PLOS ONE: Stathmin1 Plays Oncogênicos Papel e é um alvo de microRNA-223 em gástrica Cancer

Abstract

Stathmin1 (STMN1) é um candidato oncoproteína e marcador prognóstico em vários tipos de cânceres. Este estudo teve como objetivo analisar as suas funções de expressão e biológicas no câncer gástrico. A expressão de STMN1 foi avaliada por qRT-PCR, transferência de Western e imuno-histoquímica. A função biológica de STMN1 foi determinada por ensaios de proliferação MTT, formação de colónias em monocamada e ensaios de invasão de células utilizando a técnica de RNA de interferência pequena em linhas celulares de cancro gástrico. Também explorou a regulação da expressão STMN1 pelo microRNA-223. STMN1 foi regulada positivamente em linhas celulares de cancro gástrico e adenocarcinomas gástricos primários. tumores STMN1-positivas eram mais propensos a ser encontrada no grupo etário de idade e associada a p53 expressão nuclear. Em adenocarcinomas gástrico tipo difuso, expressão STMN1 foi correlacionada com a idade ( p
= 0,043), estágio T ( p
= 0,004) e metástases em linfonodos ( p
= 0,046). Expressão de STMN1 no adenocarcinoma gástrico tipo difuso foi associado à sobrevida específica pobres doença por análise univariada ( p
= 0,01). STMN1 knockdown em linhas de células AGS e MKN7 proliferação suprimido ( p Art < 0,001), reduziu a formação de monocamada colónia ( p Art < 0,001), invasão celular inibida e capacidade de migração ( p Art < 0,001) e paragem fase G1 induzido. siSTMN1 também podem suprimir o crescimento de células in vivo
( p Art <. 0 01). Nós finalmente confirmou que STMN1 é um alvo a jusante putativa de miR-223 em câncer gástrico. Nossas descobertas apoiou um papel oncogênico dos STMN1 no câncer gástrico. STMN1 pode servir como um marcador de prognóstico e um potencial alvo terapêutico para câncer gástrico

Citation:. Kang W, Tong JHM, Chan AWH, Lung RWM, Chau SL, Wong QVT, et al. (2012) Stathmin1 Plays Oncogênicos Papel e é um alvo de microRNA-223 em câncer gástrico. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10.1371 /journal.pone.0033919

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de outubro de 2011; Aceito: 19 de fevereiro de 2012; Publicado: 28 Março 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Kang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é suportado por UGC Fundo de Investigação Colaborou (CUHK04 /CRF /08) e do site do financiador é http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos tumores malignos mais comuns e a segunda causa mais frequente de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Ele tem a maior incidência na China, Japão, Coreia do Sul e leste da Ásia. O prognóstico geral é pobre, com uma taxa de sobrevida de 5 anos abaixo de 30% na maioria dos países [1]. Vários fatores de risco potenciais incluem dieta rica em sal, tabagismo, baixa ingestão de frutas e legumes, gastrite crônica com glandularatrophy e metaplasia intestinal, e Helicobacter pylori (H. pylori)
infecção. O resultado clínico do H. pylori
tem sido mostrado para ser influenciado por vários factores genéticos, particularmente H. genes associados pylori
-virulence tais como cag
A, vac
A, ice
A e bab
A [2]. H. pylori
também é conhecida por induzir a expressão do enzima ciclo-oxigenase pró-inflamatória (COX-2), que mostra a expressão regulada positivamente em cancro gástrico [3]. Estudos anteriores documentaram a importância das alterações genéticas e epigenéticas de oncogenes, genes supressores tumorais e genes de reparo no desenvolvimento de câncer gástrico. Protocadherin 10 [4], a proteína-quinase associada à morte [5], segregada proteína relacionada com frizzled [6] e gama PPAR [7] Foi demonstrado que têm expressão reduzida e função supressora de tumores em carcinogénese gástrica. Por outro lado, a proteína associada a matriz nuclear regulada por ácido retinóico [8] e sim associada a uma proteína de [9] foram regulados positivamente e exercer a função oncogénica no desenvolvimento do tumor.

Stathmin1 (STMN1), também conhecida como oncoproteína 18, é uma importante proteína de microtúbulo desestabilizar citosólica que desempenha um papel crítico no processo de mitose através de regulação da dinâmica dos microtúbulos, e uma variedade de outros processos biológicos [10]. Elevado nível de expressão STMN1 está associada com mau prognóstico em várias malignidades, incluindo o cancro da mama [11], [12], o câncer de próstata [13], mesotelioma maligno [14], o cancro do colo do útero [15], e carcinoma de células escamosas do esôfago [16] . Em 2010, Jeon et al. primeiro relatou que STMN1 sobre-expressão foi positivamente correlacionada com metástases em linfonodos e estadiamento avançado e invasão vascular, e negativamente com a sobrevida livre de recorrência do carcinoma gástrico tipo difuso [17]. O mesmo grupo demonstrou o papel oncogênico dos STMN1 no câncer gástrico pela inibição in vitro
da proliferação, migração e invasão em linhas celulares gástricas batendo STMN1 para baixo, usando siRNA, e in vivo
inibição da o crescimento do tumor de xenoenxerto em ratinhos nus por siARN transfecção.

Regulação da expressão STMN1 por miR-223 foi demonstrada em carcinoma hepatocelular pelo nosso estudo anterior [18]. As micro-ARN são uma classe de moléculas de ARN de cadeia simples de 21-23 pares de bases de comprimento e regular a expressão de genes alvo através de interacções específicas de emparelhamento de bases entre miARN e regiões não traduzidas do ARNm-alvo [19]. MiRNAs iria funcionar como oncogenes ou supressores de tumor em cancros humanos e são potencialmente utilizados como novos biomarcadores diagnósticos e prognósticos e alvos terapêuticos. No cancro gástrico, incluindo vários miARNs miR-143 e -145 [20], o miR-141 [21], o miR-31 [22] e miR-106a [23] são regulados negativamente, enquanto que alguns miARNs oncogenetic tais como o miR-21 e miR-27a [24] são regulados positivamente.

Este estudo teve como objetivo investigar o papel funcional da STMN1 no desenvolvimento do câncer gástrico e mecanismos de regulação de STMN1 no câncer gástrico.

resultados

-regulação de STMN1 em linhas celulares de cancro gástrico e cancro gástrico amostras primárias

a expressão de ARNm STMN1 foi maior em todos os 9 linhas de células de cancro gástrico do que o tecido gástrico normal, tal como mostrado na Fig. 1A. A análise Western blot confirmou que a sobre-regulação de proteína STMN1 em 11 linhas celulares de cancro gástrico (Fig. 1B). -Regulada a expressão da proteína STMN1 foi observada em 4 dos 5 adenocarcinomas gástricos primários em comparação com a mucosa gástrica não tumoral correspondente (Fig. 1C). QRT-PCR foi realizado para investigar o nível de expressão de ARNm de STMN1. Em adenocarcinoma gástrico primária, 28 dos 50 casos (56%) mostrou que mais de 1,5 vezes a sobre-regulação da expressão de ARNm STMN1 no tecido do tumor em comparação com o correspondente mucosa não-tumoral. A média do nível de expressão de ARNm de STMN1 foi significativamente superior nas amostras de tumor do que nos homólogos não-cancerosas ( P
= 0,040, Fig. 1D).

STMN1 expressão correlaciona-se com um mau prognóstico em tipo difuso câncer gástrico

a imuno-histoquímica foi realizada para avaliar a expressão da proteína STMN1 em 111 amostras de adenocarcinoma gástrico primários. A expressão da proteína foi STMN1 localizada principalmente no citoplasma das células de tumor (Fig. 2a). imunorreactividade positiva foi observada em 96 adenocarcinomas gástricos (86,5%). Entre esses tumores STMN1-positivos, 40 apresentaram forte (3+), 37 apresentaram intermediário (2+) e 19 mostraram fraca (1+) STMN1 coloração. estudo anterior demonstrou que a expressão STMN1 foi regulada negativamente por TP53 gene supressor de tumores [25]. Por isso, avaliamos a expressão da proteína p53 por imuno-histoquímica e explorou sua correlação com o nível de expressão STMN1. expressão da p53 nuclear aberrante foi encontrada em 51 (45,9%) dos adenocarcinomas gástricos e mais frequentemente em STMN1 positivo tumor (50,0%) do que tumor STMN1-negativos (20,0%) ( p
= 0,03). As características clínico-patológicas de 111 pacientes com adenocarcinoma gástrico e a associação com a expressão STMN1 foram apresentados na Tabela 1. Os tumores STMN1-positivas eram mais propensos a ser encontrada no grupo etário ( p
= 0,07) e associada a p53 expressão nuclear ( p
= 0,03), a análise univariada indicou que a idade avançada ( p Art < 0,036), histologia com componente difuso ( p
= 0,012), estágio ( p Art < 0,0001), estágio T ( p
= 0,012), estágio N ( p Art < 0,0001), M palco ( p
< 0,0001) ea presença de metástase ganglionar ( p Art < 0,0001) correlacionado com a sobrevivência específica da doença pobres. Pela análise de Cox de regressão multivariada, apenas a idade ( p Art < 0,0001) e estágio ( p Art < 0,0001) foram independentemente associados com a sobrevivência específica da doença (Tabela 2). Em adenocarcinoma gástrico tipo difuso, expressão STMN1 foi associada à idade avançada ( p
= 0,043), estágio T ( p
= 0,004) ea presença de metástases em linfonodos ( p
= 0,046). Expressão de STMN1 no adenocarcinoma gástrico tipo difuso foi associado à sobrevida específica da doença mais pobres por meio de análise univariada ( p
= 0,01, Fig. 2B).

O silenciamento de STMN1 inibe o fenótipo agressivo in vitro

upregulation frequente de mRNA STMN1 e proteína em tumores gástricos sugeriu um potencial papel oncogênico deste gene. Knockdown de STMN1 por interferência de RNA pequeno (ARNsi) marcadamente reduzido nível de ARNm e de proteína (Fig. 3A) e proliferação celular significativamente reduzida em células AGS e MKN7 como demonstrado por ensaios MTT ( P
< 0,001, Fig. 3B). STMN1 siRNA mediada efeito supressor de crescimento foi ainda confirmada por ensaio de formação de colónia monocamada dependentes de ancoragem. Observou-se uma redução significativa do número de colónias em células transfectadas com STMN1 siRNA, em comparação com controles confusão na cultura em monocamada (reduzido para 49,2% e 68,4% dos controles confusão na AGS e MKN7 respectivamente; p Art < 0,001, a Fig. 3C)

em ensaios de motilidade celular, uma redução significativa no fenótipo invasivo através da câmara de Boyden Matrigel-revestido ( P
<.. 0,001, Fig 3D) foi demonstrada em STMN1 células AGS e MKN7 transfectadas com siRNA (reduzido para 51,6% e 46,8% dos controles confusão na AGS e MKN7 respectivamente). Em ensaios de migração celular Transwell usando Suportes permeáveis, uma diminuição significativa no número de células que migram através da membrana microporosa ( P
< 0,001, Figura S1) foi encontrada em células transfectadas STMN1 siARN AGS e MKN7 (reduzida para 65,9% e 42,7% dos controles confusão na AGS e MKN7, respectivamente), sugerindo siSTMN1 poderia inibir a capacidade de migração das células cancerosas gástricas.

uma vez que foi observado um efeito inibidor do crescimento em células siSTMN1 transfectadas, foi analisada a transfectantes para os parâmetros do ciclo celular usando citometria de fluxo. Vinte e quatro horas após a transfecção, foi observada a acumulação de células em G1 transf ectantes siSTMN1 em comparação com os controlos precipitação siRNA (Fig. 4a). As células na fase G1 foram aumentados de 47,5% a 53,7% em AGS, 38,0% a 43,4% em MKN7, e 30,1% a 40,1% em SGC7901 células. E esta foi acompanhada de uma diminuição de células em fase S. De acordo com a paragem do ciclo celular encontrado em análise de citometria de fluxo, observou-se uma redução significativa de fosfo-Rb (S807 /811) em transfectantes siSTMN1 (Fig. 4B). Além disso, siSTMN1 poderia induzir apoptose tardia em quatro linhas celulares de cancro gástrico testados, AGS, MKN1, BGC823 e SGC7901, que foi representada por um aumento de PARP clivada-(Fig. 4B). No entanto, nenhuma diferença significativa foi encontrada no nível de p-AKT (S473) e p-Stat3 (T705) entre siSTMN1 e controle negativo transfectadas.

siSTMN1 inibe o crescimento de tumor gástrico In vivo

para investigar mais o efeito de STMN1 em no crescimento vivo
de tumor gástrico, siSTMN1 e células cancerosas gástricas transfectadas-mexidos foram injectados por via subcutânea à direita e à esquerda flanco dorsal de ratos pelados , respectivamente. Como as células AGS e MKN7 não formam xenoenxertos em ratinhos nus, usamos SGC7901 células para in vivo
estudo. siSTMN1-transf formado tumores menores no flanco dorsal direito do que os controles mexidos no flanco dorsal esquerda 3 semanas após a injeção ( p
. < 0,01, Fig 4C).

STMN1 é uma jusante alvo de miR-223 no cancro gástrico

Como previsto por TargetScan, o potencial local de ligação de miR-223 foi encontrado no STMN1 3'UTR (posição 12-18 de STMN1 3'UTR). Expressão de miR-223 foi regulada negativamente em 9 linhas de células de cancro gástrico em comparação com o tecido epitélio gástrico normal (Fig. 5A). Expressão de miR-223 foi negativamente correlacionada com a expressão da proteína STMN1 ( p
= 0,05). Foram avaliados ainda mais a expressão da proteína STMN1 por imuno-histoquímica e do nível de miR-223 por qRT-PCR em 31 amostras com câncer gástrico primários. Tumores com maior STMN1 imunorreatividade (escore 2+ e 3+) mostrou uma tendência não significativa para um nível de expressão de miR-223 inferior ( p
= 0,137, Fig. 5B).

Para demonstrar o efeito supressor potencial de miR-223 sobre a expressão STMN1, nós transfectadas miR-223 a linhas de células de cancro gástrico AGS e MKN7. MiR-223 suprimiu o ARNm STMN1 e expressão de proteína em ambas as linhas celulares ( P
< 0,001, Figura 5C.). Adicionando o miR-223 bloqueador resgatou a expressão da proteína em STMN1 MKN7 células, sugerindo que o efeito supressor foi especificamente induzido por miR-223 (Fig. 5D). Os ensaios de repórter de luciferase dupla foram realizados para estudar a interacção entre o miR-223 e STMN1 3'UTR (Fig. 5E). As construções repórter contendo previsto ou sítios de ligação mutados foram co-transfectadas com o miR-223 para imitar células MKN28, uma linha celular de cancro gástrico com relativamente baixa expressão STMN1 endógena. MiR-223 exerceu forte efeito inibidor sobre STMN1 3'UTR (49,7%, p Art < 0,001). O efeito inibitório foi eliminado quando a região de semente foi eliminada (Mutant 1), ou aliviados quando 4 nucleotídeos sobre a região da semente foram mutado. (67,6%, p Art < 0,001, Mutante 2)

Discussão

neste estudo, demonstramos o up-regulação da expressão STMN1 em ambos os mRNA e os níveis de proteína em adenocarcinomas gástricos em comparação com o epitélio gástrico normal. O resultado sugeriu que STMN1 pode ter função oncogénica na tumorigênese gástrico. STMN1 foi relatado para ser um biomarcador prognóstico em vários tipos de cancro, incluindo o cancro colorectal [26], carcinoma de células escamosas do esôfago [16], carcinoma hepatocelular [27], [28], [29], [30] e carcinoma de células escamosas de boca [31]. Nós demonstramos que a expressão STMN1 associada com o grupo de idade avançada, estágio T avançado, a presença de metástase ganglionar, e uma menor sobrevida específica da doença no adenocarcinoma gástrico tipo difuso. De acordo com este achado, Jeon et al. informou que STMN1 poderia prever mau prognóstico no tipo difuso de câncer gástrico e correlacionar com invasão vascular [17].

STMN1 regula dinâmica dos microtúbulos, promovendo a despolimerização de microtúbulos e prevenir polimerização de heterodímeros de tubulina. A inibição da expressão STMN1 conduz a uma acumulação de células nas fases G2 /M e está associada a anomalias graves do fuso mitótico e dificuldade na saída da mitose [10]. STMN1 também medeia os efeitos de p27 (KIP1) sobre a motilidade de células [32]. Em células de sarcoma [33] e câncer de pulmão não-pequenas células [34], STMN1 estimulado motilidade celular e através da matriz extracelular in vitro
e aumentou o potencial metastático in vivo
. Em linhas celulares de cancro gástrico pouco diferenciados SNU638 e SNU16, induzida por siRNA repressão STMN1 poderia suprimir a proliferação de células in vitro
e in vivo
[17]. Neste estudo mostramos que siRNA knockdown de STMN1 inibiu a proliferação celular e formação de colónias dependentes de ancoragem, invasão prejudicada e a capacidade de migração, induzido a paragem em G1 e apoptose tardia em linhas celulares de cancro gástrico. Nós ainda demonstrado que siSTMN1 inibida in vivo
crescimento do câncer gástrico linha de células SGC7901. A inibição funcional de STMN1 prontamente diminuiu a proliferação celular e fenótipo invasivo, sugerindo um papel protumorigenic de STMN1 no câncer gástrico.

O miR-223 é um miRNA evolutivamente conservada que foi inicialmente relatada em granulopoiesis e diferenciação mielóide [35]. A expressão de miR-233 pode ser impulsionado por os factores de transcrição mielóides, PU.1 e C /EBP [36]. Pode regular vários genes alvo, tais como MEF2C [37], um factor transcritivo que promove a proliferação de células progenitoras mielóides. Ele também desempenha um papel essencial durante osteoclastos diferenciação [38], e pode ser servido como um potencial biomarcador para o câncer de ovário recorrente [39] e sepse [40]. Nós relatado anteriormente que STMN1 é um alvo a jusante putativa de miR-223 em carcinoma hepatocelular [18]. Neste estudo, observou-se um baixo nível de expressão de miR-223 em linhas celulares de cancro gástrico e uma relação inversa entre o miR-223 e expressão da proteína STMN1. Por ensaios de repórter de luciferase, que confirmou a interação específica entre miR-223 e STMN1 3'UTR em células cancerosas gástricas. O efeito de modulação negativa de miR-223 foi secundado por um nível de proteína STMN1 significativamente reduzida em linhas celulares de cancro gástrico após miR-223 re-expressão. Os resultados suportada que STMN1 é um alvo putativo de miR-223 em células de cancro gástrico. Curiosamente, a sobre-expressão de miR-223, não alterou a proliferação celular e a apoptose (Figura S2A & 2B), mas a motilidade celular induzida significativamente em células de cancro gástrico (Figura S2C). De acordo com esse achado, um estudo recente demonstrou que miR-223 promoveu motilidade celular através da regulação negativa pós-transcricional de tumor supressor EPB41L3 em células cancerosas gástricas [41]. Enquanto um único miRNA pode ter como alvo genes múltiplos, múltiplos miRNA pode regular um único gene. A identificação mecanicista molecular exata de como um determinado miRNA contribui para as alterações fenotípicas permanece indefinida.

Inactivação de tumor TP53 gene supressor é os eventos moleculares mais comuns e mais freqüentemente estudados em câncer humano. Tem sido relatado que a p53 mediada pela repressão da actividade do promotor STMN1, resultando na regulação negativa da expressão STMN1 e G2 /M em paragem do ciclo celular [25], [42]. Tem sido geralmente aceite que a proteína de tipo selvagem p53 não é detectável por imuno-histoquímica, porque é instável e tem uma meia-vida relativamente mais curto. proteína p53 mutante acumulado no núcleo é relativamente estável e tem uma meia-vida mais longa, o que faz com que seja detectável por imuno-histoquímica. Portanto, um imuno-reactividade forte e difusa é geralmente indicativo de p53 mutante [43]. Nós avaliamos o estado de p53 no adenocarcinoma gástrico por imuno-histoquímica e descobriu que imunorreactividade p53 aberrante associada com maior expressão STMN1. Por conseguinte, é plausível que a sobre-expressão de STMN1 pode, em parte, devido à inactivação do gene supressor de tumor p53 em cancros gástricos.

Em conclusão, foi demonstrada a sobre-regulação de STMN1 no adenocarcinoma gástrico e a expressão foi correlacionada com um mau sobrevida específica da doença no câncer gástrico tipo difuso. A propriedade oncogênico de STMN1 na tumorigênese gástrica foi confirmada por estudos funcionais. Nós também demonstrado que a expressão de STMN1 foi regulada negativamente por miR-223 em células de cancro gástrico. A nossa descoberta sugeriu que STMN1 pode servir como um marcador de prognóstico e um potencial alvo terapêutico para o adenocarcinoma gástrico tipo difuso.

Materiais e Métodos

linha celular e cultura de células

Onze gástrica linhas celulares de cancro, MKN28, KATO-III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, foram obtidos a partir de qualquer American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA), RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japão) ou como um presente da Digestive Disease Institute (IDD) do príncipe de Gales Hospital. Estas linhas de células são cultivadas em RPMI 1640 (GIBCO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco UE), 100 U /ml de penicilina e estreptomicina 10 ug /ml, numa atmosfera humidificada de 5% de CO _{2 a 37 ° C.}

amostras de adenocarcinoma gástrico clínicos

Um total de 111 amostras de adenocarcinoma gástrico foram obtidos a partir do banco de tecidos de Anatomia e Patologia Celular, Prince of Wales Hospital, Shatin, Hong Kong. Outra 5 pares de tumores primários e tecidos não tumorais adjacentes foram recolhidas durante a cirurgia de doentes sem qualquer terapia neoadjuvante. As amostras foram congeladas imediatamente em -80 ° C para posterior análise molecular. amostras de biópsia de 50 pares de câncer gástrico e mucosa não canceroso correspondente foram gentilmente cedidas pelo IDD do príncipe de Gales Hospital. O estudo foi aprovado pela Universidade Joint Chinesa de Hong Kong New Territories East Cluster Comitê de Ética em Pesquisa Clínica, Hong Kong (CREC Ref. No. 2.009,521) e todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito para a recolha de amostras e análise posterior.

extracção de ARN, qRT-PCR e microARN qRT-PCR

extracção de RNA total foi realizada utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi medida por NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kits (Applied Biosystems) foram usadas para a síntese de cDNA. Para RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) foi aplicada durante STMN1 (Sentido: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG; anti-sentido: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; Sonda: Applied Biosystems, 185528556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). O nível de expressão relativa foi normalizada com desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) e calculada usando o método 2∧ (-Delta Delta CT). ensaios Taqman miRNA (Applied Biosystems) foram usadas para quantificar os níveis de maturidade miR-223 de expressão. O ARN total foi transcrito invertida por MultiScribe (Applied Biosystems) na mistura reaccional contendo o miR-específica haste-laçada iniciador inverso transcritivo. Todas as reacções foram realizadas em triplicado e os esboços de água foram incluídos como controlos negativos.

transferência de Western e imuno-histoquímica

A proteína foi extractada a partir de linhas celulares de cancro gástrico e tecidos primários emparelhados utilizando tampão de lise RIPA com proteinase inibidor. A concentração de proteína foi medida pelo método de Bradford (BOD-Rad) e 20 ug de proteína misturada com 2 × tampão de carga de SDS foi carregada por pista, separados por electroforese em gel de 12% SDS-poliacrilamida. STMN1 proteína foi detectada com um anticorpo policlonal anti-STMN1 (Cell Signaling,ŏ2, 1:1000). Outros anticorpos de Cell Signaling são comercialmente, PARP clivada (Asp214) (κ1, 1:1000), fosfo-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), fosfo-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) e fosfo-Stat3 (T705) (Β5, 1:2000).

a imuno-histoquímica foi realizada em 4 seções mm de espessura a partir de amostras fixadas em formalina e embebidos em parafina. Depois de-cera em xileno e etanol graduada, os cortes foram incubados em 3% H _{2 solução 2O durante 25 minutos para bloquear as atividades da peroxidase endógena e, posteriormente, foram submetidos a microondas em tampão citrato de recuperação antigênica. Os anticorpos primários (1:25 para STMN1 de Cell Signaling e 1:100 para p53 da Dako) foram incubadas a 4 ° C durante a noite e desenvolvimento cromogénio foi realizada utilizando o sistema EnVision (Dako). A expressão citoplasmática de STMN1 foi avaliada através da atribuição de uma pontuação proporção e uma pontuação de intensidade. A pontuação proporção foi de acordo com a proporção de células tumorais com coloração positiva citoplasmático (0, nenhum; 1, < = 10%; 2, 10 a < = 25%; 3, > 25 a 50%; 4, > 50%). A pontuação intensidade foi atribuído para a intensidade média de células positivas tumorais (0, nenhum; 1, fraco, 2, intermediário, 3, forte). A pontuação citoplasmática de STMN1 foi o produto de pontuação proporção e intensidade, variando de 0 a 12. A expressão citoplasmática foi categorizado em negativo (escore 0), 1+ (escore 1 a 3), 2+ (escore 4-6), e 3+ (pontuação 7-12). expressão da p53 nuclear em > 10% das células tumorais foi classificada como a sobre-expressão aberrante}

STMN1 ensaios funcionais

A transfecção de STMN1 siRNA e controle corrida (QIAGEN) foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (. Invitrogen). A proliferação celular foi avaliada utilizando CellTiter 96 celular não radioactivo Ensaio de Proliferação (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Para os ensaios de formação de colónias em culturas em monocamada, as células transfectadas com ARNsi STMN1 ou controlo precipitação foram cultivadas durante 10 dias. As células foram fixadas com etanol a 70% durante 15 minutos e coradas com violeta de cristal a 2%. As colónias com mais de 50 células por colónia foram contados. Os experimentos foram repetidos em triplicado.

A célula ensaios de invasão foram realizadas utilizando BD Biocoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences). As células transfectadas foram semeadas sobre o topo na câmara de meio de cultura contendo FBS a 1%, com meio completo (contendo FBS a 10%) adicionada à câmara inferior. Após 24 horas de incubação a 37 ° C, as células que invadiram o matrigel através da membrana foram fixadas com metanol a 100% durante 2 minutos e coradas com azul de toluidina a 1% por mais 2 minutos. Para análise estatística, as células no lado inferior da membrana foram contados a partir de 5 campos aleatórios (ampliação original x 400). Cada experiência foi efectuada em triplicado, e o valor médio foi expresso a partir de 2 expericias independentes.

A célula ensaios de migração foram efectuados utilizando Transwell Suportes permeáveis ​​(Corning, NY). As células foram colhidas a partir de placas de cultura de 24 horas após a transfecção, lavou-se três vezes com meio de cultura e ressuspensas. Em seguida, 300 ul da suspensão de células (5 × 10 ^{4 células) foram adicionados para os transwells, com 500 ul de meio de cultura contendo FBS a 10% na câmara inferior. Após 24 horas de incubação a 37 ° C, as células que pudessem migrar através da membrana microporosa foram fixadas com metanol a 100% durante 2 minutos e coradas com azul de toluidina a 1% por mais 2 minutos. Para a análise estatística, contamos o número de células anexado em 3 vista campos de cada câmara aleatoriamente e levou o número de células médio de cada campo.}

A citometria de fluxo análise para a paragem do ciclo celular

Para ciclo celular análise, AGS, MKN7 e SGC7901 células foram recolha no momento 24 horas após a transfecção em placas de 6 cm. Antes da transfecção, as células foram submetidos a jejum durante 12 horas para a sincronização. As células foram colhidas utilizando PBS frio e fixadas em etanol frio a 70% durante a noite em 4 ° C e tratou-se com 1 ng /ml de RNase A durante 10 minutos a 37 ° C. O ADN celular foi manchado com 15 ng /ml de iodeto de propídio (PI) durante 30 minutos a 37 ° C no escuro. As células foram então classificadas por FACS Calibur Citómetro de fluxo (Becton Dickinson, CA) e os perfis do ciclo celular foram determinados utilizando o software ModFitLT (Becton Dickinson, San Diego, CA). Os experimentos foram repetidos por duas vezes separados.

In vivo
tumorigenicidade estudo

SGC7901 células (2 x 10 ^{6cells suspensa em 0,1 ml PBS) transitoriamente transfectadas com siScramble e siSTMN1 foram injectados subcutaneamente no flanco dorsal de nove macho de 4 semanas de idade, ratinhos BALB nu /C (siSTMN1 no lado direito e as células de controlo negativo do lado esquerdo). Os xenoenxertos foram removidos e o diâmetro do tumor foi medido e documentado no final da semana 3. O volume do tumor (mm 3) foi estimada por medição do diâmetro maior e menor do tumor e calcular como se segue: volume = (diâmetro mais curto ) 2 × (maior diâmetro) × 0,5. O manejo dos animais e todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Chinesa de Hong Kong.}

ensaios de repórter de luciferase e miR-223 transfecção

O miR-223 sítio de ligação putativo na 3 'não traduzida (3'UTR) de STMN1 foi clonado no vector PMIR-REPORT (Ambion Inc.). Duas construções mutantes foram gerados por qualquer delecção ou mutações da sequência de semente complementar à região de ligação do miR-223, como descrito anteriormente [18]. A construção da luciferase do pirilampo foi co-transfectadas com Renilla luciferase de controle do vetor em MKN28 células na presença de tanto sintéticos miR-223 moléculas ou disputa o controle miRNA. Duais ensaios de repórter de luciferase (Promega) foram realizadas 36 horas após a transfecção. Lipofectamine 2000 foi utilizado para a transfecção de miR-223 em AGS e células MKN7.

A análise estatística

O teste t de Student foi utilizado para comparar a diferença de comportamento biológico entre as células STMN1 knockdown e corrida As células transfectadas com ARNsi, e entre o miR-223 transfectadas e precipitação miARN células transfectadas. Correlação entre a expressão STMN1 e os parâmetros clínico-patológicas foram avaliadas pelo teste rho classificação não paramétrico de Spearman. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar as taxas de sobrevivência para cada variável. As equivalências das curvas de sobrevida foram testadas por estatísticas de log-rank. Para essas variáveis ​​estatisticamente significativa encontrada na análise de sobrevida univariada ( p Art < 0,05), foi utilizado o modelo de riscos proporcionais de Cox com as estatísticas de razão de verossimilhança para avaliá-los ainda mais para análise de sobrevida multivariada. Toda a análise estatística foi realizada pelo software SPSS (versão 16.0; SPSS Inc). A bicaudal p
-valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo e o p
-valor menos de 0.001 foi considerado altamente significativo.

Informações de Apoio
Figura S1.
siSTMN1 inibe a migração celular no cancro gástrico. imagens representativas de células AGS e MKN7, que foram transfectadas com siSTMN1 e, em seguida, siScramble migrado através de uma membrana microporosa (**, P
< 0,001)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033919. S001
(TIF)
Figura S2.
O estudo funcional do miR-223 em linhas celulares de cancro gástrico. (A) Os ensaios de MTT proliferativas de AGS, MKN7 e SGC7901 após o miR-223 transfecção (4 dias após a transfecção). (B) Análise de Western blot de clivada-PARP em células AGS e MKN7 em 24 horas após a miR-223 transfecção. imagens de invasão (C) Representante Matrigel de AGS, MKN7 e SGC7901 são mostrados. miR-223 melhorou a capacidade de invasão de células de células de cancro gástrico (*, P
< 0,01; **, P
< 0,001). O número de células foi contado em 3 campos exibição aleatórios e as barras de erro representada desvios padrão
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033919.s002
(TIF)

• PLOS ONE: glioxalase-I é um fator Associated Novel Prognosis com câncer gástrico Progressão
• PLOS ONE: o significado prognóstico da apoptose-Related Marcadores Biológicos em chinês gástricas pacientes com câncer