PLoS ONE: Stathmin1 Afspiller Onkogen Rolle og er mål for MicroRNA-223 i gastrisk Cancer

Abstrakt

Stathmin1 (STMN1) er en kandidat oncoprotein og prognose markør i flere former for kræft. Denne undersøgelse havde til formål at analysere dens udtryk og biologiske funktioner i mavekræft. Ekspressionen af ​​STMN1 blev vurderet ved QRT-PCR, Western blot og immunohistokemi. Den biologiske funktion af STMN1 blev bestemt ved MTT proliferationsassays, monolag kolonidannelse og celleinvasion assays under anvendelse lille interferens RNA teknik i gastriske cancercellelinier. Vi udforskede også reguleringen af ​​STMN1 udtryk ved microRNA-223. STMN1 blev opreguleret i gastrisk cancer cellelinjer og primære gastriske adenokarcinomer. STMN1-positive tumorer var mere sandsynligt at finde i gamle aldersgruppe og er forbundet med p53 nukleare udtryk. I diffuse form gastrisk adenokarcinomer blev STMN1 udtryk korreleret med alder ( s
= 0,043), T fase ( s
= 0,004) og lymfeknude metastaser ( s
= 0,046). Ekspression af STMN1 i diffust typen gastrisk adenocarcinom blev forbundet med dårlig sygdomsspecifikke overlevelse ved univariat analyse ( s
= 0,01). STMN1 knockdown i AGS og MKN7 cellelinjer undertrykt proliferation ( s
< 0,001), reduceret monolag kolonidannelse ( s
< 0,001), hæmmet celle invasion og migration evne ( p
< 0,001) og induceret G1 fasen anholdelse. siSTMN1 kunne også undertrykke cellevækst in vivo
( s
. < 0 01). Vi endelig bekræftet, at STMN1 er et formodet nedstrøms mål for miR-223 i mavekræft. Vores resultater støttede et onkogent rolle STMN1 i gastrisk cancer. STMN1 kunne tjene som en prognostisk markør og et potentielt terapeutisk mål for mavekræft

Henvisning:. Kang W, Tong JHM, Chan AWH, Lung RWM, Chau SL, Wong QWL, et al. (2012) Stathmin1 Afspiller Onkogen Rolle og er mål for MicroRNA-223 i Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10,1371 /journal.pone.0033919

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: Oktober 17, 2011; Accepteret: 19 Feb 2012; Udgivet: Marts 28, 2012 |

Copyright: © 2012 Kang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af UGC Research Fund samarbejdet (CUHK04 /CRF /08) og bidragyder hjemmeside er http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige ondartetheder og den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. Det har den højeste forekomst i Kina, Japan, Korea og østlige Asien. Den overordnede prognose er dårlig med en 5-års overlevelse under 30% i de fleste lande [1]. Flere potentielle risikofaktorer omfatter høj salt kost, rygning, lavt indtag af frugt og grønt, kronisk gastritis med glandularatrophy og tarm metaplasi, og Helicobacter pylori (H. pylori)
infektion. Det kliniske resultat af H. pylori
infektion har vist sig at blive påvirket af forskellige genetiske faktorer, især H. pylori
-virulence associerede gener såsom KAG
A, vac
A, is
A og bab
A [2]. H. pylori
infektion er også kendt for at inducere ekspressionen af ​​pro-inflammatoriske cyclooxygenase-enzymet (COX-2), som viser opreguleret ekspression i gastrisk cancer [3]. Tidligere undersøgelser har dokumenteret vigtigheden af ​​genetiske og epigenetiske ændringer af onkogener, tumorsuppressorgener og fejlparringsreparationsgener i udviklingen af ​​mavekræft. Protocadherin 10 [4], død-associeret proteinkinase [5], secernerede Frizzled-relateret protein [6] og peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma [7] har vist sig at have reduceret ekspression og tumorsuppressorfunktion i gastrisk carcinogenese. På den anden side, retinsyre-kontrollerede nukleare matrix-associeret protein [8] og ja-associeret protein 1 [9] blev begge opreguleres og udøve onkogene funktion i tumorudvikling.

Stathmin1 (STMN1), også kendt som oncoprotein 18, er et vigtigt cytosolisk mikrotubulus-destabiliserende protein, som spiller afgørende rolle i processen med mitose gennem regulering af mikrotubulusdynamik, og en række andre biologiske processer [10]. Højt niveau af STMN1 ekspression er associeret med dårlig prognose i forskellige maligniteter, herunder brystcancer [11], [12], prostatacancer [13], malignt mesotheliom [14], livmoderhalskræft [15], og esophageal pladecellecarcinom [16] . I 2010 Jeon et al. først rapporteret, at STMN1 overekspression var positivt korreleret med lymfeknude metastaser og avanceret iscenesættelse og vaskulær invasion, og negativt med recidiv overlevelse i diffus form gastrisk karcinom [17]. Den samme gruppe demonstrerede den onkogene rolle STMN1 i gastrisk cancer ved in vitro
inhibering af proliferation, migration og invasion i gastriske cellelinier ved at banke STMN1 ned ved hjælp siRNA, og in vivo
inhibering af xenograft tumorvækst i nøgne mus ved siRNA transfektion.

Regulering af STMN1 ekspression ved mIR-223 er blevet påvist i hepatocellulært carcinom af vores tidligere undersøgelse [18]. Micro-RNA'er er en klasse af enkeltstrengede RNA-molekyler på 21-23 basepar i længden og regulere målgener ekspression gennem specifikke baseparring interaktioner mellem miRNA og utranslaterede regioner af målrettede mRNA'er [19]. MiRNA vil fungere som onkogener eller tumor undertrykkere i humane kræftformer og potentielt bruges som nye diagnostiske og prognostiske biomarkører og terapeutiske mål. I mavekræft, flere miRNA herunder miR-143 og -145 [20], miR-141 [21], miR-31 [22] og miR-106a [23] er nedreguleret, mens nogle oncogenetic miRNA som miR-21 og miR-27a [24] opreguleres.

Denne undersøgelse har til formål at undersøge den funktionelle rolle af STMN1 i gastrisk udvikling kræft og mekanismer for regulering af STMN1 i mavekræft.

Resultater

opregulering af STMN1 i gastrisk cancer-cellelinjer og primære mavekræft prøver

ekspressionen af ​​STMN1 mRNA var højere i alle 9 gastriske cancercellelinier end den normale gastriske væv som vist i fig. 1A. Western blot-analyse bekræftede opregulering af STMN1 protein i 11 gastriske cancercellelinier (fig. 1b). blev observeret opreguleret STMN1 proteinekspression i 4 ud af 5 primære gastriske adenokarcinomer sammenligne med den tilsvarende ikke-tumorøse gastrisk mucosa (fig. 1C). QRT-PCR blev udført for at undersøge STMN1 mRNA-ekspression niveau. I primær gastrisk adenocarcinom, 28 af 50 tilfælde (56%) viste mere end 1,5 gange opregulering af STMN1 mRNA-ekspression i tumorvæv sammenlignet med den tilsvarende ikke-tumorøse slimhinde. Det gennemsnitlige niveau af STMN1 mRNA-ekspression var signifikant højere i tumorprøver end i de ikke-kræft modstykker ( s
= 0,040, Fig. 1D).

STMN1 udtryk korrelerer med dårlig prognose i diffus form gastrisk cancer

Immunhistokemi blev udført for at vurdere STMN1 proteinekspression i 111 primære gastrisk adenocarcinom prøver. Den STMN1 proteinekspression blev primært lokaliseret i cytoplasmaet af tumorcellerne (Fig. 2A). Positive immunreaktivitet blev observeret i 96 gastriske adenokarcinomer (86,5%). Blandt disse STMN1-positive tumorer, 40 viste stærk (3+), 37 viste mellemprodukt (2+) og 19 viste svag (1+) STMN1 farvning. Tidligere undersøgelse har vist, at STMN1 udtryk negativt blev reguleret af tumorsuppressorgen TP53 [25]. Vi vurderede således ekspressionen af ​​p53-protein ved immunohistokemi og udforskes dets korrelation med STMN1 ekspressionsniveau. Aberrant p53-ekspression nuklear blev fundet i 51 (45,9%) af gastriske adenokarcinomer og oftere i STMN1-positive tumor (50,0%) end STMN1-negativ tumor (20,0%) ( s
= 0,03). De clinicopathologic karakteristika 111 patienter med gastrisk adenocarcinom og foreningen med STMN1 udtryk blev vist i tabel 1. STMN1-positive tumorer var mere sandsynligt at finde i gamle aldersgruppe ( s
= 0,07), og i forbindelse med p53 nuklear udtryk ( s
= 0,03), univariat analyse viste, at alderdommen ( s
< 0,036), histologi med diffus komponent ( s
= 0,012), fase ( s
< 0,0001), T fase ( s
= 0,012), N etape ( s
< 0,0001), M fase ( p
< 0,0001) og tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastase ( s Restaurant < 0,0001) korreleret med dårlig sygdomsspecifik overlevelse. Ved multivariat Cox proportionel risiko regressions analyse, kun alder ( s
< 0,0001) og scene ( s
< 0,0001) blev uafhængigt associeret med sygdomsspecifikke overlevelse (Tabel 2). I diffuse form gastrisk adenocarcinom, blev STMN1 udtryk forbundet med alderdommen ( s
= 0,043), T fase ( s
= 0,004) og tilstedeværelsen af ​​lymfeknude metastaser ( s
= 0,046). Ekspression af STMN1 i diffust typen gastrisk adenocarcinom var forbundet med dårligere sygdomsspecifikke overlevelse ved univariat analyse ( s
= 0,01, Fig. 2B).

Silencing af STMN1 hæmmer aggressiv fænotype in vitro

Hyppig opregulering af STMN1 mRNA og protein i gastriske tumorer foreslog en potentiel onkogen rolle af dette gen. Knockdown af STMN1 ved små RNA-interferens (siRNA) markant sænket mRNA og protein niveau (figur 3A.), Og signifikant reduceret celleproliferation i AGS og MKN7 celler som påvist ved MTT-assays ( s Restaurant < 0,001, Fig. 3B). STMN1 siRNA-medieret vækst undertrykkende virkning blev yderligere bekræftet ved forankringsafhængige monolag kolonidannelse assayet. En betydelig reduktion af koloni-numre blev observeret i celler transficeret med STMN1 siRNA sammenlignet med kapløbet kontrol i monolag kultur (reduceret til 49,2% og 68,4% af kapløbet kontrol i AGS og MKN7 henholdsvis; s
< 0,001, . fig 3C)

cellemotilitet assays, en signifikant reduktion i den invasive fænotype gennem Matrigelcoatede Boyden kammer ( s Restaurant <.. 0,001, figur 3D) blev demonstreret i STMN1 siRNA-transficerede AGS og MKN7 celler (reduceret til 51,6% og 46,8% af kapløbet kontrol i AGS og MKN7 henholdsvis). I celle migration assays under anvendelse Transwell Permeable støtter, et signifikant fald i antallet af celler migrerer gennem den mikroporøse membran ( s Restaurant < 0,001, figur S1) blev fundet i STMN1 siRNA transficeret AGS og MKN7 celler (reduceret til 65,9% og 42,7% af kapløbet kontrol i AGS og MKN7 henholdsvis), hvilket antyder siSTMN1 kunne hæmme migration evne gastriske cancerceller.

Da der blev observeret en vækstinhiberende virkning i siSTMN1 transficerede celler, analyserede vi transfektanter for cellecyklus parametre ved hjælp af flowcytometri. Fireogtyve timer efter transfektion blev akkumulering af G1 celler observeret i siSTMN1 transfektanter sammenlignet med de scramble siRNA kontroller (Fig. 4A). Celler i G1 fasen blev forøget fra 47,5% til 53,7% i AGS, 38,0% til 43,4% i MKN7, og 30,1% til 40,1% i SGC7901 celler. Og dette var ledsaget af et fald på S-fase celler. I overensstemmelse med cellecyklusstandsningen fundet i flowcytometrianalyse, observerede vi en signifikant reduktion af phospho-Rb (S807 /811) i siSTMN1 transfektanter (fig. 4B). Desuden siSTMN1 kunne fremkalde sent apoptose i fire gastrisk cancer celle testet, AGS, MKN1, BGC823 og SGC7901 linjer, som blev repræsenteret af en stigning af spaltet-PARP (fig. 4B). Imidlertid blev ingen signifikant forskel i niveauet af p-AKT (S473) og p-Stat3 (T705) mellem siSTMN1 og negativ kontrol transficeret.

siSTMN1 hæmmer væksten af ​​gastrisk tumor in vivo

for yderligere at undersøge effekten af ​​STMN1 på in vivo
vækst af gastrisk tumor, siSTMN1 og kapløbet-transficeret gastriske cancerceller blev injiceret subkutant til højre og venstre dorsale flanke af nøgne mus , henholdsvis. Da AGS og MKN7 celler ikke danner xenografter i nøgne mus, vi brugte SGC7901 celler for in vivo
undersøgelse. siSTMN1-transfektant dannet mindre tumorer på højre dorsale flanke end kapløbet kontrol på den venstre dorsale flanke 3 uger efter injektion ( s
. < 0,01, figur 4C).

STMN1 er en downstream mål for miR-223 i mavekræft

som forudsagt af Targetscan, potentiel miR-223 bindingssted blev fundet i STMN1 3'UTR (position 12-18 af STMN1 3'UTR). Ekspression af MIR-223 blev nedreguleret i 9 gastriske cancercellelinjer sammenlignet med normale gastriske epitel væv (fig. 5A). Ekspression af miR-223 var negativt korreleret med STMN1 proteinekspression ( s
= 0,05). Vi vurderede endvidere STMN1 proteinekspression ved immunhistokemi og niveauet af MIR-223 ved QRT-PCR i 31 primære gastrisk cancer prøver. Tumorer med højere STMN1 immunreaktivitet (score 2+ og 3+) viste en ikke-signifikant tendens til en lavere miR-223 ekspressionsniveauet ( s
= 0,137, fig. 5B).

Til demonstrere potentialet undertrykkende effekt af miR-223 på STMN1 udtryk, vi transficeret miR-223 til gastrisk cancer cellelinjer AGS og MKN7. MIR-223 undertrykte STMN1 mRNA og protein-ekspression i begge cellelinier ( s
< 0,001, figur 5C.). Tilføjelse MIR-223 blokker reddede STMN1 proteinekspression i MKN7 celler, hvilket antyder den undertrykkende virkning blev specifikt induceret af MIR-223 (fig. 5D). Dual luciferase reporter assays blev udført for at studere interaktionen mellem MIR-223 og STMN1 3'UTR (fig. 5E). Reporter konstruktioner indeholdende forudsete eller muterede bindingssteder blev co-transficeret med MIR-223 mimic til MKN28 celler, en gastrisk cancercellelinie med relativt lav endogen STMN1 ekspression. MIR-223 udøvede stærk hæmmende effekt på STMN1 3'UTR (49,7%, s
< 0,001). Den hæmmende effekt blev elimineret, når frøet regionen blev slettet (mutant 1), eller lindres når 4 nukleotider på frø-regionen blev muteret. (67,6%, s
< 0,001, Mutant 2)

diskussion

i denne undersøgelse viste vi den opregulering af STMN1 udtryk i både mRNA og protein niveauer i gastriske adenokarcinomer forhold til den normale gastriske epithel. Resultatet foreslog, at STMN1 kan have onkogen funktion i gastrisk tumorigenese. STMN1 er blevet rapporteret at være en prognostisk biomarkør i flere kræftformer, herunder colorectal cancer [26], esophageal pladecellecarcinom [16], hepatocellulært carcinom [27], [28], [29], [30] og mundtlige pladecellekræft [31]. Vi viste, at STMN1 ekspression forbundet med gamle aldersgruppe, avanceret T stadium, tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastase, og en kortere sygdomsspecifik overlevelsestid i diffust typen gastrisk adenocarcinom. I overensstemmelse med dette fund, Jeon et al. rapporterede, at STMN1 kunne forudsige dårlig prognose i den diffuse form for mavekræft og korrelerer med vaskulær invasion [17].

STMN1 regulerer mikrotubulusdynamik ved at fremme depolymerisering af mikrotubuli og forhindre polymerisering af tubulin heterodimerer. Hæmning af STMN1 udtryk fører til ophobning af celler i G2 /M faser og er forbundet med alvorlige mitosespindelen abnormiteter og vanskeligheder i exit fra mitose [10]. STMN1 medierer også virkningerne af p27 (Kip1) på celle motilitet [32]. I sarkom celler [33] og ikke-småcellet lungecancer [34], STMN1 stimuleret celle motilitet i og gennem den ekstracellulære matrix in vitro
og øget metastatisk potentiale in vivo
. I dårligt differentierede mavekræft cellelinjer SNU638 og SNU16, kunne siRNA-induceret STMN1 undertrykkelse undertrykke celledeling in vitro
in vivo
[17]. I denne undersøgelse viste vi, at siRNA knockdown af STMN1 inhiberede celleproliferation og forankringsafhængige kolonidannelse, nedsat invasion og migration evne, induceret G1 standsning og sen apoptose i gastriske cancercellelinier. Vi yderligere demonstreret, at siSTMN1 hæmmede in vivo
væksten af ​​mavekræft cellelinje SGC7901. Funktionel inhibering af STMN1 let nedsat celleproliferation og invasiv fænotype, hvilket tyder på en protumorigenic rolle STMN1 i gastrisk cancer.

MIR-223 er en evolutionært bevaret miRNA som oprindeligt blev rapporteret i granulopoiese og myeloid differentiering [35]. Ekspressionen af ​​MIR-233 kan drives af de myeloide transkriptionsfaktorer, PU.1 og C /EBPs [36]. Det kunne regulere adskillige målgener, såsom Mef2c [37], en transcriptive faktor, der fremmer myeloid progenitor proliferation. Det spiller også en væsentlig rolle under osteoklastdifferentiering [38], og kunne blive serveret som en potentiel biomarkør for tilbagevendende ovariecancer [39] og sepsis [40]. Vi rapporterede tidligere, at STMN1 er et formodet nedstrøms mål for miR-223 i hepatocellulært carcinom [18]. I denne undersøgelse har vi observeret en lav MIR-223 ekspressionsniveau i gastrisk cancer cellelinjer og et omvendt forhold mellem MIR-223 og STMN1 proteinekspression. Ved luciferase reporter assays bekræftede vi den specifikke interaktion mellem MIR-223 og STMN1 3'UTR i gastriske cancerceller. Gradueringen effekt negativt af miR-223 blev yderligere underbygget af en betydeligt reduceret STMN1 proteinniveauet i gastrisk cancer cellelinjer efter miR-223 re-udtryk. Resultaterne understøttes at STMN1 er et formodet mål for miR-223 i gastriske kræftceller. Interessant nok havde overekspression af MIR-223 ikke ændre celleproliferation og apoptose (fig S2A & 2B), men signifikant induceret cellemotilitet i gastriske cancerceller (fig S2C). I overensstemmelse med dette fund, en nylig undersøgelse viste, at miR-223 fremmet celle motilitet gennem post-transkriptionel nedregulering af tumor suppressor EPB41L3 i gastriske cancerceller [41]. Mens en enkelt miRNA kan målrette flere gener, kan flere miRNA regulere et enkelt gen. Den nøjagtige molekylære mekanistisk identifikation af, hvordan en given miRNA bidrager til de fænotypiske forandringer forbliver undvigende.

Inaktivering af tumorsuppressorgenet TP53 er de mest almindelige og mest studerede molekylære begivenheder i human cancer. Det er blevet rapporteret, at p53 medieret undertrykkelsen af ​​STMN1 promotoraktivitet, hvilket resulterer i negativ regulering af STMN1 ekspression og G2 /M standsning i cellecyklus [25], [42]. Det er blevet almindeligt accepteret, at vildtype p53-protein er ikke detekterbart ved immunhistokemi, fordi det er ustabilt og har en relativt kortere halveringstid. Mutant p53 protein akkumuleret i kernen er relativ stabil og har en længere halveringstid, hvilket gør det påviselige ved immunhistokemi. Derfor er en stærk og diffus immunoreaktivitet er generelt indikativ for mutant p53 [43]. Vi vurderede p53 status i gastrisk adenocarcinom ved immunhistokemi og fandt, at afvigende p53 immunoreaktivitet forbundet med højere STMN1 udtryk. Det er derfor plausibelt, at overekspression af STMN1 måske delvis på grund af inaktivering af tumorsuppressorgen p53 i gastriske cancere.

Afslutningsvis vi demonstreret opregulering af STMN1 i gastrisk adenocarcinom og ekspressionen var korreleret med dårlig sygdomsspecifik overlevelse i diffust typen gastrisk cancer. Den onkogen egenskab STMN1 i gastrisk tumorigenese blev bekræftet af funktionelle studier. Vi yderligere demonstreret, at ekspressionen af ​​STMN1 negativt blev reguleret af miR-223 i gastriske kræftceller. Vores konklusion foreslog, at STMN1 kunne tjene som en prognostisk markør og et potentielt terapeutisk mål for diffus form gastrisk adenocarcinom.

Materialer og metoder

Cell linje og cellekultur

Eleven gastrisk cancercellelinjer MKN28, KATO-III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, blev opnået fra enten American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japan), eller som en gave fra Institute Digestive Disease (IDD) Prins Wales Hospital. Disse cellelinier dyrkes i RPMI 1640 (GIBCO) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, EU GIBCO), 100 U /ml penicillin og 10 ug /ml streptomycin i en befugtet atmosfære af 5% CO _{2 ved 37 ° C.}

Kliniske gastrisk adenocarcinom prøver

i alt 111 gastrisk adenocarcinom prøver blev hentet fra vævsbank af Anatomisk og Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital, Shatin, Hong Kong. Yderligere 5 par af primære tumorer og tilstødende ikke-tumor-væv blev opsamlet under kirurgi fra patienter uden neoadjuvansterapi. Prøverne blev frosset straks i -80 ° C til yderligere molekylær analyse. Biopsi prøver fra 50 par af mavekræft og den tilsvarende ikke-kræft slimhinde blev venligst stillet til rådighed af IDD Prins Wales Hospital. Undersøgelsen er godkendt af Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee, Hongkong (CREC Ref. Nr 2009,521), og alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyse.

RNA-ekstraktion, QRT-PCR og microRNA QRT-PCR

Total RNA-ekstraktion blev udført under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. RNA-koncentrationen blev målt ved NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems) blev anvendt til cDNA-syntese. For kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR), Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) blev ansøgt om STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG; Antisense: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; Probe: Applied Biosystems, 185.528.556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). Den relative ekspressionsniveau blev normaliseret med glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) og beregnes ved hjælp af 2∧ (-delta Delta Ct) metode. Taqman miRNA assays (Applied Biosystems) blev anvendt til at kvantificere ekspressionsniveauerne af kønsmodne MIR-223. Totalt RNA blev vendt transskriberet af MultiScribe (Applied Biosystems) i reaktionsblandingen indeholdende MIR-specifik hårnåle-revers transcriptive primer. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer og vand råemner blev inkluderet som negative kontroller.

Western blot og immunhistokemi

Protein blev ekstraheret fra gastriske cancercellelinier og parrede primære væv under anvendelse RIPA-lysepuffer med proteinase inhibitor. Proteinkoncentration blev målt ved fremgangsmåden ifølge Bradford (Bod-Rad) og 20 ug protein blandet med 2 x SDS loading buffer blev påsat pr bane, adskilt med 12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese. STMN1 protein blev påvist med et polyklonalt anti-STMN1 antistof (Cell Signaling,ŏ2, 1:1000). Andre antistoffer er fra cellesignalering kommercielt, spaltet PARP (Asp214) (κ1, 1:1000), phospho-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), phospho-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) og phospho-Stat3 (T705) (Β5, 1:2000).

Immunhistokemi blev udført i 4 um-tykke sektioner fra formalinfikserede og paraffinindstøbte prøver. Efter de-voksning i xylen og gradueret ethanol blev snit inkuberet i 3% H _{2O 2-opløsning i 25 minutter for at blokere endogen peroxidaseaktivitet aktiviteter, og derefter undergik microwaving i citratbuffer for antigen hentning. De primære antistoffer (1:25 til STMN1 fra Cell Signaling og 1:100 for p53 fra DAKO) blev inkuberet ved 4 ° C natten over og chromagen udvikling blev udført ved anvendelse af EnVision systemet (DAKO). Det cytoplasmatiske ekspression af STMN1 blev vurderet ved at tildele en andel score og en intensitet score. Andelen score var ifølge andel af tumorceller med positiv cytoplasmatisk farvning (0, ingen; 1, < = 10%; 2, 10 til < = 25%, 3, > 25 til 50%, 4, > 50%). Intensiteten score blev tildelt for den gennemsnitlige intensitet af positive tumorceller (0, ingen; 1, svag; 2, mellemprodukt 3, stærk). Den cytoplasmatiske score på STMN1 var et produkt af proportioner og intensitet scoringer, der spænder fra 0 til 12. Den cytoplasmatiske udtryk blev kategoriseret i negativ (score 0), 1+ (score 1 til 3), 2+ (score 4-6), og 3+ (score 7-12). Nuklear p53-ekspression i > 10% af tumorcellerne blev scoret som afvigende overekspression}

STMN1 funktionelle assays

Transfektion af STMN1 siRNA og scramble-kontrol (QIAGEN) blev udført under anvendelse af lipofectamin 2000 transfektionsreagens (. Invitrogen). Celleproliferation blev vurderet ved anvendelse CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) ifølge producentens instruktioner. For kolonidannelse assays i monolagskulturer, celler transficeret med STMN1 siRNA eller scramble-kontrol blev dyrket i 10 dage. Celler blev fikseret med 70% ethanol i 15 minutter og farvet med 2% krystalviolet. Kolonier med mere end 50 celler pr koloni blev talt. Forsøgene blev gentaget tre gange.

celleinvasion assays blev udført under anvendelse af BD BIOCOAT Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences). Transficerede celler blev udsået på øverste kammer i dyrkningsmedium indeholdende 1% FBS, med komplet medium (indeholdende 10% FBS) tilsat til den nederste kammer. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev celler, der invaderede gennem matrigel membranen fikseret med 100% methanol i 2 minutter og farvet med 1% toluidinblåt i yderligere 2 minutter. For statistikker analyse blev celler på undersiden af ​​membranen talt fra 5 tilfældige mikroskopiske felter (oprindelig forstørrelse x 400). Hvert eksperiment blev udført i triplikat, og middelværdien blev udtrykt fra 2 uafhængige eksperimenter.

cellemigration assays blev udført under anvendelse af Transwell Permeable støtter (Corning, NY). Celler blev høstet fra dyrkningsskåle 24 timer efter transfektion, vasket tre gange med dyrkningsmedium og resuspenderet. Derefter 300 ul af cellesuspensionen (5 x 10 ^{4 celler) blev tilsat til transbrøndene, med 500 ul dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS i det nedre kammer. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev celler, der kan migrere gennem den mikroporøse membran fikseret med 100% methanol i 2 minutter og farvet med 1% toluidinblåt i yderligere 2 minutter. For statistik analyse, vi tælles vedlagte celletallet i 3 se områder af hvert kammer tilfældigt og tog det gennemsnitlige antal celler af hvert felt.}

Flowcytometri analyse for cellecyklusstop

For cellecyklus analyse blev AGS, MKN7 og SGC7901 celler opsamling på tidspunktet 24 timer efter transfektion i 6 cm plader. Før transfektion, cellerne undergik sult i 12 timer til synkronisering. Celler blev høstet under anvendelse af kold PBS og fikseret i 70% kold ethanol natten over i 4 ° C og behandlet med 1 ng /ml RNase A i 10 minutter ved 37 ° C. Cellulært DNA blev farvet med 15 ng /ml propidiumiodid (PI) i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Cellerne derefter blev sorteret ved FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, CA) og celle-cyklus-profiler blev bestemt under anvendelse af ModFitLT software (Becton Dickinson, San Diego, CA). Forsøgene blev gentaget to forskellige tidspunkter.

In vivo
tumorgenicitet undersøgelse

SGC7901 celler (2 × 10 ^{6cells suspenderet i 0,1 ml PBS) kortvarigt transficeret med siScramble og siSTMN1 blev injiceret subkutant i den dorsale flanke af ni 4 uger gamle Balb /c nøgne mus (siSTMN1 på den højre side og de negative kontrolceller til venstre). De xenotransplantater blev udtaget og tumor diameter blev målt og dokumenteret i slutningen af ​​uge 3. Tumorvolumen (mm 3) blev estimeret ved at måle den længste og korteste diameter af tumoren og beregning som følger: volumen = (korteste diameter ) 2 × (længste diameter) × 0,5. Håndteringen dyr og alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Animal Ethics Committee for den kinesiske University of Hong Kong.}

Luciferase reporter assays og miR-223 transfektion

Den formodede miR-223 bindingssted på den 3 'utranslaterede region (3'UTR), i STMN1 blev klonet ind pMIR-RAPPORT vektor (Ambion Inc.). To mutante konstruktioner blev genereret ved enten deletion eller mutationer af den komplementære frø sekvens med MIR-223 bindingsregion, som tidligere [18] beskrevne. Den ildflue luciferase konstruktionen blev cotransficeret med Renilla luciferase vektor kontrol i MKN28 cellerne i nærvær af enten syntetiske miR-223 molekyler eller kapløbet miRNA kontrol. Dual luciferase reporter assays (Promega) blev udført 36 timer efter transfektion. Lipofectamine 2000 blev anvendt til transfektion af MIR-223 i AGS og MKN7 celler.

Statistisk analyse

Student T-test blev anvendt til at sammenligne forskellen i biologisk adfærd mellem STMN1 knockdown celler og scramble siRNA-transficerede celler, og mellem mIR-223-transficerede og scramble miRNA transficerede celler. Sammenhæng mellem STMN1 udtryk og clinicopathologic parametre blev vurderet ved parametrisk Spearmans rho rank test. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere overlevelsesrater for hver variabel. De ækvivalens af overlevelseskurverne blev testet ved log-rank statistik. For de variabler være statistisk signifikant fundet i univariate overlevelse analyse ( s
< 0,05), Cox proportional hazards model med forholdet statistik sandsynlighed var ansat til yderligere at evaluere dem for multivariate overlevelse analyse. Alle statistiske analyser blev udført ved SPSS-software (version 16.0; SPSS Inc). En to-tailed s
-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant, og s
-værdi mindre end 0,001 blev betragtet stærkt signifikant.

Støtte Information
Figur S1.
siSTMN1 hæmmer celle migration i mavekræft. Repræsentative billeder af AGS og MKN7 celler, som blev transfekteret med siSTMN1 og siScramble derefter migreret gennem en mikroporøs membran (**, s
< 0,001)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033919. S001
(TIF)
figur S2.
Den funktionelle undersøgelse af miR-223 i gastrisk cancer cellelinjer. (A) MTT proliferative assays af AGS, MKN7 og SGC7901 efter MIR-223 transfektion (4 dage efter transfektion). (B) Western blot-analyse af spaltet-PARP i AGS og MKN7 celler på 24 timer efter MIR-223 transfektion. (C) Repræsentant Matrigel invasion billeder af AGS, MKN7 og SGC7901 vises. miR-223 forbedret celle invasion evne gastriske cancerceller (*, s
< 0,01, **, s
< 0,001). Cellen nummer blev talt i 3 tilfældige udsigt felter og fejlsøjlerne repræsenterede standardafvigelser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033919.s002
(TIF)

• PLoS ONE: glyoxalase-I er en roman Prognose Factor associeret med mavekræft Progression
• PLoS ONE: den prognostiske betydning af apoptose-relaterede biologiske markører i kinesisk Gastric kræftpatienter