PLoS One: Stathmin1 Plays onkogén szerepe van és az a cél, mikro-RNS-223 Gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

Stathmin1 (STMN1) egy jelölt onkoproteint és a prognózis markere több fajta rákbetegségek. Ez a tanulmány célja az volt, hogy elemezze a kifejezés és biológiai funkcióit gyomorrákban. A kifejezés a STMN1 értékelték qRT-PCR, Western blot és immunhisztokémiai. A biológiai funkcióját STMN1 határoztuk meg MTT proliferációs vizsgálati eljárások, egyrétegű kolónia képződését és a sejtek inváziós vizsgálati eljárások segítségével kis interferáió RNS-technikával gyomor rákos sejtvonalak. Azt is vizsgálni a szabályozás STMN1 expresszió mikroRNS-223. STMN1 ben fokozódik gyomorrák sejtvonalak és primer gyomor adenocarcinoma. STMN1-pozitív daganatok nagyobb valószínűséggel találhatók éves korosztály és kapcsolódó p53 nukleáris kifejezést. Diffúz típusú gyomor adenocarcinoma, STMN1 expresszió korrelált az életkorral ( p katalógusa = 0,043), a T stádium ( p katalógusa = 0,004) és a nyirokcsomó-áttétek ( p = katalógusa 0,046). Kifejeződése STMN1 diffúz típusú gyomor adenokarcinóma járt szegény betegség specifikus túlélést egyváltozós analízis ( p katalógusa = 0,01). STMN1 knockdown AGS és MKN7 sejtvonalak elnyomott proliferációját ( p katalógusa < 0,001), csökkent egyrétegű telepek kialakulása ( p katalógusa < 0,001), gátolt sejtek invázióját és migrációs képessége ( p katalógusa < 0,001) és az indukált G1 fázis leállását. siSTMN1 is elnyomja a sejtnövekedést in vivo katalógusa ( p katalógusa < 0. 01). Mi végre megerősítette, hogy STMN1 egy feltételezett downstream célpontja miR-223 gyomorrákban. Eredményeink támogatják onkogén szerepét STMN1 gyomorrákban. STMN1 lehetne a prognosztikai marker, és potenciális terápiás célpont gyomorrák. Katalógusa

Citation: Kang W, Tong JHM, Chan AWH, Lung RWM, Chau SL, Wong QWL, et al. (2012) Stathmin1 Plays onkogén szerepe van és az a cél, mikro-RNS-223 gyomorrákban. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10,1371 /journal.pone.0033919 katalógusa

Szerkesztő: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: október 17, 2011; Elfogadva: február 19, 2012; Megjelent: március 28, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Kang és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány támogatja UGC együtt Research Fund (CUHK04 /CRF /08) és a támogató honlapja http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák egyik leggyakoribb rosszindulatú, és a második leggyakoribb oka a rák okozta halál világszerte. Ez a legmagasabb előfordulási Kínában, Japánban, Koreában és Kelet-Ázsiában. Az általános prognózis rossz, 5 éves túlélési arány 30% alatti a legtöbb országban [1]. Több lehetséges kockázati tényezők közé tartozik a magas sótartalmú diéta, dohányzás, keveset fogyasztanak gyümölcsöt és zöldséget, krónikus gyomorhurut glandularatrophy és intestinalis metaplasia, és Helicobacter pylori (H. pylori) hotelben fertőzés. A klinikai kimenetele H. pylori
fertőzés kimutatták, hogy befolyásolja a különböző genetikai tényezők, különösen a H. pylori katalógusa -virulence asszociált gének, mint a CAG katalógusa A, Vác katalógusa A, jég katalógusa A és bab katalógusa A [2]. H. pylori
fertőzés is ismert, hogy indukálja a expresszióját pro-gyulladásos ciklooxigenáz enzim (COX-2), amely azt mutatja, serkentett expresszióját gyomorrák [3]. Korábbi tanulmányok már dokumentálták, hogy fontos a genetikai és epigenetikai változások onkogének, tumor szuppresszor gének és mismatch repair gének a fejlesztés a gyomorrák. Protokadherin 10 [4], a halál-asszociált protein-kináz [5], szekretált frizzled kapcsolatos fehérje [6] és a peroxiszóma proliferátor aktivált receptor gamma [7] kimutatták, hogy csökkent expressziója és a tumor szuppresszor funkcióját a gyomor karcinogenezis. Másrészt, retinsav-szabályozott nukleáris mátrix-asszociált protein [8] és igen-asszociált protein 1 [9] egyaránt fokozódik és gyakoroljunk onkogén funkció tumor fejlődését.

Stathmin1 (STMN1), más néven mint onkoprotein 18, fontos citoszol mikrotubulus destabilizáló fehérje, amely játszik kritikus szerepet a folyamatban a mitózis szabályozáson keresztül mikrotubulus dinamikájának, és számos más biológiai folyamatok [10]. Magas szintű STMN1 expresszió rossz prognózissal társul a különböző rosszindulatú daganatok, például emlő-, [11] [12], prosztatarák [13], rosszindulatú mesothelioma [14], méhnyakrák [15], és a nyelőcső pikkelyes sejtes karcinóma [16] . 2010-ben, Jeon et al. először számolt be, hogy STMN1 túlzott kifejeződése pozitív korrelációt mutatott a nyirokcsomó-metasztázis és korszerű színpadtechnikai és vaszkuláris invázió, és negatívan kiújulás-mentes túlélés a diffúz típusú gyomorrák [17]. Ugyanez a csoport megmutatta az onkogén szerepét STMN1 gyomorrákban által in vitro katalógusa proliferáció gátlása, a migráció és az inváziót gyomor sejtvonalak kopogás STMN1 le a siRNS, és in vivo gátlása katalógusa xenograft tumor növekedését nude egerekben siRNS transzfekció. katalógusa

rendeletre STMN1 expresszió miR-223 igazolták hepatocelluláris karcinóma korábbi tanulmány [18]. Micro-RNS-ek olyan osztályt az egyszálú RNS-molekulák 21-23 bázispár hosszúságú, és szabályozzák a célgének expresszióját specifikus bázispárok közötti kölcsönhatások miRNS és nem transzlálódó régiók a célzott mRNS-ek [19]. MiRNS működne onkogének vagy tumor szupresszor humán rákos megbetegedések és a potenciálisan használható új diagnosztikus és prognosztikus biomarkerek és terápiás célpontok. A gyomorrák, több miRNS beleértve a miR-143 és -145 [20], a miR-141 [21], a miR-31 [22] és a miR-106a [23] a downregulált, mivel néhány oncogenetic miRNS mint a miR-21 és miR-27a [24] felszaporodnak. katalógusa

a tanulmány célja, hogy vizsgálja meg a funkcionális szerepe a STMN1 gyomorrákban fejlesztése és mechanizmusok szabályozása STMN1 gyomorrákban. katalógusa

Eredmények katalógusa

up-regulációját STMN1 gyomorkarcinómában sejtvonalakban és primer gyomorrák minták

a kifejezés a STMN1 mRNS magasabb volt mind a 9 gyomor rákos sejtvonalak, mint a normál gyomor szöveti ábrán látható. 1A. Western-blot analízis megerősítette a up-regulációját STMN1 fehérje 11 gyomor rákos sejtvonalak (ábra. 1B). Up-regulációját STMN1 fehérje expresszióját figyeltük meg 5-ből 4 primer gyomor adenokarcinómája összehasonlítva a megfelelő nem-daganatos gyomornyálkahártya (ábra. 1C). QRT-PCR végeztek, hogy vizsgálja meg a STMN1 mRNS expressziós szint. A primer gyomor adenokarcinóma, 28, 50 esetben (56%) mutatott több mint 1,5-szeres up-regulációja STMN1 mRNS expressziójának tumorszövetben összehasonlítva a megfelelő nem-tumoros nyálkahártyáját. Az átlagos szintje STMN1 mRNS expressziója szignifikánsan magasabb volt tumorminták, mint a nem-rákos megfelelőik ( p
= 0.040, Fig. 1D).

STMN1 expressziója korrelál a gyenge prognózissal diffúz típusú gyomorrák katalógusa

immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk, hogy értékelje a STMN1 fehérje expresszió 111 primer gyomor adenokarcinóma minta. A STMN1 fehérje expresszióját elsősorban lokalizált a citoplazmában a tumorsejtek (2A.). Pozitív immunreaktivitást figyeltünk meg a 96 gyomor adenocarcinoma (86,5%). Azok között STMN1-pozitív daganatok, 40 mutatott erős (3+), 37 kimutatta köztes (2+) és 19 mutatott gyenge (1+) STMN1 festéssel. Korábbi tanulmány kimutatta, hogy a STMN1 expresszió által negatívan szabályozott tumorszuppresszor gén TP53 [25]. Ezért értékelik a kifejezés a p53 fehérje immunhisztokémiai módszerrel, és feltárni annak kapcsolatát a STMN1 expressziós szintet. Aberrált nukleáris p53 expressziót találtunk 51 (45,9%) a gyomor adenocarcinoma és gyakrabban STMN1-pozitív tumor (50,0%), mint STMN1-negatív tumor (20,0%) ( p katalógusa = 0,03). A klinikai és patológiai jellemzői 111 beteg gyomor adenokarcinóma és az egyesület STMN1 kifejezés arra az 1. táblázat mutatja STMN1-pozitív daganatok nagyobb valószínűséggel találhatók éves korosztály ( p katalógusa = 0,07), valamint kapcsolódó p53 nukleáris kifejezés ( p katalógusa = 0,03), egyváltozós elemzés azt mutatta, hogy idősebb korban ( p katalógusa < 0,036), szövettan diffúz komponens ( p katalógusa = 0,012), színpad ( p katalógusa < 0,0001), a T stádium ( p katalógusa = 0,012), N stádium ( p katalógusa < 0,0001), M fázisban ( p
< 0,0001), és a jelenléte nyirokcsomó áttét ( p katalógusa < 0,0001) korrelált a rossz betegség-specifikus túlélést. Többváltozós Cox-féle regressziós analízis, csak a kor ( p katalógusa < 0,0001) és színpadi ( p katalógusa < 0,0001) is független összefüggést mutat a betegség-specifikus túlélés (2. táblázat). Diffúz típusú gyomor adenokarcinóma, STMN1 kifejezés járt öregségi ( p katalógusa = 0,043), a T stádium ( p katalógusa = 0,004), és a jelenléte nyirokcsomó áttét ( p katalógusa = 0,046). Kifejeződése STMN1 diffúz típusú gyomor adenokarcinóma társult szegényebb betegségmentes túlélés egyváltozós analízis ( p katalógusa = 0.01 ábra. 2B). Katalógusa

elhallgattatása STMN1 gátolja az agresszív fenotípus in vitro Matton

gyakori túlszabályzását STMN1 mRNS és fehérje a gyomor tumorok javasolt potenciális onkogén szerepe ennek a génnek. Kiütése STMN1 kis RNS-interferencia (siRNS-t) lényegesen csökkentette mRNS és fehérje szinten (ábra. 3A) és jelentős mértékben csökken a sejtek burjánzását AGS és MKN7 sejtek által bizonyított MTT assay ( p
< 0,001, Fig. 3B). STMN1 siRNS-közvetített növekedés szuppresszív hatást tovább igazoltuk lehorgonyzástól függő egyrétegű telepképző assay. Egy jelentős csökkenését kolónia számok volt megfigyelhető transzfektált sejtekben STMN1 siRNS, míg scramble kontroll egyrétegű tenyészetben (csökkent 49,2% és 68,4% -a Scramble ellenőrzések AGS és MKN7 volt; p
< 0,001, 3C.).

sejtmozgás vizsgálatokban jelentős csökkenését az invazív fenotípus keresztül a Matrigel bevont Boyden-kamra ( p
< 0,001, Fig. 3D) kimutatható volt STMN1 siRNS-transzfektált AGS és MKN7 sejtek (csökkent 51,6%, illetve 46,8% -a tülekedés ellenőrzések AGS és MKN7 -kal). A sejtmigrációt assay Transwell Áteresztő támogatja egy jelentős számának csökkenése a migráló sejtek keresztül mikroporózus membrán ( p
< 0,001, ábra S1) találtak STMN1 siRNS transzfektált AGS és MKN7 sejtek (csökkent 65,9% és 42,7% a Scramble ellenőrzések AGS és MKN7-kal), ami arra utal, siSTMN1 gátolhatják a migrációs képességét, gyomor rákos sejteket.

Mivel a növekedést gátló hatás volt megfigyelhető siSTMN1 transzfektált sejtekben, elemeztük a transzfektáns sejtciklus paramétereket áramlási citometriával. Huszonnégy órával a transzfektálás után felhalmozódása G1 sejtek volt megfigyelhető siSTMN1 transzfektánsok összehasonlítva a Scramble siRNS kontrollok (ábra. 4A). A sejteket a G1 fázisban emelkedett 47,5% -ról 53,7% -ra AGS 38,0% -ról 43,4% -ra MKN7, és 30,1% 40,1% SGC7901 sejtekben. És ez kísérte csökkenés az S fázisú sejtek. Összhangban a sejtciklus található áramlási citometriás elemzés azt tapasztaltuk, jelentősen csökken a foszfo-Rb (S807 /811) A siSTMN1 transzfektánsok (ábra. 4B). Továbbá siSTMN1 idézhet késői apoptózist négy gyomor vizsgált rákos sejtvonalak, AGS, MKN1, BGC823 és SGC7901, amely képviselte növekedést hasított PARP (ábra. 4B). Azonban nem volt szignifikáns különbség a szint p-AKT (S473) és p-Stat3 (T705) között siSTMN1 és negatív kontroll transzfektált. Katalógusa

siSTMN1 gátolja a gyomor tumor in vivo

Ahhoz, hogy tovább vizsgálják a hatását STMN1 a in vivo katalógusa növekedés gyomor tumor, siSTMN1 kódoltakat transzfektált gyomorrák sejtek szubkután injekció formájában a jobb és bal hátsó szárnyát csupasz egerek , ill. Mivel AGS és MKN7 sejtek nem alkotnak xenograftok csupasz egerekben, használtuk SGC7901 sejtek in vivo
tanulmány. siSTMN1 transzfektáns kialakított kisebb daganatok jobb hátsó szárnyon, mint tülekedés ellenőrzések bal hátsó szárnyon 3 héttel az injekció beadása után ( p katalógusa < 0,01, Fig. 4C). katalógusa

STMN1 downstream cél a miR-223 gyomorrákban katalógusa

Ahogy várható Targetscan potenciális miR-223 kötőhely található a STMN1 3'UTR (pozíció 12-18 a STMN1 3'UTR). Expression miR-223-ben downregulált 9 gyomorrák-sejtvonalak, összehasonlítva a hagyományos gyomor hámszövetből (ábra. 5A). Expression miR-223 negatívan korrelált STMN1 fehérje expresszió ( p katalógusa = 0,05). Mi értékelte továbbá STMN1 fehérje expresszióját immunhisztokémiai és a szint a miR-223 qRT-PCR 31 primer gyomorrák mintákat. Daganatok magasabb STMN1 immunreakció (pontszám 2+ és 3+) mutatott nem szignifikáns tendencia alacsonyabb miR-223 expressziós szint ( p katalógusa = 0,137, Fig. 5B). Katalógusa

bizonyítják a potenciális gátló hatását miR-223 a STMN1 kifejezés, mi transzfektált miR-223 gyomorrák sejtvonalak AGS és MKN7. MiR-223 elnyomott STMN1 mRNS és fehérje expressziós mindkét sejtvonalban ( p
< 0,001, Fig. 5C). Hozzáadása miR-223 blokkoló megmentette a STMN1 fehérje expresszióját MKN7 sejtekben, ami arra utal, a gátló hatása specifikusan indukált miR-223 (ábra. 5D). Kettős luciferáz riporter vizsgálatot végeztünk, hogy tanulmányozza az közötti kölcsönhatás miR-223 és STMN1 3'UTR (ábra. 5E). A riporter tartalmazó konstrukciót előre jelzett vagy mutált kötőhelyeket együtt transzfektáltunk miR-223 utánzó hogy MKN28 sejtek egy gyomorrák sejtvonal viszonylag alacsony endogén STMN1 kifejezést. MiR-223 gyakorolt ​​erős gátló hatást STMN1 3'UTR (49,7%, p katalógusa < 0,001). A gátló hatás megszűnt, amikor a mag régiót törölték (Mutáns 1), vagy enyhíthető, ha a 4 nukleotid a mag térségbeli mutált (67,6%, p katalógusa < 0,001, Mutant 2). Katalógusa

Vita katalógusa

Ebben a tanulmányban bemutattuk a fel-szabályozása STMN1 kifejezés mind mRNS, mind fehérje szinten a gyomor adenocarcinoma, összehasonlítva a hagyományos gyomornyálkahártya. Az eredmény azt javasolta, hogy STMN1 lehet onkogén funkció gyomor tumorogenezisben. STMN1 leírták, hogy egy prognosztikai biomarkerként számos rákos megbetegedések, beleértve a colorectalis rák [26], a nyelőcső pikkelyes sejtes karcinóma [16], hepatocelluláris karcinóma [27], [28], [29], [30] és az orális pikkelysejtes karcinóma [31]. Kimutattuk, hogy STMN1 kifejezés kapcsolódó éves korosztály, a fejlett T színpadi jelenléte nyirokcsomó áttét, és egy rövidebb betegségmentes túlélés idejét a diffúz típusú gyomor adenokarcinóma. Összhangban ezzel a megállapítással, Jeon et al. számolt be, hogy STMN1 tudta megjósolni rossz prognózissal a diffúz típusú gyomorrák korrelál a vaszkuláris invázió [17]. katalógusa

STMN1 szabályozza mikrotubulus dinamika előmozdításával depolimerizáció mikrotubulusok és megakadályozza polimerizációs tubulin heterodimereket. Gátlása STMN1 kifejezés felhalmozódásához vezet a sejtek a G2 /M fázisban, és a kapcsolódó súlyos mitotikus orsó rendellenességek és nehézség a kilépés mitózis [10]. STMN1 is közvetíti hatásait p27 (Kip1) sejt mozgékonyságra [32]. A szarkóma sejtek [33] és a nem kissejtes tüdőrák [34], STMN1 stimulált sejtmozgás és ezen keresztül az extracelluláris mátrix in vitro
és növelte a metasztatikus potenciálját in vivo katalógusa. Gyengén differenciált gyomor rákos sejtvonalak SNU638 és SNU16, siRNS által kiváltott STMN1 elnyomás tudott elnyomni sejtburjánzást in vitro katalógusa és in vivo katalógusa [17]. Ebben a vizsgálatban kimutattuk, hogy az siRNS kiütése STMN1 gátolta a sejtproliferációt és lehorgonyzástól függő kolónia képződését, csökkent invázió és migrációs képessége, indukált a G1 leállást és késői apoptózist gyomor rákos sejtvonalak. Azt is kimutatták, hogy gátolja siSTMN1 in vivo katalógusa növekedés gyomorrák sejtvonal SGC7901. Funkcionális gátlása STMN1 könnyen csökkent a sejtek szaporodását és invazív fenotípus, ami arra utal, protumorigenic szerepe STMN1 gyomorrákban. Katalógusa

A miR-223 egy evolúciósan konzervált miRNS amelyet kezdetben jelentettek fehérvérsejtképzés és myeloid differenciálódás [35]. A kifejezés a miR-233 lehet hajtja a myeloid transzkripciós faktorok, PU.1 és C /EBPS [36]. Ez lehet szabályozni számos target gének, mint Mef2c [37], a transcriptive tényező, amely elősegíti a myeloid progenitor proliferációt. Azt is fontos szerepet játszik során az osteoclastok differenciálódását [38], és ez szolgált a potenciális biomarker visszatérő petefészekrák [39] és a szepszis [40]. Azt jelentették korábban, hogy STMN1 egy feltételezett downstream célpontja miR-223 a hepatocellularis carcinoma [18]. Ebben a tanulmányban megfigyelt alacsony miR-223 expressziós szintje a gyomorrák sejtvonalakon és inverz kapcsolata miR-223 és STMN1 fehérje expresszióját. Luciferáz riporter assay, azt megerősítette az közötti specifikus kölcsönhatás miR-223 és STMN1 3'UTR a gyomor rákos sejtekben. A negatív modulációs hatás miR-223-ben támasztották szignifikánsan kevesebb STMN1 fehérje szintje a gyomorrák sejtvonalakon után miR-223-re kifejezést. Az eredmények alátámasztották, hogy STMN1 egy feltételezett cél a miR-223 a gyomor rákos sejteket. Meglepő túltermelése miR-223 nem változtatta meg a sejtek szaporodását és az apoptózis (ábra S2A & 2B), de jelentősen indukált sejtmozgás gyomorrák sejtek (ábra S2C). Összhangban ezzel a megállapítással, egy friss tanulmány kimutatta, hogy a miR-223 támogatott sejtmotilitással keresztül poszt-transzkripciós downregulációját tumor szupresszor EPB41L3 gyomorrákban sejtekben [41]. Míg egy miRNS célozhat több gén több miRNS képes szabályozni egy gén. A pontos molekuláris mechanisztikus azonosítása, hogy egy adott miRNS hozzájárul az fenotípusos változásokat megfoghatatlan marad.

inaktiválása a tumorszuppresszor gén TP53 a leggyakoribb és legtöbbet tanulmányozott molekuláris események a humán rák. Leírták, hogy a p53 által közvetített elnyomása STMN1 promoter aktivitását, ami negatív szabályozásában STMN1 expresszió és a G2 /M letartóztatás a sejtciklus [25], [42]. Általánosan elfogadott, hogy a vad típusú p53-protein nem mutatható ki immunhisztokémiai mert instabil, és van egy viszonylag rövidebb felezési időt. A mutáns p53 fehérje felhalmozódik a sejtmagban viszonylag stabil, és hosszabb a felezési ideje, ami miatt kimutatható immunhisztokémiai. Ezért egy erős és diffúz immunreaktivitást általában jelzi a mutáns p53 [43]. Megvizsgáltuk a p53 állapotát gyomor adenokarcinóma immunhisztokémiai módszerrel, és megállapította, hogy a kóros p53 immunreaktivitás járó magasabb STMN1 kifejezést. Ezért valószínű, hogy a túlzott mértékű expressziója STMN1 esetleg részben inaktiválása miatt tumorszuppresszor gén p53 gyomor rák.

Összefoglalva, kimutattuk az up-regulációját STMN1 gyomor adenokarcinóma és az expressziója korrelál a gyenge betegségmentes túlélés diffúz típusú gyomorrák. Az onkogén tulajdonsága STMN1 a gyomor tumorogenezisben igazoltuk funkcionális vizsgálatok. Azt is kimutatták, hogy ez a kifejezés STMN1 negatívan szabályozza a miR-223 a gyomor rákos sejteket. A megállapítás azt javasolta, hogy STMN1 lehetne a prognosztikai marker, és potenciális terápiás célpont a diffúz típusú gyomor adenokarcinóma. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

sejtvonal és sejttenyészet katalógusa

Eleven gyomor- rákos sejtvonalak, MKN28, KATO-III MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, kaptuk akár az American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japán), vagy mint egy ajándék Institute Emésztési betegség (IDD) Prince Wales Kórház. Ezek a sejtvonalak tenyésztünk RPMI 1640 (Gibco), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS, EU GIBCO), 100 U /ml penicillinnel és 10 ng /ml sztreptomicinnel párásított atmoszférában, 5% CO _{2 37 ° C. katalógusa}

Klinikai gyomor adenokarcinóma minta

az összesen 111 gyomor adenokarcinóma mintákat lekért szöveti partján anatómiai és celluláris patológia, Prince of Wales Kórház, Shatin, Hong Kong. Egy másik 5 pár primer tumorok és a szomszédos nem-daganatos szövetek gyűjtöttünk a műtét során a betegektől nélkül neoadjuváns terápia. A mintákat azonnal lefagyasztottuk -80 ° C-on további molekuláris elemzésre. Biopsziás mintákat 50 pár gyomorrák és a megfelelő nem rákos nyálkahártyát szívességéből IDD herceg Wales Kórház. A tanulmány által jóváhagyott közös kínai University of Hong Kong-New Territories Kelet Cluster Clinical Research etikai bizottság, Hong Kong (CREC Ref. No. 2009,521), és minden résztvevő írásos beleegyezését adta a minták gyűjtését és további elemzés. Katalógusa

RNS extrakció, qRT-PCR és mikro-RNS qRT-PCR

a teljes RNS-extrakciót végeztünk Trizol reagens (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai. RNS koncentrációját mértük NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós Kits (Applied Biosystems) alkalmaztunk a cDNS-szintézis. A kvantitatív RT-PCR (QRT-PCR), TaqMan univerzális PCR Master Mix (Applied Biosystems) alkalmaztunk STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG; Antiszensz: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; Szonda: Applied Biosystems, 185.528.556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). A relatív expressziós szintet normalizáltuk gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) és kiszámított 2∧ (-Delta Delta Ct) módszerrel. Taqman miRNS assay (Applied Biosystems) alkalmaztunk számszerűsítésére expressziós szintjét érett miR-223. Teljes RNS-t visszaforgattunk átírt által MultiScribe (Applied Biosystems) A reakcióelegyet tartalmazó miR-specifikus szár-hurok fordított transcriptive primer. Minden reakciókat hajtottunk végre háromszoros ismétlésben és a víz üres vontunk negatív kontrollként.

Western blot és immunhisztokémiai

Protein-t extraháltunk a gyomor rákos sejtvonal és párosított elsődleges szövetek használatával RIPA lízispufferben proteináz inhibitor. A protein koncentrációt mértük a Bradford módszerével (BOD-Rad) és 20 ng fehérje összekeverünk 2 × SDS loading pufferben volt töltve sávonként elválasztott 12% -os SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel. STMN1 detektáltunk fehérjét egy poliklonális anti-STMN1 antitestet (Cell Signaling,ŏ2, 1:1000). Más antitestek Cell Signaling kereskedelemben, hasított PARP (Asp214) (κ1, 1:1000), foszfor-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), foszfor-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) és foszfo-Stat3 (T705) (Β5, 1:2000).

immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk, a 4 um vastag metszeteket formalinnal fixált és paraffinba ágyazott mintákat. Miután de-kenő-xilolban és osztályozni etanol, metszeteket 3% H _{2 O 2 oldat 25 percig, hogy blokkolja az endogén peroxidáz tevékenységek és ezt követően ment a mikrohullámú sütőben citrát pufferben antigén visszakeresés. A primer antitesteket (01:25 számára STMN1 a Cell Signaling és 1:100 p53 a Dako) inkubáltunk 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán és kromogént fejlesztés segítségével végeztük EnVision rendszer (DAKO). A citoplazmatikus expresszióját STMN1 értékelték hozzárendelésével arányban pontszámot, és olyan intenzitással pontszámot. Az arány pontszám volt szerinti aránya tumorsejtek pozitív citoplazmatikus festődés (0, egyik sem; 1, < = 10%; 2, 10 < = 25%, 3, > 25-50%, 4, > 50%). Az intenzitás pontszám jelöltek átlagos intenzitása pozitív tumorsejtek (0, sem az 1., a gyenge, 2, köztes, 3, erős). A citoplazma pontszám STMN1 terméke volt arányban és intenzitását pontszámok, 0-tól 12 citoplazmatikus expresszió sorolható negatív (0 pont), 1+ (pontszám 1-3), 2+ (pontszám 4-6), és 3+ (pontszám 7-12). Nukleáris p53-expresszió > 10% a tumorsejtek pontoztuk az aberráns overexpressziója.}

STMN1 funkcionális vizsgálatok

transzfektálása STMN1 siRNS kódoltakat kontroll (QIAGEN) alkalmazásával hajtottuk végre Lipofectamine 2000 transzfekciós reagens ( Invitrogen). A sejtproliferációt alkalmazásával értékeltük CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) a gyártó előírásainak megfelelően. A kolónia képződését vizsgálatokban egyrétegű tenyészeteket, transzfektált sejtek STMN1 siRNS vagy tülekedés kontroll tenyésztettünk 10 napig. A sejteket rögzítettük 70% -os etanollal, 15 percig, és megfestettük 2% kristályibolya. Telepek több mint 50 sejt per kolónia megszámoltuk. A kísérleteket megismételtük három példányban.

A sejtek invázióját vizsgálatokat végeztünk a BD Biocoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences). A transzfektált sejteket oltottunk a felső kamrában tápközegben, amely 1% FBS-t, teljes táptalajban (10% FBS tartalmú) adagolunk az alsó kamrába. 24 órás inkubálás után 37 ° C hőmérsékleten a sejteket, hogy betört a Matrigel membránon fixáltuk 100% -os metanollal 2 percig, és megfestettük 1% toluidinkékkel további 2 percig. A statisztikák analízishez a sejteket az alsó membrán megszámoltuk a 5 véletlen mikroszkópos mezők (eredeti nagyítás × 400). Mindegyik kísérletet három párhuzamosban hajtjuk végre, és az átlagos értéket fejeztük 2 független kísérlet során.

A sejt migrációs vizsgálatokat végeztünk Transwell Permeable Supports (Corning, NY),. A sejteket összegyűjtöttük a tenyészet csészékbe 24 órával a transzfekció után, háromszor mostuk táptalajt, és reszuszpendáljuk. Ezután 300 ul sejt-szuszpenziót (5 × 10 ^{4 sejt) adtunk a transwell, 500 ul táptalajt, amely 10% FBS-t az alsó kamrában. 24 órás inkubálás után 37 ° C hőmérsékleten, a sejtek, amelyek vándorolnak át a mikropórusos membránon fixáltuk 100% -os metanollal 2 percig, és megfestettük 1% toluidinkékkel további 2 percig. A statisztikák elemzése, mi számít a mellékelt sejtek számát 3 kilátás területein minden kamrában véletlenszerűen vett átlagos sejtszám minden területen. Katalógusa}

Áramlási citometria elemzést sejtciklusmegállás katalógusa

A sejtciklus analízis, AGS, MKN7 és SGC7901 sejteket gyűjtő idején 24 órával a transzfekció után a 6 cm-es lemezeken. A transzfekció előtt a sejteket ment éhezés 12 órán szinkronizálásra. A sejteket hideg PBS-sel és a rögzített 70% -os hideg etanollal éjszakán át 4 ° C-ra és 1 ng /ml RNáz A 10 percen át 37 ° C-on. Celluláris DNS-oldattal megfestettük, 15 ng /ml propidium-jodid (Pl) 30 percig 37 ° C-on sötétben. A sejteket ezután arra sorolva FACS Calibur áramlási citométerrel (Becton Dickinson, CA) és a sejtciklus-profilok alkalmazásával határoztuk meg ModFitLT szoftvert (Becton Dickinson, San Diego, CA). A kísérleteket két különböző alkalommal. Katalógusa

In vivo katalógusa tumorgenézisre tanulmány katalógusa

SGC7901 sejtek (2 × 10 ^{6cells felfüggesztett 0,1 ml PBS-ben) átmenetileg transzfektált siScramble és siSTMN1 szubkután fecskendeztünk a dorzális horpasz kilenc 4-hetes hím Balb /c meztelen egereket (siSTMN1 a jobb oldalon, és a negatív kontroll sejtek a bal oldalon). A xenograftok vettünk ki, és a tumor átmérőjét mértük, és dokumentálták a végén hét 3. A tumor térfogatát (mm 3) becsültük mérésével a leghosszabb és legrövidebb átmérőjét a tumor és kiszámítása a következő: térfogat = (legrövidebb átmérő ) 2 × (legnagyobb átmérő) × 0.5. Az állat kezelését és az összes kísérleti eljárásokat jóváhagyta az Animal Etikai Bizottsága a kínai University of Hong Kong. Katalógusa}

luciferáz riporter vizsgálatok és miR-223 transzfekciója katalógusa

A feltételezett miR-223 kötőhely a a 3 'nem transzlálódó régiót (3'UTR) az STMN1 kiónoztuk pMIR-Report vektorba (Ambion Inc.). Két mutáns konstrukciókat, amelyeket vagy deléciós vagy mutációk a komplementer mag szekvencia a miR-223 kötő régió, a korábban leírtak szerint [18]. A szentjánosbogár luciferáz konstrukciót együtt transzfektáltunk Renilla luciferáz vektor vezérlés MKN28 sejtek jelenlétében akár szintetikus miR-223-molekulák vagy scramble miRNS ellenőrzés. Kettős luciferáz riporter assay (Promega) végeztük 36 órával a transzfekció után. Lipofectamine 2000-ben használt transzfektálására miR-223 a AGS és MKN7 sejteket. Katalógusa

A statisztikai elemzés katalógusa

A Student t-próbát használtunk, hogy összehasonlítsuk a különbség biológiai viselkedése között STMN1 knockdown sejtek és tülekedés siRNS-transzfektált sejtek között, valamint a miR-223-transzfektált és tülekedés miRNS transzfektált sejtekben. Összefüggés a STMN1 a klinikopatológiai paraméterek értékelték parametrikus Spearman rho rank teszt. A Kaplan-Meier-módszerrel becslésére túlélési arányok az egyes változókra. Az ekvivalencia a túlélési görbék teszteltük log-rank. Azok a változók statisztikailag szignifikánsnak talált egyváltozós túlélési analízis ( p katalógusa < 0,05), a Cox-féle modell a valószínűsége arány statisztikát alkalmaztunk, hogy tovább értékeljük őket többváltozós túlélési analízis. Minden statisztikai analízist SPSS (version 16.0; SPSS Inc.). A kétfarkú p katalógusa -érték kisebb, mint 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, és a p katalógusa -érték kisebb, mint 0,001 tartották rendkívül jelentős. Katalógusa

alátámasztó információk
ábra S1.
siSTMN1 gátolja a sejtek migrációját a gyomorrák. Reprezentatív képek a AGS és MKN7 sejteket, melyeket transzfektált siSTMN1 és siScramble majd vándoroltak keresztül mikroporózus membránt (**, p
< 0,001).
Doi: 10,1371 /journal.pone.0033919. S001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
funkcionális vizsgálata a miR-223 gyomorrákban sejtvonalak. (A) Az MTT proliferációs vizsgálati AGS, MKN7 és SGC7901 után miR-223 transzfekciója (4 nappal a transzfekció után). (B) Western-blot analízis a hasított PARP AGS és MKN7 sejtek után 24 órával a miR-223 transzfekciós. (C) Reprezentatív Matrigel invázió képei AGS, MKN7 és SGC7901 jelennek meg. miR-223 fokozott a sejtek invázióját képességét gyomorrák-sejtek (*, p
&0,01; **, p
< 0,001). A sejtek száma megszámoltuk 3 véletlenszerű nézet mezőt, és a hiba sávok képviselik szórások. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0033919.s002 katalógusa (TIF) hotelben

• PLoS One: Glyoxalase-én egy új prognózisa tényező kapcsolódó gyomorkarcinóma Progression
• PLoS One: prognosztikai apoptózis kapcsolatos biológiai markerek kínai gyomorrákos betegek