Kaninchen-anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), monoklonaler Maus-anti-ATP-Synthase-Antikörper (1: 300, ab54880), polyklonalem Kaninchen-anti -Calmodulin anbody (1: 250, ab208911), polyklonalem Kaninchen-anti-RanGAP Antikörper (1: 200, ab92360), polyklonalem Kaninchen-anti-p64CLCP Antikörper (1: 300, ab28722), polyklonalem Kaninchen-anti-Calreticulin-Antikörper (1: 350, AB4) und monoklonalen Maus-anti-Glyceraldehyd-3-phosphat -Dehydrogenase Antikörper (GAPDH, 1: 8000) von Santa Cruz (CA, USA), Abcam (Cambridge, UK) und CangChen (Shanghai, China), jeweils in 5% BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 0,01% Tween-20. Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, USA) wurden verwendet und mit dem Chemilumineszenzreagenz ECL entwickelt Plus-Hyperfilm mit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Die Quantifizierung der Western-Blots wurde mit Quantity One Software. Jedes Experiment wurde 3-mal durchgeführt und ein repräsentatives Ergebnis angezeigt wird.

Protein Extraktion und zweidimensionale Gelelektrophorese

Die Zellpellets wurden in Zell-Lyse-Puffer über Nacht bei 4 ° C und Protein wurde mit drei Volumina für 2 h durch Inkubation bei 4 ° C eiskaltem Aceton ausgefällt. Die Proben wurden dann für 30 min bei 20.000 Upm zentrifugiert, und die Pellets wurden in Zell-Lyse-Puffer und gelagert bei 4 ° C über Nacht resuspendiert.

Insgesamt 800 ug Protein auf ein Volumen von 250 ul eingestellt wurde, mit Rehydratationslösung und isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde unter Verwendung eines Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System (Amersham Biosciences) durchgeführt nach den Anweisungen des Herstellers. Das Protokoll für die IEF von 300 V for1 h, 500 V für 2,5 h, 1.000 V für 2 h; 8.000 V für 8 h, 60 kVh (insgesamt).

Nach IEF Abschluss die IPG-Streifen (Amersham Biosciences) wurden für 15 min in Äquilibrierungspuffer äquilibriert und für zwei auf einem 12% SDS-PAGE Gel platziert dimensionalen Elektrophorese bei 30 mA /Gel. Die resultierende SDS-PAGE-Gel wurde für 30 min in 20% TCA fixiert und dann mit kolloidalem Coomassie G-250 gefärbt [5].

Die Proteinpunkte auf dem Gel wurden automatisch gescannt und analysiert. Differentiell exprimierte Proteinspots wurden mit Imaging-Master 2D 5.0 ​​Analyse-Software (Amersham Biosciences) bestätigt. Student-t-Test wurde für die quantitative Analyse der 2D-Gelen durchgeführt. Differentielle Expression eines spezifischen Proteins wurde als ≥2 fache Änderung der Punkt optischen Dichte zwischen den beiden angepaßten Sätzen in Duplikaten definiert. Die Differenz spots wurden dann aus den SDS-PAGE-Gelen zur weiteren Identifizierung von LC-MS /MS exzidiert.

RNA Extraktion und quantitative RT-PCR

Gesamt-RNA wurde aus 50 mg Gewebe extrahierte und mit DNase I (RNase-frei) behandelt. Die Gene wurden mit SYBR Green (Applied Biosystems, Australia) amplifiziert. Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase ( HPRT
) wurde als Normalisierungskontrolle und relativen mRNA-Spiegel wurden berechnet, indem ein Vergleichs C _{t Methode Step-One-Software (Applied Biosystems, Australia) [8] verwendet. Jede Probe wurde in dreifacher Ausführung getestet, und die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt}

DNA-Extraktion und Methylierungsanalyse von CpG-Inseln

Die DNA wurde aus Zellen isoliert und modifiziert mit Natriumbisulfit ein EZ DNA-Methylierungs-Gold-Kit ^{™ (Zymo Research, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Promoter CpG Inseln wurden mit Methyl Primer Express Software vorausgesagt und amplifiziert aus Bisulfit-modifizierte DNA durch PCR die folgenden Verfahren verwendet: Denaturierung bei 96 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 40 sec bei 94 ° C Denaturierung, Annealing bei 60 ° C für 40 sec und Elongation bei 72 ° C für 40 sec, mit einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden in pMD19-T-Vektoren kloniert und sequenziert. Außerdem wurde DNA aus Tumorgeweben isoliert zur Erkennung H
. pylori
16S rRNA
Gen und cagA
Gen. Die Primersequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt}

Die statistische Analyse

Die Ergebnisse werden als Mittel ± SD ausgedrückt. Statistische Analysen wurden mit SPSS 15.0 Software. Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und Student-t-Test wurden verwendet, um die Daten zu analysieren. P
. ≪ 0,05 (zweiseitig) wurde als signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: Assoziation zwischen Zahnverlust und Magenkrebs: Eine Meta-Analyse von Beobachtungsstudien
• PLoS ONE: Massiver Endoskopische Screening für Speiseröhren und Magenkarzinome in einem Gebiet mit hohem Risiko von China