Contexte
microARN (miARN) sont largement étudiés ARNs non codants qui modulent l'expression des gènes. MiRNAs sont déréglementés dans différentes tumeurs, y compris le cancer gastrique (GC) et ont des implications diagnostiques et pronostiques potentiels. Le but de notre étude était de déterminer le profil miRNA dans les tissus du GC, suivi par l'évaluation des miARN dérégulés dans le plasma des patients du GC. Utilisation de bases de données et la bioinformatique méthodes disponibles, nous avons également cherché à évaluer les gènes cibles potentiels de confirmer différentiellement exprimé miARN et de valider ces résultats dans les tissus du GC.
L'étude a inclus 51 patients du GC et 51 témoins. Dans un premier temps, nous avons criblé miARN profil d'expression dans 13 des échantillons de tissus de la CG et 12 tissus gastriques normaux avec TaqMan réseau basse densité (TLDA). Dans la deuxième étape, miARN différentiellement exprimés ont été validés dans une cohorte de réplication en utilisant qRT-PCR dans des échantillons de tissus et de plasma. Par la suite, nous avons analysé les gènes cibles potentielles de miARN déréglementés en utilisant l'approche de la bioinformatique, déterminé leur expression dans les tissus du GC et effectué une analyse de corrélation avec le ciblage miARN.
Profiling avec TLDA a révélé 15 miARN déréglementés en GC tissus par rapport à la muqueuse gastrique normale. analyse de réplication a confirmé que miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p et miR-375 ont été systématiquement déréglementé dans les tissus du GC. L'analyse des échantillons de plasma des patients du GC de montré une régulation significative de miR-148a-3p, miR-375 et la régulation de miR-223-3p comparativement aux sujets sains. En outre, l'utilisation d'outils bioinformatiques, nous avons identifié des cibles de miARN répliquées et effectué une analyse d'enrichissement du gène associé à la maladie. En fin de compte, nous avons évalué le gène cible potentiel BCL2 Notre étude a révélé un profil miRNA dans les tissus du GC et a montré que miR-148a-3p, miR-223-3p et miR-375 sont déréglementés dans des échantillons de plasma GC, mais ces miARN circulants a montré un rendement relativement faible de diagnostic en tant que biomarqueurs uniques. l'analyse du gène cible a démontré que BCL2 Citation:. Juzenas S, Saltenienė V, Kupcinskas J, Link A , Kiudelis G, Jonaitis L, et al. (2015) Analyse des déréglementé microARN et leurs gènes cibles dans le cancer gastrique. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10.1371 /journal.pone.0132327 Editeur: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, ETATS-UNIS Reçu le 22 Avril 2015; Accepté: Juin 13 2015; Publié le 14 Juillet, 2015 Droit d'auteur: © 2015 Juzenas et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et financement:. Ce travail de JK, LJ, Siju, LK, JS a été soutenu par le Fonds social européen n ° VP1-3.1-SMM-07-K-01 -156. Le travail du PM est soutenu par le Ministère fédéral allemand de l'éducation et de la recherche dans le cadre de PathoGenoMics ERA-Net. Grant No: BMBF-0315905D. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent Introduction La découverte de microARN (miARN) et l'établissement de leur rôle dans les voies moléculaires a apporté un énorme progrès en biologie moléculaire [1] [2]. Ces petits ARN non codants composées de ~ 22 pb sont impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique. MiRNAs se caractérisent par une grande stabilité dans des échantillons biologiques qui font ces molécules une cible attrayante dans le domaine de la recherche sur les biomarqueurs [3] [4]. L'accumulation des données montre que les miARN sont impliqués dans les principales voies de carcinogenèse [5]. Des études antérieures ont révélé que la déréglementation des miARN se produit pratiquement dans tous les principaux types de cancer [5] [6]. En outre, les miARN ont été montré pour avoir un rôle de diagnostic ou de pronostic et implications cliniques, même potentiels pour la thérapie génique ciblée chez les patients atteints de cancer [7] [8]. L'incidence du cancer gastrique (GC) dans les pays occidentaux a diminué au cours des dernières décennies; Cependant, ce type de cancer représente encore près d'un million de nouveaux cas de la maladie dans le monde et réalise un taux de mortalité très élevé [9]. Des recherches récentes sur GC a révélé de nombreuses nouvelles connaissances sur la pathogenèse de cette tumeur maligne. Néanmoins, les mécanismes exacts de la transformation maligne de Helicobacter pylori Le rôle crucial des miARN dans GC a été démontré dans différentes études [12]. Volinia et al. ont fourni l'un des premiers profils d'expression de miARN dans les tissus GC montrant un motif de déréglementation spécifique [13]. D'autres études ont également rapporté la déréglementation significative des miARN appartenant à miR-17, miR-21, miR-223, miR-135 et beaucoup d'autres familles. Parmi les études rapportées dans les tissus du GC, miR-21, miR-25, miR-92, miR-223 ont été les plus uniformément régulé à la hausse miARN, tandis que miR-375 et miR-148 ont été les plus constamment régulée vers le bas [14] [ ,,,0],15] [16]. La plupart de ces études ont examiné le profil miRNA chez les patients avec GC et de la muqueuse gastrique normale appariée adjacente [14]. D'importantes études ont montré que les miARN sont déjà déréglementés dans les stades précoces de la cancérogenèse gastrique, y compris H Le but de notre étude était de déterminer le profil miRNA dans les tissus du GC et le comparer à la muqueuse gastrique normale et saine en utilisant une large couverture miRNA TaqMan faible densité tableaux. Dans une analyse plus approfondie, nous avons cherché à valider nos résultats de profilage dans les tissus et le plasma d'un plus grand groupe de patients du GC et des contrôles sains d'origine européenne. En fin de compte, nous avons évalué les gènes cibles potentiels de confirmation du différentiellement exprimé miRNA et effectué maladie association analyse de l'enrichissement génétique de leurs gènes cibles. Déclaration d'éthique de matériaux et méthodes Le étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la recherche biomédicale Kaunas régional (protocole n ° BE-2-10). Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé pour participer à l'étude. Les échantillons de tissus ont été prospectivement recueillies entre 2011 et 2014 dans les départements de gastroentérologie et de chirurgie, Hôpital de l'Université lituanienne des sciences de la santé (Kaunas, Lituanie). L'étude a porté sur un total de 51 sujets témoins et 51 patients du GC, qui ont été divisés dans le profilage (GC, n = 13; contrôle, n = 12) et les cohortes de validation (GC, n = 38; contrôle, n = 39). Tous les sujets étaient d'origine européenne. des échantillons de biopsie gastrique ont été obtenus de la partie antrale de l'estomac des sujets témoins qui ont été référés pour endoscopie digestive haute en raison de symptômes dyspeptiques et n'a pas eu d'antécédents de malignité. des échantillons de tissus GC ont été obtenus à partir d'échantillons chirurgicaux immédiatement après résection de patients subissant une chirurgie primaire pour GC sans irradiation préopératoire et la chimiothérapie. adénocarcinome gastrique chez les patients du GC a été vérifiée par histologie et classé selon Lauren en diffus et types intestinaux [22]. H préparation d'échantillons de tissus et de l'ARN extraction échantillons de tissus gastriques ont été stockés dans RNAlater (Ambion, Austin , TX, USA) à + 4 ° C et 24 heures plus tard stocké à -80 ° C. 30 mg de tissu a été homogénéisé dans un état stérile avant l'isolement d'ARN total avec le kit d'isolation MIRVANA miRNA (Ambion, Austin, TX, USA) pour le profilage de l'étude et miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) pour l'étude de validation, selon le les instructions du fabricant. La qualité de l'ARN a été évaluée en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, États-Unis). examen qualitatif de l'intégrité de l'ARN a été réalisée par électrophorèse sur gel d'agarose (5%). Préparation échantillon plasmatique et l'extraction de l'ARN Les échantillons de plasma ont été prélevés chez des patients de santé et les patients atteints de GC. L'expression de miARN dans la cohorte de plasma est composée d'échantillons de plasma provenant de 38 patients atteints d'un cancer de l'estomac et de 39 volontaires sains. Le sang veineux a été recueilli dans des tubes sous vide d'EDTA et d'anti-coagulation a été centrifugé à 3500 tpm pendant 15 minutes à la température ambiante; plasma séparé a été transféré dans 1,5 ml tubes et placé dans un congélateur C -80 ° pour le stockage à court terme. Les petits ARN ont été extraits de 200 pi de plasma en utilisant le kit miRNeasy Sérum /Plasma (Qiagen, Valencia, CA, USA) selon les instructions du fabricant. miRNA profilage a été réalisée avec la TaqMan Card miRNA Human Un v2.1 qui a permis de quantifier 377 miARN humains cataloguées dans miRBase v20 [23] Array. En bref, 350 ng d'ARN total a été initialement une transcription inverse en utilisant le Megaplex RT mis en commun une version 2.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, USA) et 800 pi de produit d'ADNc a ensuite été chargé sur le TaqMan Card MiRNA Human matrice et exécuter sur le système VIIa 7 Real-Time PCR (Applied Biosystems). l'analyse primaire a été effectuée à l'aide VIIa 7 Software (Applied Biosystems) pour obtenir l'expression en termes de Ct. L'analyse des données a été réalisée en utilisant package Bioconductor HTqPCR [24]. MiRNAs avec une valeur Ct > 37 ont été considérés comme non amplifié. MiRNAs qui ne sont pas amplifiés dans plus de 25% des échantillons ont été considérés comme faiblement exprimés et, par conséquent, exclue de l'analyse. MiRNA données d'expression a été normalisée en utilisant la normalisation rang invariant. algorithmes NormFinder et geNorm ont été utilisés pour identifier un gène de référence à partir des données TLDA pour l'étude de validation [25]. Selon les algorithmes miR-127-3p a montré la plus faible variance Ct et a été choisi comme un gène de référence pour l'étude de validation. Des études récentes montrent que les niveaux de RNU6A et quelques autres petits ARN nucléaires expression peut être instable dans certains tissus et conditions et ne peuvent pas servir de meilleurs gènes de référence [26] [27] [28] [29]. Une publication récente a également identifié miR-127-3p comme un bon candidat pour la sélection du gène de référence [30]. La transcription inverse (RT ) Les réactions ont été effectuées en utilisant le kit TaqMan miRNA Reverse transcription (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, USA) et RT amorces miRNA spécifiques tige-boucle (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, USA). Les réactions ont été réalisées singleplex dans un volume de 7,5 ul. Chaque réaction comprenait 2,08 ul d'eau sans nuclease, 0,74 ul 10 de tampon × TA, 0,08 ul de dNTP (100 mM), 1,5 ul de 5 x miARN spécifiques amorces de RT, 0,1 inhibiteur ul RNAse, 0,5 pi MultiScribe transcriptase inverse et d'un volume fixe de miARN gabarit (2,5 pi). RT a été réalisée dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: 16 ° C pendant 30 min, 42 ° C pendant 45 min et 85 ° C pendant 5 min, suivie d'un maintien à 4 ° C TaqMan réel. -time réactions PCR ont été réalisées dans des réactions en double comprenant 6,25 pi TaqMan 2 × Universal Maître PCR mix avec No AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, USA) 0,625 uL 20 × miRNA-amorce spécifique et de la sonde mélange du kit TaqMan miRNA Assay (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, USA), 3 pi du produit de transcription inverse et 2.625 ul d'eau nucléase libre. La RT-PCR a été réalisée en utilisant un système 7500 rapide en temps réel par PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, USA) sous les conditions suivantes: 95 ° C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 60 s, suivie d'un maintien à 4 ° C. Chaque échantillon a été effectué en double. Les données ont été analysées avec les réglages automatiques pour assigner la ligne de base, et les valeurs Ct et SD moyennes ont été calculées. Le niveau d'expression des miARN dans le tissu a été normalisé à miR-127-3p et le niveau d'expression dans le plasma a été normalisée à hsa-miR-16-5p. Les résultats ont été calculés selon la méthode du ΔΔCT [31]. Les données ont été analysées avec les réglages automatiques pour assigner la ligne de base, et les valeurs moyennes Ct et SD ont été calculées. ADNc pour BCL2 Le listes de gènes cibles validées des miARN candidats ont été obtenus à partir de miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) et miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) bases de données. données d'association Gene-maladie ont été extraites de la base de données DisGeNET (http://www.disgenet.org/). Afin d'identifier les gènes GC-associés, le terme "adénocarcinome gastrique" (de UMLS: C0278701) a été utilisé comme requête pour la base de données. réseaux biologiques ont été créés en utilisant Cytoscape v3.2 logiciel open-source avec l'application CyTargetLinker [32]. L'analyse statistique Les caractéristiques cliniques entre les groupes ont été comparés en utilisant le χ expression de miARN profilage de GC et de tissus de la muqueuse gastrique saine par TaqMan miARN humain faible densité de TLDA analyse Array a été réalisée pour identifier les miARN candidats présentant une expression altérée dans les tissus du cancer gastrique. Tissue profils miRNA de patients du GC ont été comparés avec les profils de la muqueuse gastrique d'individus sains. Après filtration pour les basses miARN abondantes (valeur Ct > 37 et non détectables dans plus de 25% des échantillons), un ensemble de 193 miARN (du total de 377) est resté pour une analyse ultérieure. Une comparaison des cancéreux par rapport à un tissu normal identifié 15 miARN exprimés de manière différentielle, dont 7 ont été régulés à la hausse et 8 ont été régulés à la baisse avec FDR valeur p < 0,01 ajusté et plier le changement > 2 (Tableau 2). Les résultats sont démontrés dans la parcelle du volcan (figure 1). Parmi ceux-ci, 6 miARN (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-375, miR-223-3p et miR-155-5p), montrant la plus haute importance et plier les valeurs de changement, ont été sélectionnés pour l'étude de validation. Classification hiérarchique sous la distance euclidienne des miRNA données d'expression normalisée sélectionnés a révélé deux sous-groupes: l'un correspondant au groupe de contrôle et le second correspondant principalement au groupe de patients. (Figure 2). Les six miARN candidats sélectionnés pour la vérification ont été quantifiés en utilisant qRT-PCR. Pour la sélection du gène de référence, les données TLDA été analysées en utilisant deux algorithmes différents (NormFinder et geNorm) pour identifier les gènes de référence. MiR-127-3p a montré une grande stabilité d'expression dans tous les échantillons dans les données TLDA et à cause de cette caractéristique miR-127-3p a été choisi comme un gène de référence pour normaliser les données qPCR. Les niveaux de miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p et miR-375 expression ont montré une expression différentielle significative dans le même sens que dans l'étude de la découverte (FDR ajusté p < 0,05), tandis qu'aucune importante les différences ont été détectées dans les niveaux de miR-135a-5p et miR-155-5p expression (0,05; p >FDR ajusté Fig 3) miARN plasma comme biomarqueurs potentiels pour le cancer gastrique Cible prédiction de gènes Pour étudier plus les cibles possibles de miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223- 3p et miR-375, l'ensemble de leurs interactions miARN cibles validées expérimentalement ont été obtenus à partir de deux bases de données différentes (miRTarbase et miRecords). Les données ont été trouvées dans Cytoscape comme un réseau biologique contenant l'ensemble des miARN mentionnés et leurs interactions cibles (figure 5). Chaque interaction dans le réseau se composait de deux noeuds, un noeud de miRNA réglementaire (rouge) et un noeud cible d'ARNm (rose) relié par un bord dirigé. Dans l'ensemble, le réseau comprenait 593 cibles validées, 419 d'entre eux affecté à miR-375, 88 attribué à miR-204-5p, 83 attribué à miR-148a-3p et 21 attribué à miR-223-3p. L'analyse de réseau a révélé que miR-148a-3p et miR-375 ont six objectifs partagés (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 et Rab10), miR-204-5p et miR-375 a également eu six objectifs partagés (SERP1, CNTC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 et IL1RAP), miR-148a-3p et miR-204-5p avait deux objectifs partagés (AURKB et CDC25B), miR-223-3p et miR-148a-3p ont également eu deux objectifs partagés (HSP90B1 et IRS1), miR-223-3p et miR-375 avait une cible commune (PARP1) et miR-148a-3p, miR-204-5p et miR-375 avait aussi une cible commune (BCL2). Les gènes cibles qui ont été réglés simultanément par deux ou trois miARN sont représentés dans des couleurs orange et vert, respectivement (figure 5). enrichissement du gène associé à la maladie d'analyse Afin de déterminer si la maladie gènes -Associated ont été considérablement enrichies dans notre série de cibles miARN, l'analyse d'enrichissement a été effectué. Tout d'abord, la liste des gènes a été récupéré à partir de la base de données DisGeNet. Comme requête pour la base de données, nous avons utilisé le terme "adénocarcinome gastrique" (de UMLS: C0149826). Après avoir filtré miARN, lncRNA et des gènes qui ne sont pas dans miRTarbase et miRecords, 115 gènes ont été identifiés à être associé à CG. Dans l'analyse de réseau 20 de gènes du GC-associé se chevauchaient, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 et JAG1) d'entre eux affectés à miR-375, 6 (IL8, MMP9, IL1B, CDX2, SERPINE1 et SPARC) affecté à miR-204 -5p, 4 (CDKN1B, APC, NR1I2 et CCKBR) attribué à miR-148a-3p et 2 (STMN1 et IGF1R) attribué à miR-223-3p. Les gènes cibles qui ont été associés à la GC sont représentés en bleu (figure 5). Enfin, l'analyse de l'enrichissement du gène associé à la maladie a été réalisée à l'aide d'un test basé sur la distribution-hypergéométrique qui a conduit à évaluer si le nombre de gènes du GC-associé est plus important que prévu dans l'ensemble des gènes cibles de miARN sélectionnés. Analyse Enrichissement a révélé que les gènes du GC-associé étaient significativement sur-représentés (p < 0,05) miR-148a-3p, miR-204-5p et miR-223-3p, alors qu'aucun enrichissement significatif a été observé dans miR-375 gènes cibles (p > 0,05) (tableau 3) BCL2 Discussion profils d'expression de miARN Altered ont. été rapportée dans les tissus et les échantillons de sang GC [13] [20] [14] [38]. Certains de ces miARN déréglementés ont été liés à la survie, le comportement métastatique de la tumeur et d'autres caractéristiques clinico du GC [39] [40]. En outre, il a été démontré miARN pour réguler la croissance des tumeurs en agissant sur la prolifération, l'adhésion, l'invasion et la migration dans les lignées cellulaires GC [41]. Plus important encore, les gènes cibles de miARN déréglementés en GC sont impliqués dans l'apoptose, le cycle cellulaire et d'autres voies de carcinogenèse cruciales [12]. Par conséquent, l'enquête des miARN et leurs gènes cibles potentiels dans GC peut servir à la poursuite du développement des alternatives diagnostiques et thérapeutiques importantes. Il est évident que les miARN sont des acteurs majeurs dans la cancérogenèse gastrique, mais nous manquons encore de données précises sur les mécanismes et les applications cliniques potentielles de ces molécules dans GC Notre étude présente visait à déterminer le profil de miARN déréglementés en GC les tissus, les évaluer dans des échantillons de plasma et d'évaluer les gènes cibles potentielles de miARN déréglementés. L'utilisation de cartes TaqMan miRNA TLDA, englobant 377 miARN amorces, nous avons trouvé 15 miARN exprimés de manière différentielle entre GC cancéreuses et les tissus gastriques sains. Huit miARN ont été régulés à la baisse (laissez-7a-5p, laissez-7g-5p, miR-26b-5p, miR-30b-5p, miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR -375), tandis que sept miARN étaient régulés à la hausse (miR-146b-5p, miR-155-5p, miR-214-3p, miR-223-3p, miR-224-5p, miR-331-3p et Mir- 484). Nos résultats de profilage n'a pas révélé certains des miARN couramment déréglementés, qui ont été précédemment signalés à être déréglementés dans d'autres études, y compris miR-21-5p, miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-29c-3p, et d'autres [15] [19] [14]. Une des explications possibles de ces miARN manquants pourrait être liée à des critères statistiques très strictes qui ont été appliquées pour l'analyse TLDA de nos données (FDR p-valeur ajustée < 0,01 et plier le changement > 2). En outre, un certain niveau de différence dans miRNA résultats du profilage entre les études pourrait résulter de différences dans la localisation anatomique de l'estomac, le sous-type histologique, l'analyse statistique et les méthodes de profilage en particulier [18]. Une étude réalisée par Mestdagh et al. montre que les différentes plates-formes de miRNA profilage ont des taux de détection, la spécificité et la reproductibilité, et que la plate-forme la plus appropriée doit être choisie sur la base du cadre expérimental et les questions de recherche spécifiques (Mestdagh et al., 2014). dans la deuxième étape de notre étude, nous avons utilisé qRT-PCR dans la réplication cohorte dont six miARN les plus déréglementés de la phase de profilage (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-155-5p, miR-204-5p , miR-223-3p et miR-375). Nous avons montré que miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p et miR-375 ont été systématiquement déréglementés entre les tissus GC normales et cancéreuses. Les résultats de notre cohorte de réplication sont pris en charge par les rapports précédents. Plusieurs études ont montré que miR-148a-3ß était significativement régulée à la baisse dans les lignées cellulaires du GC et des échantillons de tissus par rapport aux tissus normaux adjacents [42] [43]. niveaux de miR-375 Low expression ont également été signalés par des études, l'hypothèse que miR-375 a été associé à la carcinogenèse gastrique [44] [16]. Nous avons déterminé que miR-223-3p était significativement régulée à la hausse dans les tissus GC par rapport à un tissu normal, comme suggéré par plusieurs rapports précédents [15] [19]. MiR-204-5p a été moins fréquemment rapportés dans GC miRNA études de profilage; Néanmoins, nos résultats sont en ligne avec une étude précédente qui a montré une régulation significative de ce miARN dans les tissus GC et des lignées cellulaires GC [45]. expression miR-135a-5p était plus faible dans les tissus du GC que chez les sujets témoins; cependant, la tendance régulation à la baisse observée était similaire aux précédents rapports [15] et pourrait avoir atteint la signification avec un plus grand nombre d'individus au sein des groupes requis. Il est intéressant de souligner que nous n'avons pas trouvé de différences pour miR-155-5p dans notre cohorte de réplication comparant les sujets témoins et des patients GC. Très probablement cette constatation est liée au fait que, dans la cohorte de profilage initiale, les sujets témoins étaient H Pour étudier le rôle potentiel des miARN exprimés de manière différentielle en tant que biomarqueurs en GC, nous avons analysé miARN déréglementé dans des échantillons de plasma. miARN circulants, en particulier la combinaison de plusieurs miARN peuvent présenter des biomarqueurs prometteurs pour le diagnostic des cancers gastro-intestinaux [21]. Une étude menée par Zhu et al. a démontré qu'un groupe de cinq miARN peut servir de biomarqueur potentiel dans la détection de GC à un stade précoce [47]. À ce jour, ont rapporté des profils de miARN dans le sérum ou le plasma GC diffèrent considérablement entre études distinctes [21].
et DNMT3B de l'expression par qRT-PCR dans les tissus du GC, qui en corrélation avec l'expression de ciblage miRNA.
Conclusions
et DNMT3B de l'expression dans le tissu GC en corrélation avec leur expression miRNA ciblage
( H
. pylori
) l'infection à une gastrite atrophique chronique, la métaplasie intestinale et GC est encore mal compris [10 ]. hypothèse actuelle du développement du GC implique des effets combinés d'origine bactérienne, hôte et facteurs nutritionnels; Cependant, à ce jour, cette théorie suggère très peu implications traductionnelles cliniquement saines [11]. La majorité des cas de GC sont diagnostiqués à un stade avancé de la maladie, qui est associée à des résultats médiocres des patients. Par conséquent, l'un des axes majeurs de la recherche en GC est l'évaluation de biomarqueurs moléculaires qui pourraient être utilisés pour le diagnostic non invasif précoce de cette tumeur maligne.
. pylori
gastrite et stades précancéreux de l'atrophie gastrique et métaplasie intestinale [17] [18]. Fait intéressant, certains des miARN ont des directions opposées de déréglementation en présence de GC, comme des études de profilage distinctes montrent l'incohérence significative entre les miARN déréglementés [14]. MiR-9 a été trouvé pour être régulés à la hausse dans deux études [15] [19], tandis que deux autres documents ont montré une régulation significative de ce miARN dans les tissus du GC [13] [20]. Ces divergences concernant les résultats de déréglementation opposés pour miR-9 et de nombreux autres miARN sont très probablement liées à des différences dans la localisation anatomique de la GC, le sous-type histologique, stade de la maladie, les plates-formes de profilage, d'analyse statistique et de nombreux autres facteurs de confusion potentiels. En outre, la majorité des études publiées actuellement sur le profil miRNA dans les tissus GC couvrent des sujets de pays asiatiques; Pendant ce temps, les données sur les patients du GC européens est encore rare [21].
Population
Étude
. statut pylori
a été évaluée dans le GC et les sujets témoins en utilisant ELISA indirect pour détecter l'antigène IgG sériques spécifiques (Virion /Serion GmbH, Wünrzburg, Allemagne). Les caractéristiques cliniques et pathologiques des cohortes de patients, y compris l'âge, le sexe et le stade de la maladie sont résumées dans le tableau 1.
MiRNA profilage en utilisant le tableau TaqMan Low-Density
inverse quantitative des réactions en chaîne par polymérase (qRT-PCR)
et Analyse DNMT3B
d'expression génique a été synthétisé à partir 500 ng d'ARN en utilisant une grande capacité Kit ADNc transcription inverse (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, USA). Les réactions singleplex ont été réalisées dans un volume de 7,5 ul. Chaque réaction comprend 2,1 pi d'eau sans nucléase, 1 pi 10 de tampon RT ×, 0,4 pi de dNTP (100 mM), 1 pi 10 Les amorces × RT au hasard, 0,5 ul MultiScribe transcriptase inverse et un volume fixe de miRNA modèle (2,5 ul). La RT-PCR a été réalisée dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: 25 ° C pendant 10 min, 37 ° C pendant 120 min et 85 ° C pendant 5 min, suivie d'un maintien à 4 ° C. Avant échantillons qPCR ADNc ont été dilués à 1: 1 avec de l'eau sans nucléase et 2 ul utilisés dans 10,5 ul réactions RT-qPCR avec 6,25 ul 2x TaqMan rapide Master mix Universal (Life Technologies, Carlsbad, Californie, USA), 0,625 ul 20x TaqMan Gene expression Assay (Life Technologies, Carlsbad, Californie, USA) et 3.625 ul d'eau stérile. dosages RT-qPCR ont été exécutés en triple sur un système 7900HT rapide PCR en temps réel (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, États-Unis) dans les conditions suivantes: 95 ° C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 60 s, suivie d'un maintien à 4 ° C. Les niveaux de BCL2
et expression DNMT3B
dans le tissu a été normalisé à ACTB
.
Cible réseau de gène analyse
2 tests et le test exact de Fisher pour les données qualitatives et test t pour les données quantitatives. Les données TLDA a été analysée en utilisant le test t et la correction Benjamini Hochberg pour le taux de fausses découvertes telles que l'expression différentielle a été considérée comme significative avec un p < 0,01. Les données ont été normalisées en utilisant le rang normalisation invariant [33] et analysées en utilisant le package HTqPCR. La qPCR données d'expression de validation et de plasma a été analysé à l'aide non paramétrique U-test de Mann-Whitney. A Benjamini Hochberg p <ajusté; 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Pour les données qRT-PCR, les niveaux d'expression relatifs de chaque cible de miARN (Log2 du niveau relatif) ont été calculées en fonction de la différence entre les valeurs CT entre les miARN cibles et miR-127-3p dans des échantillons de tissus et miR-16-5p dans des échantillons de plasma (ACt) [34]. essai hypergéométrique a été utilisé pour l'analyse d'enrichissement cible GC-associé. Un récepteur fonctionnant (ROC) courbe caractéristique a été générée pour chaque miARN en utilisant les données de ACt. L'aire sous la courbe (AUC) et la valeur des intervalles de confiance à 95% (IC) ont été calculés pour déterminer la spécificité et la sensibilité. Pour analyser la valeur diagnostique des changements combinés dans les taux plasmatiques de miRNA, l'algorithme moyen d'expression génique univariée a été utilisé [35]. Les courbes ROC ont été générés en utilisant package ROCR [36]. Toutes les analyses de données ont été effectuées en utilisant la version R du logiciel 3.1.1.
Résultats
validation MiRNA en GC et le tissu gastrique sain de la muqueuse avec
qRT-PCR
et DNMT3B
sur-expression et la corrélation inverse avec le ciblage miARN dans les tissus de cancer gastrique
comme une cible putative pour miR-148a-3p, miR-204-5p et miR-375 et DNMT3B
pour miR-148a-3p et miR-375. Tous ces miARN dans notre étude se sont révélés être régulés à la baisse dans les tissus du cancer gastrique. Afin de soutenir davantage ces résultats, d'abord l'analyse de l'expression de BCL2
et Les gènes DNMT3B de a été réalisée. Les données de qRT-PCR ont montré augmentation significative des niveaux de deux d'expression BCL2
et Les gènes DNMT3B de dans le tissu du cancer gastrique. BCL2
a montré une augmentation de 2,7 fois, tandis que DNMT3B
avait une augmentation de 16,7 fois dans les niveaux d'ARNm (figure 6). L'analyse de corrélation de Pearson a été réalisée afin de dévoiler la relation entre le BCL2
et DNMT3B
ARNm et leurs niveaux de ciblage miRNA dans les tissus gastriques normaux et cancéreux (figure 6). Une corrélation inverse a été observée pour les deux le prédit DNMT3B
miARN ciblé vers: miR-375 (r = -0,49; p = 0,00001) et miR-148a-3p (r = -0,26; p = 0,0328) . Une corrélation négative a été observée entre BCL2
et miR-375 (r = -0,32; p = 0,0116), alors qu'aucune relation n'a été trouvée entre BCL2
et miR-148a-3p (r = -0,06; p = 0,6631) ou BCL2
et miR-204-5p (r = -0,02; p = 0,8546)
.
. pylori
libre, alors que dans l'ensemble de réplication, certains des sujets témoins avaient une sérologie positive pour cette bactérie. Il est bien connu que miR-155-5p est impliqué dans les voies inflammatoires, y compris H
. pylori
gastrite [46]; par conséquent, cela pourrait donner une certaine partialité à nos résultats. Nos résultats sont en ligne avec l'étude précédente par Link et al. (2015), où la différence dans l'expression de miR-155 dans des biopsies de GC par rapport aux témoins n'a pas atteint une signification statistique [18]. Dans la phase de réplication de notre étude miRNA de profilage, nous avons sélectionné six miARN, qui a montré la pertinence biologique la plus élevée et la signification statistique. Nous convenons qu'il serait utile d'examiner miARN à tous significativement déréglementés et qui pourrait être une tâche potentielle dans d'autres études.
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