PLoS ONE: Stathmin1 Igranja onkogenih Uloga i meta mikrornk-223 u želučanom Cancer

Sažetak pregled

Stathmin1 (STMN1) je kandidat onkoprotcin i marker prognoza u nekoliko vrsta raka. Cilj ove studije bio je analizirati svoj izraz i bioloških funkcija kod raka želuca. Izraz STMN1 je procijenjena QRT-PCR, Western blot i imunohistokemijski. Biološka funkcija STMN1 je određena MTT proliferacije, monosloja formiranja kolonija i invazija stanica ispitivanjima pomoću male tehnike miješanje RNA u želučanim staničnim linijama raka. Također smo istraživali regulaciju STMN1 izražavanja mikrornk-223. STMN1 je reguliran u želučanom raka stanične linije i primarne želučane adenokarcinom. STMN1-pozitivni tumori bili su više vjerojatno da će se naći u starosti grupe, a povezana je s p53 nuklearne izražavanja. U difuznim tipa želučanog adenokarcinoma, STMN1 izraz bio povezan s dobi ( p pregled = 0,043), T faza ( p pregled = 0,004) i limfnih čvorova metastaze ( p pregled = 0,046). Izražavanje STMN1 u difuzni tip želučanog adenokarcinoma je bio povezan sa slabom bolesti specifične za preživljavanje univarijantne analize ( p pregled = 0,01). STMN1 obaranje u AGS i MKN7 staničnim linijama potisnuti proliferaciju ( p izvoznici < 0,001), smanjuje formiranje jednoslojni kolonija ( p izvoznici < 0,001), invazija inhibiran i migraciju stanica sposobnost ( p pregled i 0,001) i inducirane G1 faze zastoj. siSTMN1 također može potisnuti rast stanica In vivo pregled ( p pregled. < 0 01). Mi smo napokon potvrdio da STMN1 se pretpostavlja da iza meta Mir-223 kod raka želuca. Naša otkrića podržavaju je onkogeni ulogu STMN1 kod raka želuca. STMN1 mogu poslužiti kao prognostički biljeg i potencijalni terapijski cilj za rak želuca pregled

Izvor:. Kang W, Tong JHM, Chan AWH, pluća RWM, Chau SL, Wong QWL, et al. (2012) Stathmin1 Igranja onkogenih Uloga i meta mikrornk-223 u rak želuca. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10,1371 /journal.pone.0033919 pregled

Urednik: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 17. listopada 2011; Prihvaćeno: 19. veljače 2012; Objavljeno: 28 ožujak 2012 pregled

Copyright: © 2012 Kang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija je podržan od strane UGC surađivali Research Fund (CUHK04 /CRF /08) i website financijer jest http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je jedan od najčešćih zloćudnih bolesti, a drugi najčešći uzrok raka povezanih smrti u svijetu. To je najviša incidencija u Kini, Japanu, Koreji i istočnoj Aziji. Ukupni prognoza je loša, sa stopom od 5 godina preživljavanja ispod 30% u većini zemalja [1]. Nekoliko potencijalnih faktora rizika uključuju visoku sol dijeta, pušenje, nizak unos voća i povrća, kronični gastritis s glandularatrophy i intestinalne metaplazije i Helicobacter pylori (H. pylori) pregled infekcije. Klinički ishod H. pylori infekcija pregled Pokazano je da se pod utjecajem različite genetske faktore, posebice H. pylori pregled -virulence povezani geni kao što su CAG pregled A, vac pregled A, led pregled A i Bab pregled [2]. H. Pylori pregled infekcija je također poznato da induciraju ekspresiju upalnih enzima ciklooksigenaze (COX-2), što pokazuje visoko regulirana ekspresija u karcinomu želuca [3]. Prethodna istraživanja su zabilježila važnost genetskih i epigenetičkim izmjenama onkogena, tumorskih supresorskih gena i gena za mismatch popravak u razvoju raka želuca. Protocadherin 10 [4], smrt povezanih protein kinaze [5], izlučeni frizzled-srodni protein [6] i aktiviran djelovanjem peroksizom proliferatora gama-receptor [7] je pokazano da imaju smanjenu ekspresiju i tumor supresor funkciju želuca karcinogeneze. S druge strane, proteinski retinoična kiselina regulirane nuklearne matrica povezana [8], a da protein povezan 1 [9] su oba upregulated i vrše funkciju onkogena u razvoju tumora. Pregled

Stathmin1 (STMN1), također poznate kao onkoprotein 18, je važan citosolnog mikrotubula destabiliziranja protein koji ima ključnu ulogu u procesu mitoze kroz regulaciju mikrotubula dinamike i niz drugih bioloških procesa [10]. Visoka razina STMN1 ekspresije je povezana s lošom prognozom u raznim malignancijama, uključujući rak dojke [11], [12], karcinom prostate [13], maligni mezoteliom [14], rak grlića maternice [15] i karcinoma skvamoznih stanica jednjaka [16] , U 2010. godini, Jeon et al. Prvi je izvijestio da STMN1 prekomjerna ekspresija je pozitivno korelirana s limfnih čvorova metastaza i napredne skele i vaskularne invazije, a negativno s opstanak recidiva bez difuznim tipa želučanog karcinoma [17]. Ista grupa pokazao onkogeni ulogu STMN1 karcinoma želuca u in vitro pregled inhibicije proliferacije, migracije i invazije u staničnim linijama želučanih izbacivši STMN1 dolje pomoću siRNA, i in vivo pregled inhibicija ksenograft rast tumora kod golih miševa po siRNA ubacivanja. pregled

Regulacija STMN1 izražavanja Mir-223 je pokazao u hepatocelularnog karcinoma po našoj prethodnoj studiji [18]. Mikro-RNA su klasa jednolančane RNA molekula 21-23 baznih parova u dužinu i regulirati ciljnih gena izraz kroz specifične sparivanja baza interakcija između Mirne i neprevedenih regija ciljanih mRNA [19]. MiRNAs bi djelovala kao onkogena ili tumorske smetnji u ljudskim tumorima i potencijalno koristiti kao novih dijagnostičkih i prognostičkih biomarkera i terapijskih ciljeva. Kod karcinoma želuca, nekoliko miRNAs uključujući Mir-143 i -145 [20], Mir-141 [21], Mir-31 [22] i Mir-106a [23] su regulirani, dok neki oncogenetic miRNAs kao Mir-21 i mir-27a [24] regulira prema gore. pregled

Ova studija ima za cilj istražiti funkcionalnu ulogu STMN1 u razvoju raka želuca i mehanizme regulacije STMN1 u raka želuca. pregled

Rezultati pregled

doreguliranjem STMN1 u želučanom staničnih linija raka i osnovnih uzoraka raka želuca pregled

ekspresija STMN1 mRNA bila je veća u svih 9 želučanim staničnim linijama raka, nego normalan želučanom tkivu, kako je prikazano na slici. 1A. Western blot analiza potvrdila regulaciji STMN1 proteina u 11 želučanog karcinoma staničnih linija (Sl. 1b). Doregulira ekspresiju proteina STMN1 opažena kod 4 od 5 slučajeva primarne želučanih adenokarcinoma usporedbi s odgovarajućim ne-tumorske sluznice želuca (Sl. 1C). QRT-PCR provedena je istražiti razinu ekspresije mRNA STMN1. U primarnoj želuca adenokarcinoma 28 50 slučajeva (56%) pokazalo je više od 1,5 puta doreguliranjem ekspresije STMN1 mRNA u tkivu tumora u usporedbi s odgovarajućim ne-tumorske sluznice. Srednja razina ekspresije STMN1 mRNA bila je značajno viša u uzorcima tumora nego u ne-kancerogen kolege ( p pregled = 0,040, sl. 1d). Pregled

STMN1 izraz korelira s lošom prognozom u difuzni tip raka želuca pregled

Imunohistokemija je obavljena da se provjeri na ekspresiju STMN1 proteina u 111 primarnih uzoraka želučane adenokarcinoma. Izraz STMN1 protein uglavnom je lokaliziran u citoplazmi tumorskih stanica (Sl. 2). Pozitivna imunoreaktivnost uočena je u 96 želučanim adenokarcinome (86,5%). Među tim STMN1-pozitivnih tumora, 40 su pokazali jak (3+), 37 je pokazao srednji (2+) i 19 su pokazali slabu (1+) STMN1 bojenje. Prethodna studija je pokazala da je STMN1 izraz negativno regulirano tumor supresor gena TP53 [25]. Stoga ocjenjuje ekspresiju p53 proteina imunohistokemijski i istražili njegovu korelaciju s razinom STMN1 ekspresije. Nenormalna ekspresija nuklearna p53 pronađen je u 51 (45,9%) od želučanog adenokarcinoma i češće u STMN1-pozitivne tumora (50,0%) nego STMN1-negativnog tumora (20,0%) ( p pregled = 0,03). U kliničko karakteristike 111 bolesnika s želučanog adenokarcinoma i povezanosti s STMN1 izraza su prikazani u tablici 1. STMN1-pozitivni tumori bili su više vjerojatno da će se naći u starosti grupe ( p pregled = 0,07), a povezana je s p53 nuklearna izraz ( p pregled = 0,03), Jednosmjerna analiza pokazala je da starost ( p izvoznici < 0,036), histologiju s difuznim komponente ( p pregled = 0,012), faza ( p izvoznici < 0.0001), T faza ( p pregled = 0,012), N faza ( p izvoznici < 0.0001), M faza ( p
&0.0001), a prisustvo metastaza limfnog čvora ( p pregled i 0.0001) korelira sa slabim preživljavanja bolesti specifične. Do multivarijatne Cox proporcionalnih rizika regresijske analize, samo dob ( p izvoznici < 0.0001) i faza ( p izvoznici < 0.0001) su neovisno povezani s preživljavanjem bolesti specifične (tablica 2). U difuznim tipa želučanog adenokarcinoma, STMN1 izraz bio povezan sa starosti ( p pregled = 0,043), T faza ( p pregled = 0,004), a prisustvo limfnih čvorova metastaza ( p pregled = 0,046). Izražavanje STMN1 u difuzni tip želučanog adenokarcinoma je bio povezan s lošijom opstanak bolesti specifične strane univarijantne analize ( p pregled = 0.01, Sl. 2b). Pregled

odsutnost STMN1 inhibira agresivne fenotip in vitro

Često doreguliranje STMN1 mRNA i proteina u gastričnih tumora sugerira potencijalnu onkogeni ulogu tog gena. Obaranje STMN1 od malih RNA interferencije (siRNA) značajno smanjena mRNA i proteina (slika 3a.) I značajno smanjuje proliferaciju stanica u AGS i MKN7 stanica kao što je pokazano MTT testom ( p pregled < 0.001, Sl. 3B). STMN1 siRNA posredovane rast supresije efekt dodatno je potvrđena testom formiranja jednoslojni kolonija sidrište ovisni. Značajno smanjenje broja kolonija zabilježeno je u stanicama zaraženim s STMN1 siRNA, u usporedbi s otimati kontrole u hranidbeni lanac (smanjen na 49,2% i 68,4% kontrola otimati u AGS i MKN7 respektivno; p izvoznici < 0,001, Sl. 3C) pregled

ispitivanja stanične pokretljivosti, značajno smanjenje u invazivni fenotipa kroz Matrigel obloženih Boydenove komore ( p pregled. <, 0,001, slika 3d) je pokazana u STMN1 siRNA-transfektiranim AGS i MKN7 stanice (smanjena na 51,6% i 46,8% od otimati kontrola u AGS i MKN7 respektivno). U migracija stanica ispitivanjima pomoću bunara propusna podržava, značajan pad u broju stanica koje migriraju kroz mikroporozne membrane ( p izvoznici < 0,001, Slika S1) pronađen je u STMN1 siRNA transfektirana AGS i MKN7 stanice (smanjen na 65,9% i 42,7% od otimati kontrole u AGS i MKN7, pojedinačno), što upućuje na siSTMN1 mogao spriječiti migracije mogućnost želučanih stanica raka. pregled

Budući da je inhibitorni učinak na rast zabilježen je u siSTMN1 inficiranim stanicama, analizirali smo transfektanti za parametre staničnog ciklusa koji koriste protočnom citometrijom. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije, akumulacija G1 stanica uočeno je u siSTMN1 transfektanata u usporedbi s kontrolama jagma siRNA (Sl. 4A). Stanice u G1 fazi povećane su od 47,5% na 53,7% u AGS, 38,0% na 43,4% u MKN7, a 30,1% na 40,1% u SGC7901 stanica. I to je popraćeno smanjenjem S fazi stanica. U skladu s uhićenjem staničnog ciklusa nalazimo u protočnom citometrijom analize, primijetili smo značajno smanjenje fosfo-Rb (S807 /811) u siSTMN1 transfektanata (Sl. 4b). Nadalje, siSTMN1 mogao izazvati kasno apoptozu u četiri rak želuca ispitanih staničnih linija, AGS, MKN1, BGC823 i SGC7901, što je predstavljalo povećanje od cijepanog-PARP (Sl. 4b). Međutim, postoji značajna razlika pronađena je u razini p-AKT (S473) i p-STAT3 (T705) između siSTMN1 i negativnu kontrolu transficirana. Pregled

siSTMN1 inhibira rast tumora želuca in vivo
pregled

kako bi se dodatno istražiti učinak STMN1 na in vivo pregled razvoja želučanog tumora, siSTMN1 i Scramble transfektirane želučane stanice raka su ubrizgava supkutano u desno i lijevo leđne bok golih miševa , respektivno. Od AGS i MKN7 stanice ne čine ksenografta u golih miševa, koristili smo SGC7901 stanice za in vivo
studija. siSTMN1-transfektat formirali manje tumora na desnoj leđnoj boku nego kontrola otimati na lijevoj dorzalnoj boka 3 tjedna nakon injekcije ( p pregled. < 0.01, Slika 4C). pregled

STMN1 je nizvodno meta Mir-223 u rak želuca Netlogu

Kao što je predvidio Targetscan, potencijalni Mir-223 vezno mjesto je pronađena u STMN1 3'UTR (pozicija 12-18 od STMN1 3'UTR). Izražavanje Mir-223 je regulirani u 9 želučanih staničnim linijama karcinoma u usporedbi s normalnim želučanog epitela tkiva (Sl. 5a). Izražavanje Mir-223 negativno povezana sa izrazom STMN1 proteina ( p pregled = 0,05). Mi i dalje procjenjuje izraz STMN1 proteina imunohistokemijski i razinu Mir-223 po QRT-PCR u 31 primarnih uzoraka s rakom želuca. Tumori s više STMN1 imunoreaktivnost (score 2+ i 3+) pokazala je ne-znatan trend prema smanjenju Mir-223 razine ekspresije ( p pregled = 0,137, Sl. 5B). Pregled

za pokazuju potencijalnu supresijski učinak Mir-223 na STMN1 izražavanja, transficirane smo Mir-223 na želučane staničnim linijama karcinoma AGS i MKN7. Mir-223 potiskuje STMN1 mRNA i proteina u obje stanične linije ( p pregled i 0,001, zatim slika 5C).. Dodavanje Mir-223 bloker spasio izraz STMN1 proteina u MKN7 stanica, sugerirajući supresije učinak posebno je izazvana Mir-223 (sl. 5D). Dvostruki luciferaze testovi provedeni su za proučavanje interakcije između Mir-223 i STMN1 3'UTR (Sl. 5E). Reporterske konstrukte koji sadrže predviđene ili mutirane vezna mjesta su kotransfektirane sa miR-223 mimic do MKN28 stanica, rak želuca stanične linije s relativno niskom endogenog STMN1 izražavanja. Mir-223 djeluje jaki inhibicijski učinak na STMN1 3'UTR (49,7%, p pregled < 0,001). Inhibitorni učinak se odstrani kada se sjeme područje je obrisano (Mutant 1), ili olakšava kada 4 nukleotida na području sjemena su mutirane. (67.6%, p pregled < 0.001, Mutant 2) pregled

Rasprava pregled

U ovom istraživanju, pokazali smo gore-regulaciju STMN1 izražavanja u oba mRNA i proteina u želučanog adenokarcinoma u usporedbi s normalnim želučanog epitela. Rezultat sugerira da STMN1 možda onkogeni funkciju u želučanom nastanku tumora. STMN1 je izvijestila da se prognostički biomarkera u nekoliko vrsta raka, uključujući rak debelog crijeva [26], jednjaka stanica karcinoma pločastih [16], hepatocelularnog karcinoma [27], [28], [29], [30] i karcinoma oralni planocelularni stanica [31]. Pokazali smo da STMN1 izraz povezan sa starosti grupe, napredne T pozornici, uz prisustvo limfnih čvorova metastaza, i kraće bolesti specifične za vrijeme preživljavanja u difuzni tip želučanog adenokarcinoma. U skladu sa ovim nalazom, Jeon et al. izvijestio da STMN1 mogli predvidjeti lošu prognozu u difuznom tipu karcinoma želuca i korelira sa vaskularnom invazijom [17]. pregled

STMN1 regulira dinamiku mikrotubula promicanje depolimerizaciju mikrotubula i sprečavanje polimerizaciju tubulina heterodimera. Inhibicija STMN1 ekspresije dovodi do nakupljanja stanica u G2 /M fazi i povezana su sa žestokim diobenog vretena abnormalnostima i poteškoće u izlazu iz mitoze [10]. STMN1 također posreduje efekte p27 (Kip1) na staničnoj pokretljivosti [32]. U sarkoma stanica [33] i ne-malih stanica pluća [34], STMN1 stimulira staničnu pokretljivost i kroz ekstracelularni matriks in vitro
i povećana sposobnost metastaziranja in vivo pregled. U slabo diferenciranim rak želuca staničnim linijama SNU638 i SNU16, siRNA izazvanog STMN1 represija mogao potisnuti proliferaciju stanica In vitro
i In vivo pregled [17]. U ovom istraživanju, pokazali smo da siRNA obaranje STMN1 inhibirana proliferaciju stanica i nastanak kolonija učvršćenja ovisan, oslabljen invaziju i migraciju sposobnost, izazvanu G1 uhićenje i kasno apoptozu u želučanim staničnim linijama karcinoma. Mi dalje pokazala da siSTMN1 inhibiran in vivo
rast raka želuca stanične linije SGC7901. Funkcionalna inhibicija STMN1 lako smanjena broja stanica i invazivni fenotip, što ukazuje na protumorigenic ulogu STMN1 u rak želuca. Pregled

Mir-223 je evolucijski očuvan Mirne koja je u početku bio prijavljen u granulopoiesis i mijeloične diferencijacije [35]. Izraz Mir-233 može biti upravljan od strane mijeloidne transkripcijskih faktora, PU.1 i C /EBPs [36]. To može regulirati nekoliko ciljnih gena, kao što su Mef2c [37], a transcriptive faktor koji promiče mijeloičnu progenitor proliferaciju. Ona također igra važnu ulogu tijekom diferencijaciju osteoklasta [38], a može se poslužiti i kao potencijalni biomarkera za recidivom raka jajnika [39] i sepse [40]. ranije izvijestili smo da STMN1 se pretpostavlja da iza meta Mir-223 u hepatocelularnog karcinoma [18]. U ovom istraživanju, gledali smo nisku Mir-223 razina ekspresije u želučanom staničnim linijama karcinoma i na obrnuti odnos između Mir-223 i STMN1 ekspresije proteina. Od luciferaze testovima utvrdili smo specifičnu interakciju između Mir-223 i STMN1 3'UTR u želučanom stanica raka. Negativni učinak modulacije od Mir-223 dodatno je potkrijepljeno znatno smanjenog nivoa STMN1 proteina u staničnim linijama karcinoma želuca nakon Mir-223 ponovno izražavanja. Rezultati su podržali da STMN1 se pretpostavlja da je meta Mir-223 u želučanim stanicama raka. Zanimljivo, pojačanom ekspresijom Mir-223 ne mijenja staničnu proliferaciju i apoptozu (Slika S2A & 2B), ali znatno izazvana pokretljivost stanica u želučanim stanicama raka (Slika S2C). U skladu sa ovim nalazom, nedavna studija pokazala je da Mir-223 promovira staničnu pokretljivost kroz post-transkripcije silazni tumor supresor EPB41L3 u želučanih stanica raka [41]. Dok jedan Mirna možete ciljati više gena, više Mirna može regulirati jedan gen. Točan molekularna mehaničko prepoznavanje kako dati Mirna doprinosi fenotipskih promjena i dalje izmiče. Pregled

inaktivacija tumor supresor gena TP53 je najčešći i najčešće studirao molekularna zbivanja u ljudskom raka. On je izvijestio da p53 posredovana potiskivanje promotora STMN1, što rezultira negativne regulacije ekspresije STMN1 i G2 /M zastoja staničnog ciklusa [25], [42]. To je općenito prihvaćeno da divlji tip p53 proteina nije moguće otkriti imunohistokemijski jer je nestabilna i ima relativno kraće vrijeme poluraspada. Mutant p53 protein akumulira u jezgri je relativno stabilan i ima duži poluživot, što ga čini detektirati imunohistokemijskim metodama. Stoga jaka i difuzna imunoreaktivnost općenito indikacija mutantnog p53 [43]. Procijenili smo status p53 u želučanom adenokarcinoma imunohistokemijski i otkrili da je neprirodni p53 imunoreaktivnost povezana s višim izrazom STMN1. Stoga je moguće da prekomjerna ekspresija STMN1 možda dijelom i zbog inaktivacije tumor supresor gena p53 u želučanog karcinoma. Pregled

Na kraju, pokazali smo up-regulacije STMN1 u želučanom adenokarcinom a izraz je povezana sa siromašnima preživljenja bez znakova bolesti specifične za difuzni tip karcinoma želuca. Onkogenih vlasništvo STMN1 u želučanom tumorigenezi potvrđena je funkcionalnim istraživanjima. Mi dalje pokazala da je izraz STMN1 negativno regulirano Mir-223 u želučanim stanicama raka. Naše otkriće sugerira da STMN1 može poslužiti kao prognostički biljeg i potencijalni terapijski cilj za difuzni tip želučanog adenokarcinoma. Pregled

materijali i postupci

Stanična linija i kultura stanica pregled

Jedanaest želuca raka stanične linije, MKN28, KATO-III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, dobiveni su iz bilo American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), Riken Cell Bank (Tsukuba, Japan) ili kao dar od Instituta za digestivnu bolesti (IDD) princa Wales bolnice. Ove stanične linije uzgojene su u RPMI 1640 (GIBCO) nadopunjenom s 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, EU GIBCO), 100 U /ml penicilina i 10 ug /ml streptomicina u vlažnoj atmosferi s 5% CO _{2 na 37 ° C. pregled}

kliničkim uzorcima želučane adenokarcinoma

ukupno 111 uzoraka želučane adenokarcinoma dobivene su iz banke tkiva anatomskih i staničnu patologiju Prince of Wales bolnice, Shatin, Hong Kong. Još 5 pari primarnih tumora i susjednim ne-tumorskog tkiva se skupe za vrijeme operacije, kod pacijenata bez terapiju neoadjuvansima. Uzorci su odmah zamrznuti na -80 ° C za daljnju molekularnu analizu. Uzorci biopsije iz 50 pari raka želuca i odgovarajuće ne-kancerozne sluznice su ljubazno daje IDD princa Wales bolnice. Studija je odobren od strane Zajedničkog Kineskog sveučilišta u Hong Kong-u nova područja istočne Cluster Klinička istraživanja Etičko povjerenstvo, Hong Kong (CREC Ref. Br 2009.521), a svi sudionici pod uvjetom pismeni informirani pristanak za prikupljanje uzoraka i naknadne analize. Pregled

ekstrakcija RNA QRT-PCR i mikrornk QRT-PCR pregled

Ukupna RNA ekstrahiranje izvršeno je pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Koncentracija RNK mjerena je NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Visokog kapaciteta cDNA reverznom transkripcijom Kit (Applied Biosystems) su korišteni za sintezu cDNA. Za kvantitativne RT-PCR (QRT-PCR), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) je podnio zahtjev za STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG antisens: CTGACCACACTCTGAGCACCAA proba: Applied Biosystems, 185528556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). Relativna razina ekspresije normalizirana s gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) i izračunati koristeći metodu 2∧ (delta delta Ct). Taqman Mirna probe (Applied Biosystems) korišteni su za kvantifikaciju razine ekspresije zrelog Mir-223. Ukupna RNA je obrnuta transkripcija sa MultiScribe (Applied Biosystems) u reakcijskoj smjesi koja sadrži Mir-specifična matičnih petlje obrnuto transcriptive primer. Sve su reakcije izvedene u triplikatu i vode praznine uključeni su kao negativna kontrola. Pregled

Western blot i imunohistokemijski pregled

Protein se ekstrahira iz želučanog staničnih linija raka i upareni primarnih tkiva pomoću RIPA lizirajućeg pufera s proteinazom inhibitor. Koncentracija proteina je određena metodom Bradford (BPK-Rad) i 20 ug proteina pomiješane s 2 × SDS puferu za punjenje prebaci se po liniji odvojene 12% SDS-poliakrilamid gel elektroforeze. STMN1 protein detektiran s poliklonskim anti-STMN1 antitijela (Cell Signalingŏ2,, 1:1000). Ostali antitijela su iz stanične signalne komercijalno, cijepaju PARP (Asp214) (κ1, 1:1000), fosfo-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), fosfo-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) i fosfo-STAT3 (T705) (Β5, 1:2000). pregled

Imunohistokem je provedena u 4 pm-debljim dijelovima s formalinom fiksne i parafin uklopljenih primjeraka. Nakon de-voskom u ksilenu i ocijenjen je etanol, sekcije se inkubiraju u 3% 'H sub> 2O _{2 otopina tijekom 25 minuta radi blokiranja endogene peroksidaze aktivnosti i nakon toga podvrgnuti mikrovalnoj u citratnom puferu za dohvat antigena. Primarna antitijela (1:25 za STMN1 iz stanične signalne i 1:100 za p53 od Dako) su inkubirane na 4 ° C preko noći i razvoj chromagen izvedena je pomoću sustava EnVision (DAKO). Citoplazmatski izraz STMN1 procijenjena je dodjeljivanjem bodova udjele i ocjenu intenziteta. Udio semaforu prema omjeru tumorskih stanica s pozitivnim citoplazmatske bojenja (0, ni 1, < = 10%, 2, 10 < = 25%; 3 > 25 do 50%, 4, > 50%). Rezultat je intenzitet dodijeljena za prosječnog intenziteta pozitivnih tumorskih stanica (0, nijedan, jedan, slab, 2, srednji, 3, jak). Citoplazmatski rezultat STMN1 je proizvod proporcija i intenziteta rezultate, u rasponu od 0 do 12. citoplazmatski ekspresija je kategoriziran u negativan (rezultat 0), 1+ (rezultat 1-3), 2+ (rezultat 4-6), i 3+ (ocjena 7-12). Nuklearne p53 ekspresija u > 10% tumorskih stanica ocijenjena je kao aberantne prekomjernom ekspresijom pregled}

STMN1 funkcionalnim ispitivanjima pregled

Transfekcija STMN1 siRNA i kontrole jagmiti (QIAGEN) korištenjem Lipofektamin 2000 transfekcijski reagens (. Invitrogen). stanična proliferacija je procijenjena korištenjem Celltiter 96 neradioaktivni proliferacije stanica (Promega) u skladu s uputama proizvođača. Za formiranje kolonija pokusima in monoslojne kulture, stanice su transfektirane s STMN1 siRNA ili kontroli jagma su kultivirani 10 dana. Stanice su fiksirane s 70% etanolom kroz 15 minuta i obojeni 2% kristalno ljubičastog. Kolonije s više od 50 stanica po koloniji su izbrojani. Eksperimenti su ponovljeni tri puta. Pregled

invazije stanica ispitivanja izvedena su pomoću BD Biocoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences). Stanice su nasađene na gornju komoru u mediju kulture koji sadrži 1% FBS, uz potpuni medij (koji sadrži 10% FBS), dodan na dno komore. Nakon 24 sata inkubacije na 37 ° C, stanice koje su izvršile invaziju kroz Matrigel membranu su fiksirane sa 100% metanolom tijekom 2 minute i boje sa 1% toluidin plavila još 2 minute. Za statistike analize, stanice s donje membrane su broje od 5 slučajnih mikroskopskih polja (izvorno povećanje × 400). Svaki eksperiment se izvodi tri puta, i srednja vrijednost je izražena iz 2 nezavisna pokusa. Pregled

stanična migracija ispitivanja izvedena su pomoću transjažična propusna za nosače (Corning, NY). Stanice su sakupljene iz posuda za kulturu 24 sati nakon transfekcije, isprane tri puta s medijem za kulturu i resuspendirane. Zatim 300 ul stanične suspenzije (5 × 10 ^{4 stanica) doda se u transwells, s 500 ul medija za kulturu koji sadrži 10% FBS u donje komore. Nakon 24 sata inkubacije na 37 ° C, stanice koje mogu migrirati kroz mikroporozne membrane su fiksirane sa 100% metanolom tijekom 2 minute i boje sa 1% toluidin plavila još 2 minute. Za statistika analiza, broje se u prilogu broj stanica u 3 Pogled području svake komore slučajno i uzeo prosječan broj stanica svakog polja. Pregled}

protočne citometrije analize za uhićenje staničnog ciklusa

Za staničnog ciklusa analiza, AGS, MKN7 i SGC7901 stanice su prikupljanje u to vrijeme 24 sata nakon transfekcije na pločama od 6 cm. Prije transfekcije, stanice su podvrgnuti gladi za 12 sati za sinkronizaciju. Stanice su sakupljene pomoću hladne PBS i fiksirane u 70% hladnog etanola preko noći na 4 ° C i pomiješa se s 1 ng /ml RNaza A, 10 minuta na 37 ° C. Stanični DNA je označena s 15 ng /ml propidij jodida (PI) 30 minuta na 37 ° C u mraku. Stanice su zatim razvrstane pomoću FACS Calibur protočnom citometru (Becton Dickinson, CA) i staničnog ciklusa profili određeni su pomoću ModFitLT softver (Becton Dickinson, San Diego, CA). Eksperimenti su ponovljeni za dva različita vremena. Pregled

In vivo pregled tumorogenosti studija pregled

SGC7901 stanice (2 x 10 ^{6cells suspendirane u 0.1 ml PBS), transfektirane sa siScramble i siSTMN1 su injektirani supkutano u leđnoj bok devet 4 tjedna starih muških Balb /c golih miševa (siSTMN1 na desnoj strani i negativnim kontrolnim stanicama s lijeve strane). Na stranih tijela su uzeti van i promjer tumora mjerena je i dokumentirano na kraju tjedna 3. volumen tumora (mm 3) procijenjena je mjerenjem najduži i najkraći promjer tumora i računanje na sljedeći način: volumen = (najkraći promjer ) 2 × (najveći promjer) x 0,5. Rukovanje životinja i svi eksperimentalni postupci su odobreni od strane životinja Etičkog odbora Kineskog sveučilišta u Hong Kongu. Pregled}

luciferaze testovi i Mir-223 transfekcija pregled

Prirodni Mir-223 vezno mjesto na 3 'netranslatirano područje (3'UTR) od STMN1 je kloniran u pMIR-PREGLED vektor (Ambion Inc.). Dva mutirani konstrukti su generirani od strane bilo brisanja ili mutacije komplementarnoj sjemena sekvence na Mir-223 veznog područja, kao što je ranije [18] što je opisano. Krijesnice konstrukt luciferaze kotransfektiraju sa Renilla kontrolu prijenosnika luciferaza u MKN28 stanica u prisutnosti bilo sintetičkih Mir-223 molekula ili otimati Mirna kontrole. Dvojni luciferaze testovi (Promega) su provedena 36 sata nakon transfekcije. Lipofektaminje 2000 se koristi za transfekciju Mir-223 u AGS i MKN7 stanica. Pregled

Statistička analiza pregled

Student t-test je korišten za usporedbu razlika u biološkom ponašanju između STMN1 obaranje stanice i posramljen siRNA-transfektiranim stanicama, a između mir-223-transfektirane i otimati Mirna transfecirane stanice. Korelacija između izražavanja STMN1 i kliničko parametara su ocijenjeni od strane neparametrijskim Spearmanov rho rank test. Kaplan-Meier postupak se koristi za procjenu stope preživljavanja za svaku varijablu. U ekvivalencija krivulja preživljavanja testirani su statistike log-rank. Za one varijable koje su statistički značajne naći u univarijantne analizu preživljenja ( p izvoznici < 0,05) je Cox proporcionalnih rizika model sa statistikama omjera vjerojatnosti je korištena da bi ih dodatno ocijeniti za multivarijatne analize preživljavanja. Sve statistička analiza je provedena pomoću SPSS programa (verzija 16.0; SPSS Inc). Dva kraka p pregled-vrijednost manja od 0,05 smatrana je statistički značajna i p pregled-vrijednost manja od 0.001 smatrao vrlo značajnim. Pregled

prateće informacije
Slika S1. pregled siSTMN1 inhibira migraciju stanica kod raka želuca. Reprezentativne slike AGS i MKN7 stanice, koje su transfektirane s siSTMN1 i siScramble tada migrirati kroz mikroporoznom membranom (** p pregled i 0,001) pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0033919. s001 pregled (TIF) pregled slika S2.
funkcionalnu studiju Mir-223 u želučanom staničnim linijama karcinoma. (A) MTT proliferacijske testovi AGS, MKN7 i SGC7901 nakon Mir-223 transfekcije (4 dana nakon transfekcije). (B) Western blot analiza cijepati-PARP u AGS i MKN7 stanica na 24 sata nakon što je Mir-223 ubacivanja. prikazati (C) predstavnik invaziju u Matrigel slike AGS, MKN7 i SGC7901. Mir-223 pojačan invazije stanica mogućnost želučanih stanica raka (*, p izvoznici < 0,01; **, p izvoznici < 0,001). Broj stanica se broje u 3 slučajnim pogledom na polja i odstupanja predstavljeni standardne devijacije pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0033919.s002 pregled (TIF) pregled