PLoS ONE: Stathmin1 Plays Oncogene Rol en een doelwit van MicroRNA-223 in Gastric Cancer

Abstract

Stathmin1 (STMN1) is een kandidaat oncoprotein en de prognose marker in verschillende soorten kanker. Dit onderzoek was gericht op de expressie en biologische functies bij maagkanker analyseren. De expressie van STMN1 werd geëvalueerd door qRT-PCR, western blot en immunohistochemie. De biologische functie van STMN1 werd bepaald door MTT proliferatie assays monolaag kolonievorming en invasie assays met behulp van kleine RNA interferentie techniek maagkanker cellijnen. We hebben ook onderzocht de regulatie van STMN1 expressie door microRNA-223. STMN1 werd opgereguleerd bij maagkanker cellijnen en primaire maag adenocarcinomen. STMN1-positieve tumoren werden meer kans te vinden in oude leeftijdsgroep en in verband met de nucleaire p53 expressie. In diffuse soort maag adenocarcinomen, werd STMN1 expressie gecorreleerd met de leeftijd ( p
= 0,043), T-stadium ( p
= 0,004) en de lymfeklieren metastase ( p
= 0,046). Expressie van STMN1 in diffuse soort adenocarcinoom werd in verband gebracht met een slechte ziektespecifieke overleving met univariate analyse ( p
= 0,01). STMN1 knock-down in AGS en MKN7 cellijnen onderdrukt proliferatie ( p Restaurant < 0,001), verminderde monolaag kolonievorming ( p Restaurant < 0,001), geremd cel invasie en migratie vermogen ( p Restaurant < 0,001) en geïnduceerde G1 fase-arrest. siSTMN1 zou ook de celgroei te onderdrukken In vivo
( p
. < 0 01). We hebben eindelijk bevestigd dat STMN1 is een vermeend stroomafwaarts doelwit van miR-223 bij maagkanker. Onze bevindingen ondersteund een oncogene rol van STMN1 bij maagkanker. STMN1 kan dienen als een prognostische marker en een potentieel therapeutisch doel voor maagkanker

Visum:. Kang W, Tong JHM, Chan AWH, Lung RWM, Chau SL, Wong kwaliteit van de arbeid, et al. (2012) Stathmin1 Speelt Oncogene Rol en een doelwit van MicroRNA-223 bij maagkanker. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10.1371 /journal.pone.0033919

Uitgever: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 17 oktober 2011; Aanvaard: 19 februari 2012; Gepubliceerd: 28 maart 2012

Copyright: © 2012 Kang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie wordt ondersteund door UGC samengewerkt Research Fund (CUHK04 /CRF /08) en de website van de financier is http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd. Het heeft de hoogste incidentie in China, Japan, Korea en Oost Azië. De algehele prognose is slecht met een 5-jaarsoverleving minder dan 30% in de meeste landen [1]. Een aantal potentiële risicofactoren zijn onder meer hoge zoute voeding, roken, lage inname van groenten en fruit, chronische gastritis met glandularatrophy en intestinale metaplasie en Helicobacter pylori (H. pylori)
infectie. De klinische uitkomst van H.
pylori infectie aangetoond worden beïnvloed door verschillende genetische factoren, met name H. pylori
-virulence geassocieerde genen zoals cag Hotels A, vac Hotels A, ice Hotels A en bab Hotels A [2]. H.
pylori infectie is ook bekend dat de expressie van pro-inflammatoire enzym cyclooxygenase (COX-2) die opgereguleerd expressie in maagkanker [3] geeft induceren. Eerdere studies hebben het belang van genetische en epigenetische veranderingen van oncogenen, tumorsuppressorgenen en mismatch repair genen gedocumenteerd in de ontwikkeling van maagkanker. Protocadherine 10 [4], dood geassocieerd proteïne kinase [5], afgescheiden op frizzled-related protein [6] en peroxisoom proliferator geactiveerde receptor gamma [7] is aangetoond dat verminderde expressie en tumor suppressor functie maagkanker hebben. Anderzijds, retinoïnezuur zuur gereguleerde nucleaire matrix-geassocieerde eiwit [8] en ja-geassocieerd eiwit 1 [9] waren zowel opgereguleerd en oefenen oncogene functie tumorontwikkeling.

Stathmin1 (STMN1), ook bekend als oncoprotein 18, is een belangrijke cytosolische microtubule destabiliserende eiwit dat cruciale rol in het proces van mitose door regulatie van microtubule dynamiek speelt, en een verscheidenheid aan andere biologische processen [10]. Hoog STMN1 expressie is geassocieerd met een slechte prognose bij diverse kwaadaardigheden waaronder borstkanker [11], [12], prostaatkanker [13], maligne mesothelioom [14], cervicale kanker [15] en oesofageale plaveiselcelcarcinoom [16] . In 2010, Jeon et al. voor het eerst gemeld dat STMN1 over-expressie werd positief gecorreleerd met lymfeklier metastase en geavanceerde enscenering en vasculaire invasie, en negatief met een recidief-vrije overleving in diffuse soort maagkanker [17]. Dezelfde groep aangetoond dat de oncogene rol van STMN1 bij maagkanker door In vitro
remming van proliferatie, migratie en invasie in de maag cellijnen door kloppen STMN1 neer met behulp van siRNA, en In vivo
remming van xenograft tumorgroei in naakt muizen door siRNA transfectie.

STMN1 Regulatie van expressie van miR-223 is aangetoond in hepatocellulaire carcinoom door onze vorige studie [18]. Micro-RNA's vormen een klasse van enkelstrengs RNA-moleculen van 21-23 basenparen lang en reguleren doelgenen expressie door middel van specifieke basenparing interactie tussen miRNA en getranslateerde gebieden van gerichte mRNA [19]. MiRNAs zou functioneren als oncogenen of tumor suppressors in humane kankers en zijn potentieel als nieuwe diagnostische en prognostische biomerkers en therapeutische doelwitten. In maagkanker, verschillende miRNAs waaronder miR-143 en -145 [20], miR-141 [21], miR-31 [22] en miR-106 bis [23] zijn neerwaarts gereguleerd, terwijl sommige oncogenetische miRNAs, zoals miR-21 en miR-27a [24] worden opgereguleerd.

Deze studie is bedoeld om de functionele rol van STMN1 in de maag de ontwikkeling van kanker en de mechanismen van de regulering van STMN1 bij maagkanker te onderzoeken.

Resultaten

Up-regulatie van STMN1 bij maagkanker cellijnen en primaire maagkanker monsters

de expressie van mRNA STMN1 was hoger in alle 9 maagkanker cellijnen dan de normale maag weefsel zoals getoond in Fig. 1A. Western blot analyse bevestigde de up-regulatie van STMN1 eiwit in 11 maagkanker cellijnen (Fig. 1B). Opgereguleerd STMN1 eiwitexpressie werd waargenomen in 4 van de 5 primaire maag adenocarcinomen vergeleken met hun overeenkomstige niet-tumor maagslijmvlies (Fig. 1C). QRT-PCR werd uitgevoerd om de STMN1 mRNA expressie niveau te onderzoeken. Bij primaire maagdarmkanker, 28 van de 50 gevallen (56%) vertoonde meer dan 1,5-voudige opregulatie van STMN1 mRNA expressie in tumorweefsel ten opzichte van de overeenkomstige niet-tumor mucosa. Het gemiddelde niveau van STMN1 mRNA expressie was significant hoger in tumormonsters dan in de niet-kankerachtige tegenhangers ( p
= 0,040, Fig. 1D).

STMN1 expressie correleert met slechte prognose diffuse soort maagkanker

Immunohistochemie werd uitgevoerd om de STMN1 eiwitexpressie beoordelen in 111 primaire adenocarcinoom van de maag monsters. De STMN1 eiwitexpressie werd hoofdzakelijk gelokaliseerd in het cytoplasma van de tumorcellen (Fig. 2A). Positieve immunoreactiviteit werd waargenomen bij 96 gastrische adenocarcinomen (86,5%). Onder degenen STMN1-positieve tumoren, 40 liet een sterke (3+), 37 liet tussenproduct (2+) en 19 toonde zwak (1+) STMN1 kleuring. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de expressie STMN1 negatief gereguleerd door tumorsuppressorgen TP53 [25]. We hebben daarom onderzocht de expressie van p53-eiwit door immunohistochemie en onderzochten de correlatie met STMN1 expressie niveau. Afwijkende p53 kern werd gevonden in 51 (45,9%) van gastrische adenocarcinomen en vaker in STMN1-positieve tumor (50,0%) dan STMN1-negatieve tumor (20,0%) ( p
= 0,03). De clinicopathologic kenmerken van 111 patiënten met adenocarcinoom van de maag en de associatie met STMN1 meningsuiting werden getoond in Tabel 1. STMN1-positieve tumoren werden meer kans te vinden in oude leeftijdsgroep ( p
= 0,07), en in verband met p53 nucleaire expressie ( p
= 0,03), Univariate analyse gaf aan dat de ouderdom ( p Restaurant < 0,036), histologie met diffuse component ( p
= 0,012), podium ( p Restaurant < 0,0001), T-stadium ( p
= 0,012), N-stadium ( p Restaurant < 0,0001), M fase ( p
< 0,0001) en de aanwezigheid van lymfeklier metastase ( p Restaurant < 0,0001) gecorreleerd met een slechte ziektespecifieke overleving. Door multivariate Cox proportional hazards regressie-analyse, alleen leeftijd ( p Restaurant < 0,0001) en fase ( p Restaurant < 0,0001) werden onafhankelijk geassocieerd met de ziekte-specifieke overleving (tabel 2). In diffuse soort adenocarcinoom van de maag, was STMN1 expressie geassocieerd met ouderdom ( p
= 0,043), T-stadium ( p
= 0,004) en de aanwezigheid van lymfeklier metastase ( p
= 0,046). Expressie van STMN1 in diffuse soort adenocarcinoom werd geassocieerd met een slechtere ziekte-specifieke overleving met univariate analyse ( p
= 0,01, Fig. 2B).

Silencing van STMN1 remt de agressieve fenotype in vitro

Frequent opregulatie van STMN1 mRNA en eiwit in de maag tumoren suggereerde een mogelijke oncogene rol van dit gen. Knockdown van STMN1 door kleine RNA-interferentie (siRNA) aanzienlijk verlaagd mRNA en eiwit niveau (Fig 3A.) En een aanzienlijk verlaagde celproliferatie in AGS en MKN7 cellen zoals aangetoond door MTT assays ( p Restaurant < 0,001, Fig. 3B). STMN1 siRNA-gemedieerde groei onderdrukkende effect werd verder bevestigd door ankerafhankelijke monolaag kolonievorming assay. Een significante vermindering van kolonie aantallen waargenomen in cellen getransfecteerd met siRNA STMN1 tegenover scramble controles in monolaagkweek (verlaagd tot 49,2% en 68,4% scramble controles AGS en MKN7 respectievelijk p
< 0,001, fig. 3C)

in celmotiliteit assays, een aanzienlijke vermindering van de invasieve fenotype door het Matrigel-beklede Boyden-kamer ( p
<.. 0,001, Fig 3D) is aangetoond in STMN1 -siRNA getransfecteerde AGS en MKN7 cellen (respectievelijk verlaagd tot 51,6% en 46,8% van de scramble controles in AGS en MKN7). In celmigratie assays gebruikt Transwell Permeable steunt een significante daling van het aantal cellen migreren door het microporeuze membraan ( p
< 0,001, figuur S1) werd gevonden in STMN1 siRNA getransfecteerde AGS en MKN7 cellen (verlaagd tot 65,9% en 42,7% van de scramble controles in AGS en MKN7, respectievelijk), wat suggereert siSTMN1 kon de migratie vermogen van maagkanker cellen te remmen.

Sinds een groei-remmend effect in siSTMN1 getransfecteerde cellen werd waargenomen, analyseerden we de transfectanten voor celcyclus parameters met behulp van flowcytometrie. Vierentwintig uur na transfectie werd accumulatie van G1 cellen waargenomen in siSTMN1 transfectanten vergeleken met de scramble siRNA controles (Fig. 4A). Cellen in de G1-fase werd verhoogd van 47,5% tot 53,7% in AGS, 38,0% tot 43,4% in MKN7 en 30,1% tot 40,1% in SGC7901 cellen. Die gepaard ging met een afname van de S-fase cellen. Overeenkomstig de celcyclus arrestatie in flow cytometrische analyse zagen we een significante reductie van fosfo-Rb (S807 /811) in siSTMN1 transfectanten (Fig. 4B). Bovendien siSTMN1 kon late apoptose in vier maagkanker cellijnen getest, AGS, MKN1, BGC823 en SGC7901, die werd vertegenwoordigd door een toename van de gesplitst-PARP (Fig. 4B). Er werd echter geen significant verschil gevonden in het niveau van p-AKT (S473) en p-Stat3 (t705) tussen siSTMN1 en negatieve controle getransfecteerd.

siSTMN1 remt de groei van maagtumor In vivo

om verder te onderzoeken het effect van STMN1 op in vivo
groei van de maag tumor, siSTMN1 en-scramble getransfecteerde maagkanker cellen werden subcutaan geïnjecteerd om de rechter en linker dorsale flank van naakt muizen respectievelijk. Sinds AGS en MKN7 cellen niet xenotransplantaten in naakt muizen te vormen, gebruikten we SGC7901 cellen voor In vivo
studie. siSTMN1-transfectant gevormd kleinere tumoren aan de rechter dorsale flank dan scramble pijlen aan de linkerkant dorsale flank 3 weken na de injectie ( p
. < 0,01, figuur 4C).

STMN1 is een downstream doelwit van miR-223 bij maagkanker

Zoals voorspeld door Targetscan, potentiële miR-223 bindingsplaats werd gevonden in de STMN1 3'UTR (positie 12-18 van STMN1 3'UTR). Expressie van miR-223 werd downgereguleerd in 9 maagkanker cellijnen verhouding tot de normale gastrische epitheel weefsel (Fig. 5A). Expressie van miR-223 werd negatief gecorreleerd met STMN1 eiwitexpressie ( p
= 0,05). We verder onderzocht de STMN1 eiwit expressie door immunohistochemie en het niveau van miR-223 door qRT-PCR in 31 primaire maagkanker monsters. Tumoren met hogere STMN1 immunoreactiviteit (score 2+ en 3+) liet een niet-significante trend naar een lagere miR-223 expressie niveau ( p
= 0.137, Fig. 5B).

Om tonen het potentieel onderdrukkende effect van miR-223 op STMN1 expressie, we getransfecteerde miR-223 aan maagkanker cellijnen AGS en MKN7. MiR-223 onderdrukt STMN1 mRNA en eiwitexpressie in beide cellijnen ( p Restaurant < 0,001, figuur 5C.). Het toevoegen van miR-223 blocker redde de STMN1 eiwitexpressie in MKN7 cellen, wat suggereert dat het onderdrukkende effect werd specifiek geïnduceerd door miR-223 (Fig. 5D). Dubbele luciferase reporter assays werden uitgevoerd om de interactie tussen miR-223 en STMN1 3'UTR (fig. 5E) te bestuderen. De reporter constructen die voorspeld of gemuteerde bindingsplaatsen werden gecotransfecteerd met miR-223 nabootsen MKN28 cellen, een maagkanker cellijn met een relatief lage endogene STMN1 expressie. MiR-223 uitgeoefend sterk remmend effect op STMN1 3'UTR (49,7%, p Restaurant < 0,001). Het remmende effect werd geëlimineerd bij het zaad regio is geschrapt (Mutant 1), of verlicht wanneer 4 nucleotiden op het zaad regio werden gemuteerd. (67,6%, p Restaurant < 0,001, Mutant 2)

Discussie

in deze studie hebben we aangetoond dat de up-regulatie van expressie in zowel STMN1 mRNA en eiwit niveaus in gastrisch adenocarcinoom in vergelijking met normale gastrische epitheel. Het resultaat suggereerde dat STMN1 oncogene functie in de maag ontstaan ​​van tumoren zou kunnen hebben. STMN1 is vermeld dat een prognostische biomarker in verschillende kankers waaronder colorectale kanker [26], esophageal plaveiselcelcarcinoom [16], hepatocellulair carcinoom [27] zijn, [28], [29], [30] en orale plaveiselcelcarcinoom [31]. We hebben aangetoond dat STMN1 expressie geassocieerd met ouderdom groep, geavanceerde T-stadium, de aanwezigheid van lymfeklier metastase, en een kortere ziekte-specifieke overleving tijd in diffuse soort adenocarcinoom van de maag. In overeenstemming met deze bevinding, Jeon et al. gemeld dat STMN1 slechte prognose kunnen voorspellen in het diffuse type maagkanker en correleren met vasculaire invasie [17].

STMN1 regelt dynamiek van microtubuli door depolymerisatie van microtubuli bevorderen en het voorkomen van polymerisatie van tubuline heterodimeren. Remming van STMN1 expressie leidt tot accumulatie van cellen in de G2 /M-fasen en is geassocieerd met ernstige mitotische spoel afwijkingen en problemen met de uitgang van mitose [10]. STMN1 bemiddelt ook de effecten van p27 (Kip1) op celmotiliteit [32]. In sarcoom cellen [33] en niet-kleincellige longkanker [34], STMN1 gestimuleerd celmotiliteit in en door de extracellulaire matrix In vitro Kopen en verhoogde de metastatische potentiële In vivo
. In slecht gedifferentieerde maagkanker cellijnen SNU638 en SNU16, kon-siRNA veroorzaakte STMN1 repressie celproliferatie In vitro Kopen en onderdrukken In vivo
[17]. In deze studie hebben we aangetoond dat siRNA knock-down van STMN1 remden celproliferatie en verankering-afhankelijke kolonie vorming, verminderde invasie en migratie capaciteit, geïnduceerde G1 arrestatie en late apoptose in maagkanker cellijnen. We verder aangetoond dat siSTMN1 remde In vivo
groei van maagkanker cellijn SGC7901. Functionele remming van STMN1 gemakkelijk afgenomen celproliferatie en invasieve fenotype suggereert een rol van protumorigenic STMN1 bij maagkanker.

MiR-223 is een evolutionair geconserveerd miRNA die aanvankelijk werd gemeld in granulopoëse en myeloïde differentiatie [35]. De expressie van miR-233 kan worden aangedreven door de myeloïde transcriptiefactoren, PU.1 en C /Ebps [36]. Het kan meerdere target genen reguleren zoals MEF2C [37], een transcriptiesymbolen factor die myeloïde voorlopercellen proliferatie bevordert. Het speelt ook een essentiële rol bij de differentiatie van osteoclasten [38], en kunnen worden gepresenteerd als een potentiële biomarker voor recidiverende ovariumkanker [39] en sepsis [40]. We meldden eerder dat STMN1 is een vermeend stroomafwaarts doelwit van miR-223 in leverkanker [18]. In deze studie, zagen we een lage miR-223 expressieniveau in maagkanker cellijnen en een omgekeerde relatie tussen miR-223 en STMN1 eiwitexpressie. Door luciferase reporter assays, bevestigden we de specifieke interactie tussen miR-223 en STMN1 3'UTR bij maagkanker cellen. De negatieve modulatie-effect door miR-223 werd verder bevestigd door een significant verminderde STMN1 eiwitgehalte in maagkanker cellijnen na miR-223 re-expressie. De resultaten worden ondersteund dat STMN1 is een vermoedelijke doelwit van miR-223 bij maagkanker cellen. Intrigerend overexpressie van miR-223 niet celproliferatie en apoptose te veranderen (figuur S2A & 2B) maar aanzienlijk geïnduceerde cel beweeglijkheid bij maagkanker cellen (Figuur S2C). In overeenstemming met deze bevinding, een recente studie toonde aan dat miR-223 bevorderd celmotiliteit door post-transcriptie downregulatie van de tumor suppressor EPB41L3 bij maagkanker cellen [41]. Terwijl een miRNA meerdere genen kunnen targeten, kunnen meerdere miRNA een enkel gen reguleren. De exacte moleculaire mechanistische identificatie van hoe een bepaalde miRNA bijdraagt ​​aan de fenotypische veranderingen blijft ongrijpbaar.

Inactivering van tumorsuppressorgen TP53 is de meest voorkomende en meest bestudeerde moleculaire gebeurtenissen in humane kanker. Vermeld is dat p53 gemedieerde onderdrukking van STMN1 promotoractiviteit, waardoor negatieve regulatie van expressie STMN1 en G2 /M arrestatie in de celcyclus [25], [42]. Het is algemeen aanvaard dat wild-type p53-eiwit is niet detecteerbaar met immunohistochemie omdat het onstabiel en heeft een relatief korte halfwaardetijd. Mutant p53 proteïne geaccumuleerd in de kern is relatief stabiel en heeft een langere halfwaardetijd, die detecteerbaar is door immunohistochemie maakt. Daarom is een sterke en diffuse immunoreactiviteit in het algemeen indicatief voor mutant p53 [43]. Wij hebben de p53-status adenocarcinoom van de maag door immunohistochemie en vond dat afwijkende p53 immunoreactiviteit geassocieerd met een hogere STMN1 expressie. Het is daarom aannemelijk dat overexpressie van STMN1 misschien gedeeltelijk te wijten aan inactivatie van tumor suppressor gen p53 bij maagkanker.

Tot slot we de up-regulatie van STMN1 aangetoond in adenocarcinoom van de maag en de expressie was gecorreleerd met een slechte ziekte-specifieke overleving in diffuse soort maagkanker. De oncogene eigendom van STMN1 in de maag het ontstaan ​​van tumoren werd bevestigd door functionele studies. Verder hebben we aangetoond dat de expressie van STMN1 negatief gereguleerd door miR-223 bij maagkanker cellen. Onze bevinding suggereerde dat STMN1 zou kunnen dienen als een prognostische marker en een potentieel therapeutisch doel voor diffuse soort adenocarcinoom van de maag.

Materialen en methoden
celcultuur

Eleven gastric

Mobiele lijn en kankercellijnen, MKN28, KATO III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901 werden verkregen bij de American Culture Collection Type (Rockville, MD, USA), RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japan) of als een geschenk van Instituut Digestive Disease (IDD) van Prince Wales Hospital. Deze cellijnen worden gekweekt in RPMI 1640 (GIBCO), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, EU GIBCO), 100 U /ml penicilline en 10 ug /ml streptomycine in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO _{2 bij 37 ° C.}

Clinical adenocarcinoom monsters

Een totaal van 111 maagdarmkanker monsters werden opgehaald uit de weefselbank van anatomische en Cellulaire Pathologie, Prince of Wales Hospital, Shatin, Hong Kong. Een andere 5 paren van primaire tumoren en naburige niet-tumor weefsels werden verzameld tijdens chirurgie van patiënten zonder neoadjuvante therapie. De monsters werden direct ingevroren in -80 ° C voor verdere moleculaire analyse. Biopsie specimens uit 50 paren van maagkanker en de overeenkomstige niet-kanker mucosa werden vriendelijk verschaft door IDD Prince Wales Hospital. De studie is goedgekeurd door de Joint Chinese University of Hong Kong New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee, Hong Kong (CREC Ref nr. 2009,521) en alle deelnemers gaven schriftelijk toestemming voor het verzamelen van monsters en de daaropvolgende analyse.

RNA-extractie, qRT-PCR en microRNA qRT-PCR

Totaal RNA extractie werd uitgevoerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. RNA-concentratie werd gemeten door NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Hoge capaciteit cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) werden gebruikt voor cDNA synthese. Voor kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR), Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) werd toegepast STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG; Antisense: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; Probe: Applied Biosystems, 185.528.556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). De relatieve expressieniveau werd genormaliseerd met glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) berekend volgens de (-Delta Delta Ct) methode 2∧. Taqman miRNA assays (Applied Biosystems) werden gebruikt om de expressieniveaus van volwassen miR-223 kwantificeren. Totaal RNA werd omgekeerd getranscribeerd door MultiScribe (Applied Biosystems) in het reactiemengsel dat miR-specifieke stam-lus omgekeerde transcriptiesymbolen primer. Alle reacties werden uitgevoerd in drievoud en water blanco werden als negatieve controles.

Western blot en immunohistochemie

Eiwit werd geëxtraheerd uit maagkanker cellijnen en primaire gepaarde weefsels met behulp RIPA lysisbuffer met proteinase inhibitor. De eiwitconcentratie werd gemeten met de werkwijze van Bradford (BZV-Rad) en 20 ug eiwit gemengd met 2 x SDS-laadbuffer werd geladen per baan gescheiden door 12% SDS-polyacrylamide gelelektroforese. STMN1 eiwit werd gedetecteerd met een polyklonaal anti-STMN1 antilichaam (Cell Signaling,ŏ2, 1:1000). Andere antilichamen zijn van cell signaling commercieel, gesplitst PARP (Asp214) (κ1, 1:1000), fosfo-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), fosfo-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) en fosfo-Stat3 (t705) (Β5, 1:2000).

Immunohistochemie werd uitgevoerd in 4 urn dikke secties van formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde specimens. Na de-waxen in xyleen en ingedeeld ethanol, secties werden in 3% H _{2O 2-oplossing gedurende 25 minuten om endogene peroxidase activiteiten te blokkeren en vervolgens onderging de magnetron in citraatbuffer voor antigen herstel. De primaire antilichamen (1:25 voor STMN1 van Cell Signaling en 1:100 voor p53 van DAKO) werden geïncubeerd bij 4 ° C overnacht en chromageen ontwikkeling werd uitgevoerd met het EnVision systeem (DAKO). De cytoplasmatische expressie van STMN1 werd bepaald door het toewijzen van een deel score en een intensiteit score. Het percentage score was volgens percentage tumorcellen met positieve cytoplasmatische kleuring (0, geen, 1, < = 10%; 2, 10 tot < = 25%, 3, > 25 tot 50%; 4 > 50%). De intensiteit score werd toegekend voor de gemiddelde intensiteit van de positieve tumorcellen (0, geen, 1, zwak, 2, intermediate, 3, sterk). De cytoplasmatische score van STMN1 was het product van deel en intensiteit scores, variërend van 0 tot 12. De cytoplasmatische expressie werd onderverdeeld in negatief (score 0), 1+ (score 1-3), 2+ (score 4-6) en 3+ (score 7-12). Nucleaire p53-expressie in > 10% van de tumorcellen werd gescoord als afwijkende overexpressie}

STMN1 functionele assays

Transfectie van STMN1 siRNA en scramble controle (QIAGEN) werd uitgevoerd met behulp van Lipofectamine 2000 transfectiereagens (. Invitrogen). Celproliferatie werd gemeten met CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) volgens de instructies van de fabrikant. Voor kolonievorming assays monolaagkweken cellen getransfecteerd met siRNA STMN1 of scramble controle werden gedurende 10 dagen. Cellen werden gefixeerd met 70% ethanol gedurende 15 minuten en gekleurd met 2% kristalviolet. Kolonies met meer dan 50 cellen per kolonie geteld. De experimenten werden in drievoud herhaald.

De invasie assays werden uitgevoerd met BD Biocoat Matrigel invasie Chambers (BD Biosciences). Getransfecteerde cellen werden op de bovenste kamer in kweekmedium dat 1% FBS, met compleet medium (met 10% FBS) toegevoegd aan de onderste kamer. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C werden cellen die binnengevallen door de Matrigel membraan gefixeerd met 100% methanol gedurende 2 minuten en gekleurd met 1% toluïdineblauw nog eens 2 minuten. Voor statistische analyse cellen aan de onderkant van het membraan werd geteld van 5 willekeurig microscopische velden (oorspronkelijke vergroting x 400). Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd en de gemiddelde waarde werd uitgedrukt van 2 onafhankelijke experimenten.

De celmigratie assays werden uitgevoerd met Transwell Doorlaatbare steunt (Corning, NY). De cellen werden geoogst van kweekschalen 24 uur na transfectie, driemaal gewassen met kweekmedium en opnieuw gesuspendeerd. Vervolgens 300 ul van de celsuspensie (5 x 10 ^{4 cellen) werd toegevoegd aan de transwells, met 500 gl kweekmedium dat 10% FBS in de onderste kamer. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C werden cellen die door het microporeuze membraan kunnen migreren gefixeerd met 100% methanol gedurende 2 minuten en gekleurd met 1% toluïdineblauw nog eens 2 minuten. Voor de statistiek analyse, hebben we de bijgevoegde aantal cellen in 3 velden van elke kamer willekeurig uitzicht en nam het gemiddelde aantal cellen van elk veld.}

Flowcytometrieanalyse voor celcyclus

Voor de celcyclus analyse, AGS, MKN7 en SGC7901 cellen werden het verzamelen op het moment dat 24 uur na transfectie in 6 cm platen. Voor transfectie werden de cellen ondergingen hongerdood 12 uur voor synchronisatie. Cellen werden geoogst met koud PBS en in 70% koude ethanol overnacht gefixeerd in 4 ° C en behandeld met 1 ng /ml RNase A gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Cellulair DNA werd gekleurd met 15 ng /ml propidiumjodide (PI) gedurende 30 minuten bij 37 ° C in het donker. De cellen werden vervolgens gesorteerd door FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, CA) en celcyclus profielen werden bepaald met behulp van de ModFitLT software (Becton Dickinson, San Diego, CA). De experimenten werden herhaald voor twee verschillende tijdstippen.

In vivo
tumorigeniciteitsonderzoek

SGC7901 cellen (2 x 10 ^{6cells gesuspendeerd in 0,1 ml PBS) tijdelijk met siScramble en siSTMN1 werden subcutaan geïnjecteerd in de dorsale flank van negen 4 weken oude mannelijke Balb /c muizen naakt (siSTMN1 rechts en de negatieve controle cellen aan de linkerkant). De xenotransplantaten werden uitgenomen en tumordiameter werd als volgt gemeten en gedocumenteerd eind week 3. tumorvolume (mm 3) werd geschat door meting van de langste en kortste diameter van de tumor en het berekenen: volume = (kortste diameter ) 2 × (langste diameter) × 0,5. Het dier handling en alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Chinese Universiteit van Hong Kong.}

Luciferase reporter assays en miR-223 transfectie

De vermeende miR-223 bindingsplaats de 3 'niet-getranslateerde gebied (3'UTR) van STMN1 werd gekloneerd in vector PMIR-REPORT (Ambion Inc.). Twee mutante constructen werden gegenereerd door ofwel deletie of mutaties van de complementaire sequentie zaad de miR-223 bindingsgebied, zoals eerder [18] beschreven. De vuurvlieg luciferase construct werd gecotransfecteerd met Renilla luciferase vectorcontrole in MKN28 cellen in de aanwezigheid van ofwel synthetische miR-223 moleculen of scramble miRNA controle. Dubbele luciferase reporter assays (Promega) werden 36 uur na transfectie. Lipofectamine 2000 werd gebruikt voor de transfectie van miR-223 in AGS en MKN7 cellen.

Statistische analyse

De Student T-test werd gebruikt om het verschil in biologisch gedrag tussen STMN1 knockdown cellen en scramble vergelijken -siRNA getransfecteerde cellen, en tussen miR-223-getransfecteerde en scramble miRNA getransfecteerde cellen. Correlatie tussen STMN1 expressie en clinicopathologic parameters werden beoordeeld door parametrische Spearman's rho rank test. De Kaplan-Meier-methode werd gebruikt om de overlevingskansen te schatten voor elke variabele. De equivalenties van het voortbestaan ​​curves werden getest door log-rank statistiek. Voor deze variabelen statistisch significant in de univariate survival analyse ( p Restaurant < 0,05), het Cox proportionele risico model met de likelihood ratio statistiek werd gebruikt om hen verder te evalueren voor multivariate survival analyse. Alle statistische analyse werd uitgevoerd door SPSS-software (versie 16.0, SPSS Inc). Een tweezijdig p
-waarde van minder dan 0,05 werd statistisch significant geacht en de p
-waarde minder dan 0,001 werd zeer belangrijk geacht.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
siSTMN1 remt celmigratie bij maagkanker. Representatieve foto's van AGS en MKN7 cellen die werden getransfecteerd met siSTMN1 en siScramble vervolgens gemigreerd door een microporeuze membraan (**, p Restaurant < 0,001)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033919. S001
(TIF)
Figuur S2. Ondernemingen De functionele studie van miR-223 bij maagkanker cellijnen. (A) MTT proliferatieve assays van AGS, MKN7 en SGC7901 na miR-223 transfectie (4 dagen na transfectie). (B) Western blot analyse van gesplitst PARP in AGS en MKN7 cellen op 24 uur na transfectie miR-223. (C) Vertegenwoordiger Matrigel invasie beelden van AGS, MKN7 en SGC7901 worden getoond. miR-223 verbeterde de cel invasie vermogen van maagkanker cellen (*, p Restaurant < 0,01; **, p Restaurant < 0,001). Het aantal cellen werd geteld in 3 willekeurige uitzicht velden en de fout bars vertegenwoordigd standaarddeviaties
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033919.s002
(TIF)

• PLoS ONE: glyoxalase-I is een nieuwe Prognose Factor geassocieerd met maagkanker Progression
• PLoS ONE: De prognostische betekenis van apoptose-gerelateerde biologische merkers in het Chinees MaagKanker Patients