PLoS ONE: Stathmin1 Riproduce oncogenici di ruolo ed è un obiettivo di MicroRNA-223 in gastrico Cancer

Estratto

Stathmin1 (STMN1) è un candidato oncoprotein e pennarello la prognosi in diversi tipi di tumori. Questo studio è stato finalizzato ad analizzare le sue funzioni di espressione e biologiche nel cancro gastrico. L'espressione di STMN1 è stata valutata mediante qRT-PCR, Western Blot e immunoistochimica. La funzione biologica di STMN1 è stata determinata mediante saggi MTT proliferazione, la formazione di colonie monostrato e saggi di invasione delle cellule utilizzando piccole tecnica RNA interferenza nelle linee di cellule di cancro gastrico. Abbiamo anche esplorato la regolazione dell'espressione STMN1 da microRNA-223. STMN1 stato upregulated in linee cellulari di cancro gastrico e adenocarcinomi gastrici primarie. tumori STMN1-positivi sono stati più probabilità di essere trovati nella vecchia fascia di età e associati a p53 espressione nucleare. In tipo diffuso adenocarcinomi gastrici, espressione STMN1 è stata correlata con l'età ( p
= 0.043), stadio T ( p
= 0.004) e metastasi linfonodali ( p =
0,046). L'espressione di STMN1 nel tipo diffuso adenocarcinoma gastrico è risultato associato a scarsa sopravvivenza malattia specifica analisi univariata ( p
= 0.01). STMN1 atterramento in linee cellulari AGS e MKN7 proliferazione soppresso ( p
< 0,001), ridotta formazione monostrato colonia ( p
< 0,001), l'invasione delle cellule inibita e capacità di migrazione ( p
< 0.001) e indotto arresto fase G1. siSTMN1 potrebbe anche sopprimere la crescita delle cellule in vivo
( p
. < 0 01). Abbiamo finalmente confermato che STMN1 è un bersaglio a valle putativo di miR-223 nel cancro gastrico. I nostri risultati supportati un ruolo oncogenico di STMN1 nel cancro gastrico. STMN1 potrebbe servire come marcatore prognostico e un potenziale bersaglio terapeutico per il cancro gastrico

Visto:. Kang W, Tong JHM, Chan AWH, Lung RWM, Chau SL, Wong QWL, et al. (2012) Stathmin1 Plays oncogenici di ruolo ed è un obiettivo di MicroRNA-223 in cancro gastrico. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10.1371 /journal.pone.0033919

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 17 Ottobre 2011; Accettato: 19 febbraio 2012; Pubblicato: 28 marzo 2012

Copyright: © 2012 Kang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo studio è supportata dal Fondo di ricerca Collaborazione UGC (CUHK04 /CRF /08) e il sito web del finanziatore è http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico è una delle neoplasie più comuni e la seconda causa più frequente di morte per cancro in tutto il mondo. Ha la più alta incidenza in Cina, Giappone, Corea e in Asia orientale. La prognosi è scarsa, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 30% nella maggior parte dei paesi [1]. Diversi potenziali fattori di rischio includono dieta ad alto contenuto di sale, il fumo, scarsa assunzione di frutta e verdura, gastrite cronica con glandularatrophy e metaplasia intestinale, e Helicobacter pylori (H. pylori)
infezione. L'esito clinico di H. pylori
infezione ha dimostrato di essere influenzato da vari fattori genetici, in particolare H. pylori
-virulence geni associati come cag
A, vac
A, ghiaccio
A e bab
A [2]. H. pylori
infezione è noto anche per indurre l'espressione di enzima pro-infiammatoria cicloossigenasi (COX-2), che mostra l'espressione upregulated nel cancro gastrico [3]. Precedenti studi hanno documentato l'importanza di alterazioni genetiche ed epigenetiche di oncogeni, geni oncosoppressori e geni mancata corrispondenza di riparazione nello sviluppo del cancro gastrico. Protocadherin 10 [4], la morte associata proteina chinasi [5], secreta proteina frizzled legati [6] e proliferazione dei perossisomi attivato recettore gamma [7] hanno dimostrato di avere una ridotta espressione e la funzione soppressore del tumore nella carcinogenesi gastrica. D'altra parte, proteina della matrice associata nucleare retinoico-regolato [8] e sì-proteina associata 1 [9] erano entrambi upregulated e di esercitare la funzione oncogenica nello sviluppo del tumore.

Stathmin1 (STMN1), noto anche come oncoprotein 18, è un importante citosolico proteina microtubuli destabilizzante, che gioca un ruolo fondamentale nel processo di mitosi attraverso la regolamentazione della dinamica dei microtubuli, e una varietà di altri processi biologici [10]. Alto livello di espressione STMN1 è associata a prognosi infausta in varie neoplasie tra cui il cancro al seno [11], [12], il cancro alla prostata [13], il mesotelioma maligno [14], il cancro del collo dell'utero [15], e il carcinoma a cellule squamose dell'esofago [16] . Nel 2010, Jeon et al. prima ha riferito che STMN1 sovra-espressione è stata positivamente correlata con metastasi linfonodali e messa in scena avanzata e l'invasione vascolare, e negativamente con la sopravvivenza libera da recidive nel tipo diffuso carcinoma gastrico [17]. Lo stesso gruppo ha dimostrato il ruolo oncogenico di STMN1 nel cancro gastrico da in vitro
inibizione della proliferazione, la migrazione e l'invasione in linee cellulari gastrici battendo STMN1 verso il basso con siRNA, e in vivo
inibizione xenotrapianto crescita tumorale in topi nudi con siRNA transfection.

Regolazione dell'espressione STMN1 da miR-223 è stata dimostrata in carcinoma epatocellulare dal nostro precedente studio [18]. Micro-RNA sono una classe di molecole di RNA a singolo filamento di 21-23 coppia di basi di lunghezza e regolano l'espressione di geni bersaglio attraverso specifiche interazioni base-abbinamento tra miRNA e le regioni non tradotte degli mRNA mirati [19]. MiRNA potrebbero funzionare come oncogeni o soppressori tumorali nei tumori umani e sono potenzialmente utilizzati come biomarker diagnostici e prognostici innovativi, e bersagli terapeutici. Nel cancro gastrico, diversi miRNA tra miR-143 e -145 [20], miR-141 [21], miR-31 [22] e miR-106a [23] sono inibiti, mentre alcuni miRNA oncogenetica, come miR-21 e miR-27a [24] sono upregulated.

Questo studio si propone di indagare il ruolo funzionale di STMN1 nello sviluppo del cancro gastrico e meccanismi di regolazione di STMN1 nel carcinoma gastrico.

Risultati

up-regolazione di STMN1 in linee cellulari di cancro gastrico e campioni di cancro gastrico elementari

l'espressione di mRNA STMN1 era maggiore nei 9 linee di cellule di cancro gastrico rispetto al tessuto gastrico normale, come mostrato in Fig. 1A. Analisi Western Blot ha confermato l'up-regolazione di proteine ​​STMN1 in 11 linee di cellule di cancro gastrico (Fig. 1B). Up-regolata l'espressione della proteina STMN1 è stata osservata in 4 su 5 adenocarcinomi gastrici primarie a confronto con il corrispondente mucosa gastrica non tumorale (Fig. 1C). QRT-PCR è stato condotto per indagare il livello di espressione di mRNA STMN1. In adenocarcinoma gastrico primaria, 28 di 50 casi (56%) hanno mostrato più di 1,5 volte up-regolazione dell'espressione STMN1 mRNA nel tessuto tumorale rispetto alla mucosa non-tumorale corrispondente. Il livello medio di espressione STMN1 mRNA era significativamente più alta nei campioni di tumore rispetto che nelle controparti non-cancerose ( p = 0,040
, Fig. 1D).

espressione STMN1 correla con prognosi infausta a tipo diffuso carcinoma gastrico

l'immunoistochimica è stata effettuata per valutare l'espressione della proteina STMN1 in 111 primari campioni con adenocarcinoma gastrico. L'espressione della proteina STMN1 era localizzata principalmente nel citoplasma delle cellule tumorali (Fig. 2A). immunoreattività positiva è stata osservata in 96 adenocarcinomi gastrici (86,5%). Tra quei tumori STMN1-positivi, 40 hanno mostrato forte (3+), 37 hanno mostrato intermedio (2+) e 19 hanno mostrato debole (1+) STMN1 colorazione. precedente studio ha dimostrato che l'espressione STMN1 era regolata negativamente dal gene oncosoppressore TP53 [25]. Abbiamo quindi valutato l'espressione della proteina p53 mediante immunoistochimica e esplorato la sua correlazione con il livello di espressione STMN1. espressione di p53 nucleare Aberrant è stato trovato in 51 (45,9%) degli adenocarcinomi gastrici e più frequentemente in STMN1-positivo del tumore (50,0%) rispetto a tumore STMN1-negativi (20,0%) ( p
= 0.03). Le caratteristiche clinico-patologiche di 111 pazienti con adenocarcinoma gastrico e l'associazione con l'espressione STMN1 sono stati mostrati in Tabella 1. tumori STMN1-positivi sono stati più probabilità di essere trovati nella fascia di età antica ( p
= 0,07) e associati a p53 espressione nucleare ( p
= 0,03), L'analisi univariata ha indicato che la vecchiaia ( p
< 0,036), l'istologia con componente diffusa ( p
= 0.012), fase ( p
< 0,0001), T fase ( p
= 0.012), stadio di N ( p
< 0,0001), M fase ( p
< 0,0001) e la presenza di metastasi linfonodali ( p
< 0,0001) correlata con scarsa sopravvivenza malattia-specifica. Con l'analisi di rischi proporzionali di Cox di regressione multivariata, solo l'età ( p
< 0,0001) e lo stadio ( p
< 0,0001) erano indipendentemente associati con la sopravvivenza malattia-specifica (Tabella 2). In tipo diffuso adenocarcinoma gastrico, espressione STMN1 è stata associata con la vecchiaia ( p
= 0.043), T fase ( p
= 0.004) e la presenza di metastasi linfonodali ( p
= 0,046). L'espressione di STMN1 nel tipo diffuso adenocarcinoma gastrico è risultato associato a più poveri la sopravvivenza malattia-specifica mediante analisi univariata ( p
= 0.01, Fig. 2B).

silenziamento del STMN1 inibisce il fenotipo aggressivo in vitro

upregulation frequente di STMN1 mRNA e di proteine ​​nei tumori gastrici hanno suggerito un potenziale ruolo oncogeno di questo gene. Knockdown di STMN1 da interferenze piccoli RNA (siRNA) marcatamente abbassata mRNA e livelli di proteina (Fig 3A.) E ha ridotto significativamente la proliferazione delle cellule in cellule AGS e MKN7 come dimostrato da test MTT ( p
< 0,001, fig. 3B). STMN1 siRNA-mediato effetto soppressivo crescita è stata ulteriormente confermata mediante test di formazione monostrato colonia di ancoraggio-dipendente. Una riduzione significativa del numero di colonie è stato osservato in cellule trasfettate con siRNA STMN1, rispetto ai controlli scramble nella cultura monostrato (ridotta al 49,2% e il 68,4% dei controlli strapazzate in AGS e MKN7 rispettivamente; p
< 0,001, Fig. 3C)

in saggi motilità cellulare, una significativa riduzione nel fenotipo invasivo attraverso la camera di Boyden Matrigel rivestite ( p
<.. 0.001, Fig 3D) è stata dimostrata in STMN1 cellule AGS e MKN7 siRNA-trasfettate (ridotto, rispettivamente, al 51,6% e il 46,8% dei controlli scramble in AGS e MKN7). Nei saggi di migrazione cellulare utilizzando Transwell sostiene permeabili, una significativa diminuzione del numero di cellule che migrano attraverso la membrana microporosa ( p
< 0,001, figura S1) è stato trovato in STMN1 siRNA transfettate cellule AGS e MKN7 (ridotto a 65,9% e il 42,7% dei controlli scramble, rispettivamente AGS e MKN7,), suggerendo siSTMN1 potrebbe inibire la capacità di migrazione delle cellule di cancro gastrico.

Dal momento che un effetto di crescita inibitorio è stato osservato in cellule trasfettate siSTMN1, abbiamo analizzato il transfettanti per i parametri del ciclo cellulare mediante citometria a flusso. Ventiquattro ore dopo la transfezione, accumulo di cellule G1 è stata osservata in trasfettanti siSTMN1 rispetto ai controlli scramble siRNA (Fig. 4A). Le cellule in fase G1 sono stati aumentati dal 47,5% al ​​53,7% in AGS, 38,0% al 43,4% in MKN7, e il 30,1% al 40,1% in SGC7901 cellule. E questo è stato accompagnato da una diminuzione di cellule in fase S. In linea con l'arresto del ciclo cellulare si trovano in citometria a flusso, abbiamo osservato una significativa riduzione di fosfo-Rb (S807 /811), in trasfettanti siSTMN1 (Fig. 4B). Inoltre, siSTMN1 potrebbe indurre apoptosi in ritardo in quattro linee di cellule di cancro gastrico testate, AGS, MKN1, BGC823 e SGC7901, che è stata rappresentata da un aumento di spaccati-PARP (Fig. 4B). Tuttavia, nessuna differenza significativa è stata trovata nel livello di p-AKT (S473) e p-Stat3 (T705) tra il siSTMN1 e il controllo negativo transfettate.

siSTMN1 inibisce la crescita del tumore gastrico in vivo

per indagare ulteriormente l'effetto di STMN1 su in vivo
crescita del tumore gastrico, siSTMN1 e cellule di cancro gastrico scramble transfettate sono stati iniettati per via sottocutanea a destra ea sinistra il fianco dorsale del topi nudi rispettivamente. Dato che le cellule AGS e MKN7 non formano xenotrapianti in topi nudi, abbiamo usato SGC7901 cellule per in vivo
studio. siSTMN1-transfectant formata tumori più piccoli sul fianco dorsale destra rispetto ai controlli scramble sul fianco dorsale sinistro 3 settimane dopo l'iniezione ( p
. < 0,01, figura 4C).

STMN1 è una valle bersaglio di miR-223 nel cancro gastrico

Come previsto dalla TargetScan, potenziale miR-223 sito di legame è stato trovato nel STMN1 3'UTR (posizione 12-18 di STMN1 3'UTR). L'espressione di miR-223 è stato downregulated in 9 linee di cellule di cancro gastrico rispetto al normale epitelio tessuto gastrico (Fig. 5A). L'espressione di miR-223 è stata negativamente correlata con l'espressione della proteina STMN1 ( p
= 0.05). Abbiamo valutato inoltre l'espressione della proteina STMN1 mediante immunoistochimica e il livello di miR-223 da qRT-PCR in 31 campioni di cancro gastrico primarie. I tumori con maggiore STMN1 immunoreattività (score 2+ e 3+) hanno mostrato una tendenza non significativa verso una più bassa miR-223 livelli di espressione ( p = 0,137
, Fig. 5B).

Per dimostrano il potenziale effetto soppressivo di miR-223 sull'espressione STMN1, abbiamo trasfettato miR-223 per gastrici linee AGS cellule tumorali e MKN7. Mir-223 soppressa STMN1 mRNA e l'espressione della proteina in entrambe le linee cellulari ( p
< 0,001, Fig 5C.). L'aggiunta di miR-223 bloccante salvato l'espressione della proteina STMN1 in MKN7 cellule, suggerendo l'effetto soppressivo è stato specificamente indotto da miR-223 (Fig. 5D). saggi di luciferasi doppi sono stati eseguiti per studiare l'interazione tra miR-223 e STMN1 3'UTR (Fig. 5E). I costrutti reporter contenenti previsti o siti di legame mutati sono stati co-trasfettate con miR-223 mimica a MKN28 cellule, una linea cellulare di cancro gastrico con relativamente bassa espressione STMN1 endogena. Mir-223 esercita forte effetto inibitorio sulla STMN1 3'UTR (49,7%, p
< 0,001). L'effetto inibitorio è stato eliminato quando la regione seme è stato cancellato (Mutant 1), o alleviati quando 4 nucleotidi sulla regione seme sono stati mutati. (67,6%, p
< 0,001, Mutant 2)

Discussione

in questo studio, abbiamo dimostrato la up-regolazione dell'espressione STMN1 sia mRNA e livelli di proteina in adenocarcinomi gastrici rispetto al normale epitelio gastrico. Il risultato ha suggerito che STMN1 potrebbe avere la funzione oncogenica nella tumorigenesi gastrica. STMN1 è stato segnalato per essere un marcatore prognostico in diversi tipi di cancro tra cui il cancro del colon-retto [26], il carcinoma a cellule squamose dell'esofago [16], il carcinoma epatocellulare [27], [28], [29], [30] e il carcinoma a cellule squamose orale [31]. Abbiamo dimostrato che l'espressione STMN1 associato con il gruppo vecchiaia, stadio T avanzata, la presenza di metastasi linfonodali, e un tempo di sopravvivenza malattia-specifica più breve nel tipo di diffuso adenocarcinoma gastrico. In linea con questo dato, Jeon et al. ha riferito che STMN1 poteva prevedere prognosi infausta nel tipo diffuso di cancro gastrico e correlare con invasione vascolare [17].

STMN1 regola dinamica dei microtubuli promuovendo depolimerizzazione dei microtubuli e prevenendo la polimerizzazione di eterodimeri di tubulina. L'inibizione dell'espressione STMN1 porta all'accumulo di cellule nei G2 /M fasi ed è associata con gravi anomalie mitotico mandrino e difficoltà di uscire dalla mitosi [10]. STMN1 media anche gli effetti di p27 (Kip1) sulla motilità cellulare [32]. In cellule di sarcoma [33] e il cancro del polmone non a piccole cellule [34], STMN1 stimolata motilità cellulare in e attraverso la matrice extracellulare in vitro
e ha aumentato il potenziale metastatico in vivo
. Nelle linee di cellule di cancro gastrico scarsamente differenziati SNU638 e SNU16, siRNA-indotta STMN1 repressione potrebbe sopprimere la proliferazione delle cellule in vitro
e in vivo
[17]. In questo studio, abbiamo dimostrato che siRNA atterramento di STMN1 inibito la proliferazione cellulare e la formazione di colonie di ancoraggio-dipendente, l'invasione compromessa e capacità di migrazione, l'arresto G1 indotta e in ritardo apoptosi nelle linee cellulari di cancro gastrico. Abbiamo inoltre dimostrato che siSTMN1 inibito in vivo
crescita del cancro gastrico linea cellulare SGC7901. l'inibizione funzionale di STMN1 prontamente diminuita proliferazione cellulare e fenotipo invasivo, suggerendo un ruolo protumorigenic di STMN1 nel carcinoma gastrico.

MIR-223 è un miRNA evolutivamente conservato che è stata inizialmente riportata in granulopoiesi e differenziazione mieloide [35]. L'espressione del miR-233 potrebbe essere guidato dai fattori di trascrizione mieloidi, PU.1 e C /EBP [36]. Si potrebbe regolare diversi geni bersaglio, come MEF2C [37], un fattore TRASCRITTIVO che promuove la proliferazione mieloide progenitore. Esso svolge anche un ruolo essenziale durante osteoclasti differenziazione [38], e potrebbe essere servita come un potenziale biomarker per il cancro ovarico recidivante [39] e la sepsi [40]. Abbiamo riportato in precedenza che STMN1 è un bersaglio a valle putativo di miR-223 nel carcinoma epatocellulare [18]. In questo studio, abbiamo osservato un livello di espressione di miR-223 a basso contenuto di linee di cellule di cancro gastrico e una relazione inversa tra miR-223 e l'espressione della proteina STMN1. Con saggi di luciferasi, abbiamo confermato l'interazione specifica tra miR-223 e STMN1 3'UTR in cellule di cancro gastrico. L'effetto di modulazione negativo per miR-223 è stata ulteriormente suffragata da un livello di proteina STMN1 significativamente ridotta nelle linee di cellule di cancro gastrico dopo miR-223 ri-espressione. I risultati sostenuto che STMN1 è un bersaglio putativo di miR-223 in cellule di cancro gastrico. Curiosamente, la sovraespressione di miR-223 non ha alterato la proliferazione cellulare e l'apoptosi (Figura S2A & 2B), ma la motilità cellulare in modo significativo indotto in cellule di cancro gastrico (Figura S2C). In linea con questo dato, un recente studio ha dimostrato che miR-223 promuove la motilità cellulare attraverso downregulation post-trascrizionale di soppressore del tumore EPB41L3 in cellule di cancro gastrico [41]. Mentre un singolo miRNA può avere come bersaglio più geni, più miRNA possono regolare un singolo gene. L'esatta individuazione meccanicistica molecolare di come un dato miRNA contribuisce ai cambiamenti fenotipici resta sfuggente.

L'inattivazione del gene soppressore tumorale TP53 sono gli eventi molecolari più comuni e più frequentemente studiato nel cancro umano. E 'stato riportato che p53 mediata repressione del promotore attività STMN1, con conseguente regolazione negativa dell'espressione STMN1 e G2 /M arresto del ciclo cellulare [25], [42]. Si è generalmente accettato che la proteina p53 di tipo selvatico non è rilevabile mediante immunoistochimica perché è instabile ed ha una emivita relativamente breve. Mutante proteina p53 accumulato nel nucleo è relativamente stabile e ha una più lunga emivita, che lo rende rilevabile mediante immunoistochimica. Pertanto, un immunoreattività forte e diffusa è generalmente indicativo di p53 mutante [43]. Abbiamo valutato lo stato di p53 in adenocarcinoma gastrico mediante immunoistochimica e abbiamo trovato che aberranti immunoreattività p53 associata con l'espressione STMN1 più alto. E 'quindi plausibile che la sovraespressione di STMN1 potrebbe in parte a causa di inattivazione del gene soppressore del tumore p53 nei tumori gastrici.

In conclusione, abbiamo dimostrato l'up-regolazione di STMN1 in adenocarcinoma gastrico e l'espressione è stata correlata con scarsa la sopravvivenza malattia-specifica nel tipo diffuso cancro gastrico. La proprietà oncogenica di STMN1 nella tumorigenesi gastrica è stata confermata da studi funzionali. Abbiamo inoltre dimostrato che l'espressione di STMN1 è stato negativamente regolata da miR-223 in cellule di cancro gastrico. La nostra scoperta suggerisce che STMN1 potrebbe servire come marcatore prognostico e un potenziale bersaglio terapeutico per tipo diffuso adenocarcinoma gastrico.

Materiali e Metodi

linea cellulare e di coltura cellulare
gastrico

Eleven linee di cellule tumorali, MKN28, KATO-III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, sono stati ottenuti sia dalla American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Giappone) o come regalo da Istituto Digestive Disease (IDD) del principe Wales Hospital. Queste linee cellulari sono coltivate in RPMI 1640 (GIBCO) supplementato con siero 10% bovino fetale (FBS, GIBCO UE), 100 U /ml di penicillina e streptomicina 10 mg /ml in atmosfera umidificata al 5% CO _{2 a 37 ° C.}

cliniche campioni di adenocarcinoma gastrico

Un totale di 111 campioni di adenocarcinoma gastrico sono stati recuperati dalla banca dei tessuti di Anatomia e Patologia cellulare, Prince of Wales Hospital, Shatin, Hong Kong. Un altro 5 paia di tumori primari e tessuti non tumorali adiacenti sono stati raccolti durante l'intervento chirurgico da pazienti senza alcuna terapia neoadiuvante. I campioni sono stati congelati immediatamente in -80 ° C per ulteriori analisi molecolari. campioni bioptici da 50 coppie di cancro gastrico ed il corrispondente mucosa non cancerose sono stati gentilmente forniti da IDD del principe Wales Hospital. Lo studio è stato approvato dal comune Università cinese di Hong Kong Nuovi Territori Est Cluster Clinical Research Comitato Etico, Hong Kong (CREC Ref. No. 2.009,521) e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato per la raccolta di campioni e successiva analisi.

estrazione di RNA, qRT-PCR e microRNA qRT-PCR

estrazione di RNA totale è stata effettuata utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. concentrazione di RNA è stata misurata mediante NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) sono stati utilizzati per la sintesi del DNA. Per RT-PCR quantitativa (qRT-PCR), Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) è stato richiesto STMN1 (Senso: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG; antisenso: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; Probe: Applied Biosystems, 185.528.556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). Il livello di espressione relativa è stata normalizzata con deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH) e calcolato con il metodo 2∧ (-Delta Delta Ct). saggi Taqman miRNA (Applied Biosystems) sono stati usati per quantificare i livelli di espressione di miR-223 maturo. L'RNA totale è stato invertito trascritto da MultiScribe (Applied Biosystems) in miscela di reazione contenente miR-specifici stem-loop invertire Primer TRASCRITTIVO. Tutte le reazioni sono state eseguite in triplicato ed i bianchi di acqua sono stati inclusi come controlli negativi.

Western Blot e immunoistochimica

La proteina è stato estratto da linee cellulari di cancro gastrico e tessuti primari appaiati utilizzando RIPA Lysis Buffer con proteinasi inibitore. La concentrazione proteica è stata misurata con il metodo di Bradford (Bod-Rad) e 20 ug di proteine ​​mescolato con 2 × SDS tampone di caricamento è stato caricato per corsia, separate da 12% elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide. proteine ​​STMN1 è stato rilevato con un anticorpo policlonale anti-STMN1 (Cell Signaling,ŏ2, 1:1000). Altri anticorpi sono da Cell Signaling in commercio, PARP spaccati (Asp214) (κ1, 1:1000), fosfo-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), fosfo-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) e fosfo-Stat3 (T705) (Β5, 1:2000).

L'immunoistochimica è stata eseguita in 4 sezioni micron di spessore da campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina. Dopo de-ceretta in xilene ed etanolo graduato, le sezioni sono state incubate a 3% H _{2O 2 soluzione per 25 minuti per bloccare le attività della perossidasi endogena e successivamente sottoposto a microonde in tampone citrato per il recupero antigene. Gli anticorpi primari (1:25 per STMN1 da Cell Signaling e 1:100 per p53 da DAKO) sono stati incubati a 4 ° C per una notte e sviluppo cromogeno è stata effettuata utilizzando il sistema EnVision (DAKO). L'espressione citoplasmatica di STMN1 è stata valutata mediante l'assegnazione di un punteggio percentuale e un punteggio di intensità. Il punteggio proporzione era in base alla percentuale di cellule tumorali con colorazione positiva citoplasmatica (0, none; 1, < = 10%; 2, 10 a < = 25%, 3, > 25 al 50%, 4, > 50%). Il punteggio di intensità è stato assegnato per l'intensità media di cellule positive tumorali (0, nessuno, 1, debole, 2, intermedio, 3, forte). Il punteggio citoplasmatica della STMN1 era il prodotto di proporzione e di intensità colonne sonore, che va da 0 a 12. L'espressione citoplasmatica è stata classificata in negativo (punteggio 0), 1+ (punteggio da 1 a 3), 2+ (punteggio 4-6), e 3+ (punteggio 7-12). espressione di p53 nucleare in > il 10% delle cellule tumorali è stato segnato come sovraespressione aberrante}

STMN1 test funzionali

La trasfezione di siRNA STMN1 e controllo scramble (QIAGEN) è stata eseguita utilizzando Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (. Invitrogen). La proliferazione cellulare è stata valutata utilizzando CellTiter 96 cellulare non radioattivo proliferazione Assay (Promega) secondo le istruzioni del produttore. Per i saggi formazione di colonie in colture monostrato, cellule trasfettate con STMN1 siRNA o il controllo scramble sono state coltivate per 10 giorni. Le cellule sono state fissate con etanolo al 70% per 15 minuti e colorate con cristalvioletto 2%. Le colonie con più di 50 cellule per colonia sono stati contati. Gli esperimenti sono stati ripetuti in triplicato.

La cella saggi di invasione sono stati eseguiti utilizzando BD Biocoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences). Le cellule trasfettate sono state seminate in camera superiore in terreno di coltura contenente 1% FBS, con terreno completo (contenente 10% FBS) aggiunto alla camera inferiore. Dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C, le cellule che hanno invaso attraverso la membrana matrigel state fissate con metanolo al 100% per 2 minuti e colorate con 1% blu di toluidina per altri 2 minuti. Per l'analisi statistica, le cellule sulla parte inferiore della membrana sono stati contati da 5 campi microscopici casuali (ingrandimento originale × 400). Ogni esperimento è stato condotto in triplicato, e il valore medio è stato espresso da 2 esperimenti indipendenti.

La cella saggi di migrazione sono state eseguite utilizzando Transwell supporti permeabili (Corning, NY). Le cellule sono state raccolte da piastre di coltura di 24 ore dopo la trasfezione, lavate tre volte con terreno di coltura e risospeso. Poi 300 ul di sospensione cellulare (5 × 10 ^{4 celle) è stato aggiunto nelle transwells, con 500 ul di terreno di coltura contenente 10% FBS nella camera inferiore. Dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C, le cellule che possono migrare attraverso la membrana microporosa sono state fissate con metanolo al 100% per 2 minuti e colorate con 1% blu di toluidina per altri 2 minuti. Per l'analisi statistica, abbiamo contato il numero di cellulare attaccato in 3 Guarda altre aree di ciascuna camera in modo casuale e ha preso il numero medio di cellule di ogni campo.}

citometria a flusso di analisi per arresto del ciclo cellulare

Per ciclo cellulare analisi, AGS, MKN7 e SGC7901 cellule sono state raccogliendo al tempo di 24 ore dopo la trasfezione in 6 piatti cm. Prima di trasfezione, le cellule sono stati sottoposti a fame per 12 ore per la sincronizzazione. Le cellule sono state raccolte con PBS freddo e fissate in 70% di etanolo freddo per una notte a 4 ° C e trattati con 1 ng /ml RNasi A per 10 minuti a 37 ° C. Il DNA cellulare è stata trattata con 15 ng /ml di ioduro di propidio (PI) per 30 minuti a 37 ° C al buio. Le cellule poi sono stati ordinati per FACS Calibur Citofluorimetro (Becton Dickinson, CA) e profili del ciclo cellulare sono stati determinati utilizzando il software ModFitLT (Becton Dickinson, San Diego, CA). Gli esperimenti sono stati ripetuti per due volte separate.

in vivo
tumorigenicità studio

SGC7901 cellule (2 × 10 ^{6cells sospesi in 0,1 ml di PBS) transitoriamente trasfettate con siScramble e siSTMN1 sono state iniettate per via sottocutanea nel fianco dorsali di nove 4 settimane di età maschio Balb /c topi nudi (siSTMN1 sul lato destro e cellule di controllo negativo a sinistra). Gli xenotrapianti sono stati contratti e diametro del tumore è stato misurato e documentato alla fine della settimana 3. volume tumorale (mm 3) è stata stimata misurando il diametro più lungo e più corto del tumore e calcolando come segue: volume = (diametro più corto ) 2 × (diametro più lungo) × 0.5. Il trattamento degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico degli animali della Università cinese di Hong Kong.}

saggi reporter luciferasi e miR-223 trasfezione

Il putativo miR-223 sito di legame a la regione non tradotta 3 '(3'UTR) di STMN1 è stato clonato in PMIR-REPORT vettore (Ambion Inc.). Due costrutti mutanti sono stati generati da una delezione o mutazioni della sequenza seme complementare alla regione di legame miR-223, come precedentemente descritto [18]. Il costrutto luciferasi di lucciola è stato co-trasfettate con Renilla controllo luciferasi vettore in MKN28 cellule in presenza di entrambi i sintetici miR-223 molecole o scramble controllo miRNA. Doppio saggi luciferasi (Promega) sono stati effettuati 36 ore dopo la trasfezione. Lipofectamine 2000 è stato utilizzato per la trasfezione di miR-223 in AGS e cellule MKN7.

L'analisi statistica

Il test t di Student è stato utilizzato per confrontare la differenza di comportamento biologico tra le cellule STMN1 atterramento e scramble cellule siRNA-trasfettate, e tra il miR-223-trasfettate e scramble miRNA cellule trasfettate. Correlazione tra espressione STMN1 e parametri clinico-patologici sono stati valutati da test di rho rango non parametrico di Spearman. Il metodo di Kaplan-Meier è stato utilizzato per stimare i tassi di sopravvivenza per ogni variabile. Le equivalenze delle curve di sopravvivenza sono stati testati dalle statistiche log-rank. Per quelle variabili statisticamente significativi trovato nell'analisi univariata della sopravvivenza ( p
< 0,05), il rischio proporzionale modello di Cox con la statistica rapporto di verosimiglianza è stato impiegato per loro valutare ulteriormente per l'analisi della sopravvivenza multivariata. Tutte le analisi statistica è stata effettuata da un software SPSS (versione 16.0; SPSS Inc). A due code p
-value inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo e la p
-value meno di 0.001 è stato considerato altamente significativo.

informazioni di supporto
Figura S1.
siSTMN1 inibisce la migrazione delle cellule nel cancro gastrico. immagini rappresentative di cellule AGS e MKN7, che sono state trasfettate con siSTMN1 e siScramble poi migrate attraverso una membrana microporosa (**, p
< 0,001)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033919. S001
(TIF)
Figura S2.
Lo studio funzionale del miR-223 in linee cellulari di cancro gastrico. (A) MTT saggi proliferative di AGS, MKN7 e SGC7901 dopo miR-223 trasfezione (4 giorni dopo la trasfezione). (B) Analisi Western Blot di spaccati-PARP in cellule AGS e MKN7 su 24 ore dopo miR-223 trasfezione. (C) Rappresentante Matrigel immagini di invasione di AGS, MKN7 e SGC7901 sono mostrati. miR-223 ha aumentato la capacità di invasione cellulare delle cellule di cancro gastrico (*, p
< 0,01; **, p
< 0,001). Il numero di cellulare è stato contato in 3 campi vista casuali e le barre di errore rappresentato deviazioni standard
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033919.s002
(TIF)

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