PLoS ONE: Stathmin1 Groja onkogeniniam vaidmuo ir yra MicroRNA-223 Tikslinė skrandžio vėžio

Abstract

Stathmin1 (STMN1) yra kandidatas oncoprotein ir prognozė žymeklį kelių rūšių vėžio. Šis tyrimas buvo skirtas analizuoti savo išraiška ir biologines funkcijas skrandžio vėžio. Iš STMN1 išraiška buvo įvertintas KRL-PGR, Vakarų dėmė ir imunohistocheminiu. Biologinis funkcija STMN1 nulėmė MTT platinimo tyrimus, vienasluoksnę kolonijos formavimo ir ląstelių invazija tyrimai naudojant mažą trukdžių RNR technika skrandžio vėžio ląstelių linijas. Mes taip pat tyrinėjo STMN1 išraiškos reglamentavimą MicroRNA-223. STMN1 buvo aktyvinama skrandžio vėžio ląstelių linijų ir pirminių skrandžio adenokarcinomos. STMN1 teigiami navikai dažniau galima rasti amžiaus grupėje ir susijęs su p53 branduolinės išraiška. Be difuzinio tipo skrandžio adenokarcinomos, STMN1 išraiška koreliavo su amžiumi ( P
= 0,043), "T" etapas ( P
= 0,004) ir limfmazgių metastazės ( P
= 0,046). Išraiška STMN1 į difuzinis tipo skrandžio adenokarcinoma buvo susijęs su prasta specifinių ligos išlikimo pagal vieną požymį analizė ( P
= 0,01). STMN1 nokdaunas į AGS ir MKN7 ląstelių linijų slopino proliferacija ( P
< 0,001), sumažėjo monosluoksniui kolonija formavimas ( P
< 0,001), slopinamas ląstelių invazija ir migracijos galimybė ( p
< 0,001) ir sukeliama G1 fazės sustojimas. siSTMN1 taip pat gali slopinti ląstelių augimą in vivo
( P
< 01 0).. Mes pagaliau patvirtino, kad STMN1 yra spėjamas pasroviui tikslas miR-223 skrandžio vėžio. Mūsų išvados rėmė onkogeninio vaidmenį STMN1 skrandžio vėžio. STMN1 gali tarnauti kaip prognostinis persekiotoją ir galimą terapinį tikslą skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Kanas W Tong JHM Chan AWH, plaučių RWM, Chau SL Wong QWL et al. (2012) Stathmin1 Vaidina onkogeniniam vaidmuo ir yra MicroRNA-223 Tikslinė skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (3): e33919. Doi: 10,1371 /journal.pone.0033919

redaktorius: Wael El-Rifai, Vanderbilt universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Spalio 17, 2011; Priėmė: Vasario 19, 2012 m Paskelbta: Kovo 28, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Kang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas remia UGC bendradarbiavo mokslinių tyrimų fondo (CUHK04 /LIN /08) ir finansuotojo svetainė yra http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų ir antra dažniausia priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje. Jis turi aukščiausią dažnį Kinijos, Japonijos, Korėjos ir Rytų Azijos. Bendras prognozė yra prasta su 5 metų išgyvenamumas žemiau 30% daugelyje šalių [1]. Keli potencialūs rizikos veiksniai yra didelis druskos mityba, rūkymas, mažas suvartojamų vaisių ir daržovių, lėtiniu gastritu su glandularatrophy ir žarninės metaplazijos ir Helicobacter pylori (H. pylori)
infekcijos. Klinikinis rezultatas H. pylori
infekcija buvo įrodyta, kad turėti įtakos įvairių genetinių veiksnių, ypač H. pylori
-virulence susiję genai tokie kaip PVG
A VAC
A , ledo
A ir , Bab
A [2]. h. pylori
infekcija yra taip pat žinoma, kad sukelti, kad pro-uždegiminių fermento ciklooksigenazės (COX-2), kuriame parodytas aktyvinama raišką skrandžio vėžio [3] išraiška. Ankstesni tyrimai užfiksavo, genetinių ir epigenetinių pakitimų onkogenų, auglio slopinamojo genų ir neatitikimas remonto genų svarbą skrandžio vėžio vystymąsi. Protocadherin 10 [4], mirtis susijusių baltymų kinazės [5], išskiriami frizzled susijusių baltymų [6] ir peroksisomų proliferatorių aktyvuota gama receptorių [7] buvo įrodyta, kad sumažino išraišką ir auglio slopinamojo funkciją skrandžio kancerogenezėje. Kita vertus, retino rūgšties reguliuojama branduolinė matrica-susijęs baltymas [8] ir taip-susijęs baltymas 1, [9] abu buvo aktyvinama ir daryti onkogeninio funkciją auglių vystymuisi.

Stathmin1 (STMN1), taip pat žinomas kaip oncoprotein 18, yra svarbus citozolinių mikrotubulės-destabilizuoti baltymą, kuris vaidina svarbų vaidmenį į mitozės proceso Reglamentu mikrotubulės dinamikos ir kitų biologinių procesų [10] įvairovė. Aukšto lygio STMN1 išraiškos yra susijęs su blogos prognozės įvairiose navikais, įskaitant krūties vėžio [11], [12], prostatos vėžys [13], piktybiniai mezotelioma [14], gimdos kaklelio vėžys [15], ir stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma [16] , 2010 Jeon et al., Pirmoji pranešė, kad STMN1 per išraiška buvo teigiamai koreliuoja su limfmazgių metastazių ir pažangios sustojimo ir kraujagyslių invazija, ir neigiamai su pasikartojimų Išgyvenamumas be difuzinis tipo skrandžio karcinoma [17]. Ta pati grupė parodė onkogeninio vaidmenį STMN1 skrandžio vėžio in vitro
slopinimu dauginimosi, migracijos ir invazijos skrandžio ląstelių linijų beldžiasi STMN1 žemyn naudodami siRNA, ir vivo
slopinimas svetimo naviko augimas nuogas pelių siRNA transfekciją.

reguliavimas STMN1 išraiškos miR-223 buvo įrodytas kepenų ląstelių karcinoma mūsų ankstesniame tyrime [18]. Mikro RNR yra viengrandds RNR molekulių 21-23 bazinės poros ilgio klasės ir reguliuoti tikslinės genus išraišką per konkrečių bazinių poravimo sąveiką Mirna ir neišverstų regionuose tikslinių mRNR [19]. MiRNAs veiktų kaip onkogenų ar naviko slopintuvai žmogaus vėžio ir yra potencialiai naudoti kaip nauji diagnostikos ir prognozinių biologinių žymenų ir terapinių tikslų. Skrandžio vėžio, kelis miRNAs įskaitant miR-143 ir -145 [20], PPN-141 [21], PPN-31 [22], ir Pasaulis-106a [23] yra downregulated, kadangi kai oncogenetic miRNAs, pvz miR-21 ir Pasaulis-27a [24] yra aktyvinama.

Šios studijos tikslas ištirti funkcinį vaidmenį STMN1 skrandžio vėžio vystymosi ir mechanizmų reguliavimo STMN1 skrandžio vėžio.

rezultatai

aukštyn-regulation STMN1 skrandžio vėžio ląstelių linijų ir pirminių skrandžio vėžio mėginių

iš STMN1 mRNR išraiška buvo didesnis visoms 9 skrandžio vėžio ląstelių linijų, nei normalus skrandžio audinio, kaip parodyta Fig. 1A. Vakarų dėmė analizė patvirtino UP-reguliavimą STMN1 baltymų 11 skrandžio vėžio ląstelių linijų (pav. 1b). Iki reguliuojama STMN1 baltymų raiškos buvo pastebėtas 4 iš 5 pirminių skrandžio adenokarcinomos, lyginant su atitinkama ne-navikinio skrandžio gleivinės (1C pav.). KRL-PGR buvo atliktas siekiant ištirti STMN1 iRNR išraiška lygį. Pirminėje skrandžio adenokarcinomos, 28 iš 50 atvejų (56%) parodė, daugiau nei 1,5 karto iki-regulation STMN1 mRNR ekspresijos į naviko audinio, lyginant su atitinkama ne-navikinių gleivinę. Vidutinis lygis STMN1 iRNR išraiškos buvo reikšmingai didesnis navikų mėginiuose, nei kad per nevėžinės kolegomis ( P
= 0,040, 1D pav.).

STMN1 išraiška koreliuoja su prasta prognoze difuzinis tipas skrandžio vėžys

imunohistocheminis buvo atliktas, siekiant įvertinti STMN1 baltymo ekspresija 111 pirminių mėginių skrandžio adenokarcinoma. STMN1 baltymo ekspresija buvo daugiausia lokalizuotas auglio ląstelių (pav. 2a) citoplazmoje. Teigiamas reaktyvumas buvo pastebėtas 96 skrandžio adenokarcinomos (86,5%). Tarp šių STMN1 teigiamas navikų, 40 parodė stipri (3+), 37 parodė tarpinė (2+) ir 19 parodė silpnas (1+) STMN1 dažymo. Ankstesnis tyrimas parodė, kad STMN1 išraiška buvo neigiamai reglamentuoja navikas slopintuvas genų TP53 [25]. Todėl įvertino p53 baltymo ekspresiją imunohistocheminiu ir ištirti jos ryšį su STMN1 ekspresijos lygį. Netipinė atominės p53 išraiška buvo rasta 51 (45,9%) iš skrandžio adenokarcinomos ir dažniau STMN1-teigiamas naviko (50,0%), nei STMN1-neigiamas naviko (20,0%) ( P
= 0,03). Į clinicopathologic charakteristikos 111 pacientams, sergantiems skrandžio adenokarcinoma ir kartu su STMN1 išraiška buvo parodyta 1 lentelėje STMN1 teigiami navikai dažniau galima rasti amžiaus grupėje ( P
= 0,07) ir susijęs su p53 branduolinės išraiška ( p
= 0,03), vienmatės analizė parodė, kad senatvė ( p
< 0,036), histologija su difuzinio komponento ( p
= 0,012), etapas ( p
< 0,0001), "T" etapas ( p
= 0,012), N etapas ( p
< 0,0001), M etapas (, p
< 0,0001) ir limfmazgių metastazių buvimas ( p
< 0,0001), susijusią su prastos ligos-specifinis išlikimo. Multivariantinė Cox proporcinės pavojai regresinę analizę, tik amžius ( P
< 0,0001) ir etapas ( P
< 0,0001) buvo nepriklausomai susijęs su ligos būdingi išlikimo (2 lentelė). Be difuzinio tipo skrandžio adenokarcinoma, STMN1 išraiška buvo susijęs su senyvu amžiumi ( P
= 0,043), "T" etapas ( P
= 0,004) ir limfmazgių metastazių (buvimas P
= 0,046). Išraiška STMN1 į difuzinis tipo skrandžio adenokarcinoma buvo susijęs su blogesne ligos būdingi išlikimo pagal vieną požymį analizė ( P
= 0,01, pav. 2b).

Triukšmo slopinimo ir STMN1 slopina agresyvų fenotipą in vitro

Dažnas ląstelę STMN1 mRNR ir baltymų skrandžio navikų pasiūlė galimą onkogeninio vaidmenį šio geno. Nokdaunas iš STMN1 mažosios RNR interferencijos (siRNA) gerokai sumažino mRNR ir baltymų lygį (3a pav.) Ir žymiai sumažinti ląstelių proliferaciją in AGS ir MKN7 ląstelių kaip parodė MTT tyrimai ( P
< 0,001, pav. 3B). STMN1 siRNR tarpininkaujant augimas slopinančio poveikio dar kartą patvirtino tvirtinimo priklausoma monosluoksniui kolonijos formavimo metodu. Gerokai sumažinti kolonijų skaičių buvo stebimas ląstelių transfektuotose STMN1 siRNA, palyginti su plaktai kontrolės vienasluoksnę kultūros (sumažintas iki 49,2% ir 68,4% nuo plaktai kontrolę, AGS ir MKN7 atitinkamai P
< 0,001, pav. 3C)

mobilųjį judrumą tyrimų, žymiai sumažinti invazinių fenotipo per Matrigel dengtos Boyden kameros ( p
. <. 0.001 pav 3D) buvo įrodytas STMN1 siRNA-perkeltų AGS ir MKN7 ląstelių (sumažėjęs iki 51,6% ir 46,8% nuo plaktai kontrolės AGS ir MKN7 atitinkamai). Mobilieji migracijos tyrimuose, naudojant Transwell pralaidi atramos, reikšmingai sumažėjo ląstelių migruojančių per mikroakytojo membranos skaičius ( P
< 0,001 S1 paveiksle) buvo rastas STMN1 siRNA perkeltų AGS ir MKN7 ląsteles (sumažintas iki 65,9% ir 42,7% iš plaktai kontrolės AGS ir MKN7, atitinkamai), tai rodo, siSTMN1 gali slopinti migracijos galimybę skrandžio vėžio ląsteles.

Kadangi dauginimąsi slopinančio poveikio nepastebėta siSTMN1 perkeltų ląstelių, Tyrėme transfectants dėl ląstelinio ciklo parametrus, naudojant tėkmės citometrijos metodą. Dvidešimt keturias valandas po transfekciją, kaupimas G1 ląstelių buvo pastebėtas siSTMN1 transfectants palyginti su peštynės siRNA kontrolės (Pav. 4a). Ląstelių G1 fazę SGC7901 ląstelių padidėjo nuo 47,5% iki 53,7% per AGS, 38,0% iki 43,4% per MKN7 ir 30,1% iki 40,1%. Ir tai buvo kartu su S fazės ląstelių sumažėjimas. Laikantis ląstelių ciklo arešto rasti tekmės citometrijos analizę, mes nustatėme reikšmingai sumažinti fosfo-Rb (S807 /811) iš siSTMN1 transfectants (pav. 4b). Be to, siSTMN1 gali sukelti vėlai apoptozę keturias skrandžio vėžio ląstelių linijų išbandytų, AGS, MKN1, BGC823 ir SGC7901, kurie atstovavo kurio suskaldyti-PARP (Pav. 4B) padidėjimas. Tačiau jokio reikšmingo skirtumo buvo rastas p-AKT lygio (S473) ir p-stat3 (T705) tarp siSTMN1 ir neigiamos kontrolės transfekuota.

siSTMN1 slopina skrandžio naviko in vivo augimą

Jei toliau tirti STMN1 poveikį vivo
augimo skrandžio naviko, siSTMN1 ir kepti plaktą-perkeltų skrandžio vėžio ląstelės buvo švirkščiama po oda į dešinę ir į kairę nugaros šono nuogas pelių , atitinkamai. Nuo AGS ir MKN7 ląstelės nesudaro ksenoimplantai nuogas pelių, mes panaudojome SGC7901 ląsteles in vivo, pervežimas tyrimas. siSTMN1-transfectant suformuotas mažesnius auglius dešinėje nugaros krašto nei plaktai kontrolės kairėje nugaros krašto 3 savaites po injekcijos ( P
. < 0,01, pav 4C).

STMN1 yra pasroviui tikslinė miR-223 skrandžio vėžio

Kaip prognozavo Targetscan, potencialas Pasaulis-223 jungimosi vietos buvo rastas STMN1 3'UTR srities (padėtis 12-18 d STMN1 3'UTR srities). Išraiška miR-223 buvo downregulated 9 skrandžio vėžio ląstelių linijų, lyginant su įprasto skrandžio epitelio audinius (pav. 5A). Išraiška miR-223 buvo neigiamai koreliuoja su STMN1 baltymų raiškos ( P
= 0,05). Mes taip pat įvertino STMN1 baltymo ekspresija imunohistocheminiu ir PPN-223 lygį atliekant KRL-PGR 31 pirminių skrandžio vėžio pavyzdžius. Navikai, kurių didesnė STMN1 reaktyvumas (Finišavo 2+ ir 3+) parodė ne didelę tendenciją mažesnę Pasaulis-223 raiškos lygį ( P
= 0,137, 5B pav.).

Jei įrodyti galimą slopino PPN-223 apie STMN1 išraiška, mes perkeltų MIR-223 skrandžio vėžio ląstelių linijų AGS ir MKN7. MiR-223 slopinamas STMN1 mRNR ir baltymo ekspresiją abiem ląstelių linijų ( P
< 0,001, 5C pav.). Įrašyta Pasaulis-223 blokatorius išgelbėjo STMN1 baltymų ekspresiją MKN7 ląstelių, tai rodo, slopinančio poveikio buvo specialiai sukeltas miR-223 (pav. 5d). Dual liuciferazės Reporter tyrimai buvo atliekami studijuoti tarp miR-223 ir STMN1 3'UTR srities (pav. 5e) sąveiką. Žurnalistė konstruktai kuriuos numatomus ar mutavo jungimosi vietų buvo bendrai perkeltų su Pasaulis-223 mimikos į MKN28 ląstelių, skrandžio vėžio ląstelių linijos su santykinai mažą endogeninio STMN1 išraiška. MIR-223 darė stiprų slopinamąjį poveikį STMN1 3'UTR srities (49,7% P
< 0,001). Šis poveikis buvo pašalinta, kai sėkla regionas buvo išbrauktas (mutantas 1) arba sušvelnintos kai 4 nukleotidai dėl sėklų regione buvo mutavo. (67,6% P
< 0,001, mutantas 2)

Diskusijos

šiame tyrime mes parodė uP-reguliavimą STMN1 išraiška tiek mRNR ir baltymų kiekiai skrandžio adenokarcinomos, lyginant su įprasto skrandžio epitelį. Rezultatas rodo, kad STMN1 gali turėti onkogeninio funkciją skrandžio Tumorigenesis. STMN1 buvo pranešta būti prognostinė biologinis keliais vėžio, įskaitant gaubtinės žarnos vėžio [26], stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma [16], kepenų ląstelių karcinoma [27], [28], [29], [30] ir žodžiu suragėjusių ląstelių karcinoma [31]. Mes parodė, kad STMN1 išraišką, susijusią su amžiaus grupėje, pažangių T etape limfmazgių metastazių buvimo, ir trumpesnis ligos būdingi išgyvenimo metu difuzinis tipo skrandžio adenokarcinoma. Laikantis šios išvados, Jeon ir kt. Pranešama, kad STMN1 gali prognozuoti prastos prognozės į difuzinio tipo skrandžio vėžio ir koreliuoja su kraujagyslių invazija [17].

STMN1 reguliuoja mikrotubulės dinamiką skatinant depolimerizuojant mikrovamzdeliai ir užkirsti kelią polimerizacija tubulino heterodimerus. Slopinimas STMN1 išraiškos veda prie kaupimo ląstelių G2 /M fazių ir yra susijęs su sunkių mitozinis suklio sutrikimų ir sunkumų pasitraukimo iš mitozės [10]. STMN1 taip pat tarpininkauja su P27 (Kip1) poveikį ląstelių judrumui [32]. Be sarkoma ląstelių [33] ir nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžiu [34], STMN1 stimuliuojama ląstelių judrumą ir per tarpląsteliniame in vitro parsisiųsti ir padidino metastazavusiu potencialas vivo
. Prastai diferencijuotų skrandžio vėžio ląstelių linijų SNU638 ir SNU16, siRNR sukeltos STMN1 represijos gali slopinti ląstelių proliferaciją in vitro, parsisiųsti ir vivo
[17]. Šiame tyrime mes parodėme, kad siRNR nokdaunas iš STMN1 slopina ląstelių proliferaciją ir inkaravimo priklausoma kolonijų susidarymą, sutrikę invazija ir migracijos galimybes, sukeltas G1 suėmimą ir vėlai apoptozę skrandžio vėžio ląstelių linijas. Mes taip pat parodė, kad siSTMN1 slopinamas vivo
augimą skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC7901. Funkcinis slopinimas STMN1 lengvai sumažėjo ląstelių proliferaciją ir invazinių fenotipą, tai rodo protumorigenic vaidmenį STMN1 skrandžio vėžio.

MIR-223 yra evoliuciškai užkonservuoti Mirna kuri iš pradžių buvo pranešta granulopoiesis ir mieloidinio diferenciacijos [35]. Iš miR-233 išraiška gali būti varoma iš kaulų čiulpais transkripcijos veiksnių, PU.1 ir C /EBPs [36]. Tai gali reguliuoti keletą tikslinių genų, pavyzdžiui, Mef2c [37] A transcriptive veiksnys, kuris skatina mieloidinės kamieninių ląstelių proliferaciją. Jis taip pat vaidina svarbų vaidmenį per osteoklastų diferenciaciją [38], ir gali būti patiekiamas kaip potencialus biologinis žymuo pasikartojančių kiaušidžių vėžio [39] ir sepsis [40]. Mes anksčiau pranešė, kad STMN1 yra spėjamas pasroviui tikslas miR-223 į kepenų ląstelių karcinoma [18]. Šiame tyrime mes nustatėme mažas Pasaulis-223 raiškos lygis yra skrandžio vėžio ląstelių linijų ir atvirkštinis ryšys tarp miR-223 ir STMN1 baltymų išraiška. Iki liuciferazės reporteris tyrimus, mes patvirtino konkrečią sąveiką miR-223 ir STMN1 3'UTR srities skrandžio vėžio ląsteles. Neigiama moduliacijos poveikį iki miR-223 buvo toliau pagrįsti statistiškai patikimai sumažėjo STMN1 baltymų lygį skrandžio vėžio ląstelių linijas po Pasaulis-223 pakartotinai išraiška. Rezultatai palaikė, kad STMN1 yra spėjamas tikslas miR-223 skrandžio vėžio ląsteles. Įdomu, raiška miR-223 nepakeitė ląstelių proliferaciją ir apoptozę (S2A pav & 2B), bet gerokai sukelta ląstelių judrumas skrandžio vėžio ląstelių (S2C pav.) Laikantis šios išvados, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad Pasaulis-223 skatinamas ląstelių judrumą per po transkripcijos downregulation naviko slopinamojo EPB41L3 skrandžio vėžio ląstelių [41]. Nors vienas Mirna galite nukreipti kelis genus, daug Mirna gali reguliuoti vieną geną. Tikslus molekulinės mechaninė identifikavimas kaip tam tikra Mirna prisideda prie fenotipo pokyčius išlieka silpnas.

Inaktyvacija naviko slopintuvas genų TP53 yra labiausiai paplitusi ir dažniausiai studijavo molekulinės įvykiai žmogaus vėžio. Buvo pranešta, kad p53 tarpininkaujant su STMN1 promotoriaus veiklos represijas, todėl neigiamo reguliavimo STMN1 saviraiškos ir G2 /M arešto ląstelės ciklo [25], [42]. Ji buvo visuotinai pripažinta, kad laukinio tipo Baltymas p53 neaptinkamas imunohistocheminiu, nes ji yra nestabili ir yra santykinai trumpesnį pusinės. Mutantas Baltymas p53 sukaupta branduolio yra gana stabili ir turi ilgesnį pusinės eliminacijos, todėl jis aptinkamas imunohistocheminiu. Todėl, stipri ir difuzinis reaktyvumas paprastai rodo mutantas p53 [43]. Mes įvertino p53 statusą skrandžio adenokarcinoma imunohistocheminiu ir nustatė, kad dėl netipiško p53 reaktyvumas, susijusių su aukštuoju STMN1 išraiška. Todėl tikėtina, kad padidėjusią STMN1 gali iš dalies dėl nukenksminimo navikas slopintuvas genų p53 skrandžio vėžio.

Taigi, mes parodė UP-reguliavimą STMN1 skrandžio adenokarcinoma ir išraiška buvo susijęs su prasta liga konkrečių išgyvenimo difuzinis tipo skrandžio vėžio. Onkogeninė nuosavybė STMN1 skrandžio Tumorigenesis patvirtino funkcinių tyrimų. Mes taip pat parodė, kad STMN1 išraiška buvo neigiamai reglamentuoja miR-223 skrandžio vėžio ląsteles. Mūsų išvada rodo, kad STMN1 gali tarnauti kaip prognostinis persekiotoją ir galimą terapinį tikslą difuzinis tipo skrandžio adenokarcinoma.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linija ir ląstelių kultūros

vienuolika skrandžio vėžio ląstelių linijas, MKN28, Kato-III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NVI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, buvo gauti ir iš "Amerikos tipas kultūra kolekcija (Rokvilis, MD, JAV), RIKEN Mobilusis bankas (Tsukuba, Japonija), arba kaip dovana instituto Virškinimo ligos (IDD) Prince Velso ligoninėje. Šie ląstelių linijos yra auginami RPMI 1640 (GIBCO), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS, ES GIBCO), 100 V /ml penicilino ir 10 mikrogramai /ml streptomicino drėgmėje, 5% CO _{2 37 ° C temperatūroje ° C temperatūroje.}

Klinikiniai skrandžio adenokarcinoma mėginiai

111 skrandžio adenokarcinoma mėginių iš viso buvo gauti iš audinių banko anatominių ir ląstelių patologijos Velso princo ligoninė, Shatin, Honkongas. Dar 5 poros pirminius navikus ir gretimų ne tumoro audinių operacijos iš pacientų be jokių neoadjuvantas gydymo metu buvo surinkti. Bandiniai buvo užšaldyti iš karto -80 ° C tolesniam molekulinės analizės. Biopsijos mėginiai iš 50 porų skrandžio vėžio ir atitinkamu nevėžinės gleivinės buvo maloniai teikia IDD Princo Velso ligoninėje. Tyrimas patvirtino Bendrųjų Kinijos universiteto Honkonge naujas teritorijas Rytų Cluster Klinikinė tyrimų etikos komitetas, Honkonge (CREC Ref. Nr 2009.521) ir visi dalyviai raštu pateikė informuoti sutikimą pavyzdžių ir vėlesnei analizei kolekciją.

RNR išskyrimas, KRL-PGR ir MicroRNA KRL-PGR

viso RNR gavyba buvo atliekama naudojant Trizol reagento (Invitrogen) pagal gamintojo nurodymus. RNR koncentracija buvo matuojama NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Didelės talpos kDNR atvirkštinę transkripciją Rinkiniai ( "Applied Biosystems) buvo naudojamas sintezei. Kiekybiniam RT-PCR (KRL-PGR), TaqMan Universal PGR Master Mix (Applied Biosystems) buvo taikomas STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG; antiprasmiq: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; zondas Applied Biosystems, 185528556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). Santykinis išraiška lygis normalizavosi su gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) ir apskaičiuojamas pagal 2∧ (-Delta delta CT) metodą. Togman Mirna tyrimai (taikomieji BIOSYSTEMS) buvo naudojami kiekybiškai raiškos lygius brandaus miR-223. Iš viso RNR buvo panaikintas perrašyti MultiScribe (Applied Biosystems) reakcijos mišinio, turinčio Pasaulis-specifinis kamieninių kilpa pakeisti transcriptive gruntą. Visos nepageidaujamos reakcijos buvo atliekamas trimis egzemplioriais ir vandens ruošiniai buvo įtrauktos kaip neigiamos kontrolės.

Vakarų dėmė ir imunohistocheminis

Baltymai buvo išgauti iš skrandžio vėžio ląstelių linijų ir suporuotas pirminių audinių naudojant Ripa lizės buferiniame tirpale su proteinazės inhibitorius. Baltymo koncentracija buvo matuojamas pagal Bradfordo (BOD-Rad) metodą ir 20 mikrogramų baltymų sumaišyti su 2 × SDS buferinio tirpalo buvo pakrauta už juostos, atskirti 12% SDS-poliakrilamido gelyje. STMN1 baltymas buvo aptiktas su polikloniniu kovos su STMN1 antikūnų (Cell signalizacijos,ŏ2, 1:1000). Kitos antikūnai iš Mobilusis Signalizacijos komerciškai, suskaldyti PARP (Asp214) (κ1, 1:1000), PHOSPHO-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), PHOSPHO-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) ir PHOSPHO-stat3 (T705) (Β5, 1:2000).

imunohistocheminis buvo atlikta 4 mkm storio sekcijų iš formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų egzempliorių. Po de vaškavimas ir ksileno ir rūšiavo etanolio, skyriai buvo inkubuojami 3% H _{2O 2 sprendimas 25 minučių blokuoti endogeninius peroksidaze veiklą, o vėliau patyrė microwaving į citrato buferis antigeno išimti. Pirminiai antikūnai (1:25 už STMN1 iš ląstelių signalizacijos ir 1:100 už p53 nuo DaKo) buvo inkubuojami esant 4 ° C naktį ir spalvotas junginys plėtra buvo atlikta naudojant įsivaizduoti sistemą (DaKo). Citoplazmos išraiška STMN1 buvo įvertintas skiriant Dalis rezultatą ir intensyvumo balas. Proporcija rezultatas buvo pagal proporcingai naviko ląstelių, turinčių teigiamą citoplazminio dažymo (0, nėra; 1, < = 10%; 2, nuo 10 iki < = 25%; 3, > 25-50%; 4, > 50%). Intensyvumas rezultatas buvo skirta vidutinė intensyvumo teigiamų vėžinių ląstelių (0, nėra; 1, silpnas; 2, tarpinis produktas; 3, stiprus). Citoplazmos rezultatas STMN1 buvo neproporcingos ir intensyvumo balai produktą, nuo 0 iki 12. citoplazmos išraiška buvo suskirstyti į neigiamas (rezultatas 0), 1+ (Finišavo 1 ir 3), 2+ (rezultatas 4-6), ir 3+ (Finišavo 7-12). Branduolinė p53 raiška > 10% vėžinių ląstelių pelnytas kaip nukrypusiu nuo normos raiškos}

STMN1 funkciniai tyrimai

transfekciją STMN1 siRNA ir peštynės kontrolės (QIAGEN) buvo atliekamas naudojant Lipofectamine 2000 transfekcijq reagento (. Invitrogen). Ląstelių proliferacija buvo vertinama naudojant CellTiter 96 neradioaktyvaus ląstelių proliferaciją bandymo (PROMEGA) pagal gamintojo nurodymus. Dėl kolonija formavimo tyrimai su monomolekulinių sluoksnių kultūras, ląstelių transfektuotose STMN1 siRNA ar peštynės kontrolės buvo auginamos 10 dienų. Ląstelės buvo nustatyti su 70% etanolio 15 minučių ir nudažomi su 2% violetinei. Kolonijos su daugiau nei 50 ląstelių viename kolonijos buvo skaičiuojami. Eksperimentai buvo kartojamas tris kartus.

mobilųjį invazija tyrimai buvo atliekami naudojant BD Biocoat Matrigel invazija rūmai (BD biomokslų). Transfekuotos ląstelės buvo pasėjamos viršutiniame kameroje, kultūros terpė, kuriame yra 1% FBS, su visiškai terpės (kurių sudėtyje yra 10% FBS) pridedama prie apatinio kameroje. Po 24 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje, ląstelių, kurios įsiveržė per Matrigel membranos buvo nustatyti su 100% metanolio 2 minutes ir nudažomi su 1% toluidino mėlyna dar 2 min. Dėl statistikos analizės, ląstelės dėl membranos apačioje buvo skaičiuojamas nuo 5 atsitiktinių mikroskopinių srityse (originalas didinimas × 400). Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas tris kartus, ir vidutinės vertės, buvo spaudžiamas iš 2 nepriklausomų eksperimentų.

ląstelių migracijos tyrimai buvo atliekami naudojant Transwell pralaidi atramų (Corning, NY). Ląstelės buvo surinktos iš kultūros indai 24 valandas po to, kai transfekciją, tris kartus plaunamos mitybinės terpės ir vėl suspenduojamos. Tada 300 ul iš ląstelių suspensijos (5 × 10 ^{4 ląstelių) buvo pridėta prie transwells, su 500 ul kultūros terpėje, turinčioje 10% FBS į apatinę kamerą. Po 24 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje, ląstelių, kurios gali migruoja per mikroakytojo membranos buvo nustatyti su 100% metanolio 2 minutes ir nudažomi su 1% toluidino mėlyna dar 2 min. Dėl statistikos analizės, mes skaičiuojami pridedamą ląstelių skaičių 3 Peržiūrėti srityse kiekvienam kameroje atsitiktinai ir paėmė vidutinį ląstelių skaičių kiekvienoje srityje.}

tėkmės citometrijos analizės ląstelių ciklo arešto pervežimas

ląstelės ciklo analizė, AGS, MKN7 ir SGC7901 ląstelės buvo surinkti tuo metu, praėjus 24 valandoms po transfekciją per 6 cm plokščių. Prieš transfekciją, ląstelės buvo atlikta badu 12 valandų sinchronizacija. Ląstelės buvo surinktos naudojant šaltą PBS ir nustatytas 70% šaltame etanolyje už per naktį 4 ° C ir veikiamas su 1 ng /ml RNaze A 10 minučių esant 37 ° C temperatūroje. Korinio DNR buvo nudažomi su 15 ng /ml propidiumo jodidas (PI) 30 minučių 37 ° C temperatūroje tamsoje. Ląstelės tada buvo surūšiuoti pagal FACS Calibur tėkmės citometre (Becton Dickinson, CA) ir ląstelių ciklo profiliai buvo nustatomas naudojant ModFitLT programinę įrangą (Becton Dickinson, San Diegas, CA). Eksperimentai buvo pakartota du atskirus kartus.

, in vivo
tumorogeniškumo tyrimas

SGC7901 ląstelės (2 × 10 ^{6cells sustabdytas 0,1 ml PBS) laikinai perkeltų su siScramble ir siSTMN1 buvo švirkščiamas po oda nugaros šono devynių 4 savaičių amžiaus vyrų Balb /c nuogas pelėmis (siSTMN1 dešinėje pusėje ir neigiamos kontrolinės ląstelių kairėje). Į ksenoimplantai buvo paimtas ir naviko skersmuo buvo matuojamas ir registruojamas į savaitę 3 auglio apimtis (mm 3) buvo apskaičiuotas išmatavus ilgiausią ir trumpiausią skersmuo naviko ir skaičiavimo pabaigos taip: garso = (trumpiausias skersmuo ) 2 × (ilgiausias skersmuo) × 0,5. Gyvūnas tvarkymo ir visi eksperimentiniai procedūras patvirtino Gyvūnų etikos komiteto Kinijos universiteto Honkonge.}

liuciferazės Reporter tyrimai ir Pasaulis-223 transfekcija

spėjamas Pasaulis-223 privalomas svetainėje adresu 3 "neišverstas regionas (3'UTR) iš STMN1 buvo klonuotas į pMIR-ataskaitos vektoriaus (Ambion Inc.). Du mutantas konstruoja buvo gautos arba ištrynimo arba mutacijų pateikti papildomos sėklų vieną po kitos į miR-223 surišanti sritis, kaip aprašyta anksčiau [18]. Firefly liuciferazė konstruktas buvo bendrai perkeltų su Renilla liuciferazė vektoriaus valdymo į MKN28 ląstelių į arba sintetinių Pasaulis-223 molekulių ar peštynės Mirna kontrolės buvimą. Dual liuciferazės Reporter tyrimai (PROMEGA) buvo atlikti 36 valandų po transfekciją. Lipofectamine 2000 buvo naudojamas miR-223 transfekciją į AGS ir MKN7 ląsteles.

Statistinė analizė

Studentų t testas buvo naudojamas palyginti biologinio elgesio skirtumas tarp STMN1 triuškinantis ląstelių ir peštynės siRNA-perkeltų ląstelių, ir tarp Pasaulis-223-perkeltų ir peštynės Mirna perkeltų ląstelių. Koreliacija tarp STMN1 saviraiškos ir clinicopathologic parametrus vertino neparametrinis Spirmeno rho rangas testą. Kaplan-Meier metodu buvo įvertinti išgyvenimo už kiekvieno kintamojo. Iš išgyvenimo kreivių atitikmenys buvo išbandytas log-rank statistiką. Tiems kintamiesiems yra statistiškai reikšmingas rasti vieną požymį išgyvenamumo analizė ( P
< 0,05), COX proporcingas pavojai modelis su tikimybę santykis statistikos dirbo toliau vertinti juos daugiamatis išgyvenamumo analizė. Visa statistinė analizė atlikta SPSS programinę įrangą (versija 16.0; SPSS Inc). Dviejų-tailed P
-Pridėtinės mažesnis kaip 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas ir P
-Pridėtinės mažiau nei 0.001 buvo laikomi labai reikšmingas.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
siSTMN1 slopina ląstelių migraciją į skrandžio vėžį. Reprezentacinės nuotraukos AGS ir MKN7 ląstelių, kurios buvo transfektuotose siSTMN1 ir siScramble tada migravo per mikroakytojo membranos (** P
< 0,001)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0033919. s001
(TIF)
S2 pav.
funkcinis tyrimas PPN-223 skrandžio vėžio ląstelių linijas. (A), MTT proliferacinis tyrimai apie AGS, MKN7 ir SGC7901 po Pasaulis-223 transfekciją (praėjus 4 dienoms po transfekciją). (B), Vakarų dėmė analizė suskaldyti-PARP į AGS ir MKN7 ląstelių 24 valandas po Pasaulis-223 transfekciją. rodomi (C) atstovas Matrigel invazija vaizdai AGS, MKN7 ir SGC7901. Pasaulis-223 sustiprino ląstelių invazija gebėjimą skrandžio vėžio ląstelių (* P
< 0,01; ** P
< 0,001). Ląstelių skaičius buvo skaičiuojamas 3 atsitiktinių vaizdo laukus ir klaidų barai atstovavo standartinius nuokrypius
Doi.: /Journal.pone.0033919.s002
(TIF)
10,1371

• PLoS ONE: Glyoxalase-I romano prognozė veiksnys, susijęs su skrandžio vėžiu Progression
• PLoS ONE: prognostinę reikšmė apoptozę susijusių biologiniams žymenims Kinijos skrandžio vėžys Patients