PLoS ONE: Stathmin1 Пьесы Онкогенный Роль и является целью микроРНК-223 в желудочном Cancer

Абстрактный
<р> Stathmin1 (STMN1) является кандидатом онкобелок и прогноз маркер нескольких видов рака. Это исследование было направлено на анализ его экспрессии и биологические функции при раке желудка. Выражение STMN1 оценивали с помощью QRT-PCR, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. Биологическая функция STMN1 определяли с помощью анализов МТТ пролиферации, образования монослоя колоний и инвазии клеток анализа с использованием небольшой метод РНК-интерференции в желудочном линиях раковых клеток. Мы также исследовали регуляции экспрессии STMN1 с помощью микроРНК-223. STMN1 был повышающей регуляции в желудочном линиях раковых клеток и первичных желудка аденокарциномы. STMN1-позитивные опухоли были более вероятно, будут найдены в возрастной группе и связан с p53 ядерной экспрессии. В диффузного типа желудочной аденокарциномы, экспрессия STMN1 коррелировала с возрастом ( р
= 0,043), T этап ( р
= 0,004) и метастазов в лимфатических узлах ( р
= 0,046). Выражение STMN1 в диффузный типа аденокарциномы желудка была связана с плохим заболеванием специфической выживаемости путем однофакторного анализа ( р
= 0,01). STMN1 нокдаун в клеточных линиях AGS и MKN7 подавлено пролиферации ( р
&л; 0,001), снижение образования монослоя колонии ( р
&л; 0,001), инвазия тормозится и миграции клеток способность ( р
&л; 0,001) и индуцированные фазы G1 арест. siSTMN1 также может подавлять рост клеток В естественных условиях
( р
&л;. 0 01). Мы, наконец, подтвердили, что STMN1 является предполагаемый нижестоящей мишенью MIR-223 при раке желудка. Наши выводы поддержали онкогенного роль STMN1 при раке желудка. STMN1 может служить в качестве прогностического маркера и потенциальной терапевтической мишени для рака желудка
<р> Образец цитирования:. Кан W, Тонг JHM, Чан AWH, легких РВМ, Чау SL, Вонг QWL и др. (2012) Stathmin1 Пьесы Онкогенный Роль и является целью микроРНК-223 в рака желудка. PLoS ONE 7 (3): e33919. DOI: 10.1371 /journal.pone.0033919
<р> Редактор: Ваэль Эль-Рифаи, Университет Вандербильта медицинский центр, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 17 октября 2011 г.; Принято: 19 февраля 2012 года; Опубликовано: 28 марта, 2012
<р> Copyright: © 2012 Кан и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование поддерживается UGC фондом сотрудничал Research (CUHK04 /CRF /08) и веб-сайт финансирующей является http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований, а второй наиболее частой причиной связанной с раком смерти во всем мире. Он имеет самый высокий уровень в Китае, Японии, Корее и Восточной Азии. Общий прогноз неблагоприятный с выживаемости 5 лет ниже 30% в большинстве стран [1]. Некоторые потенциальные факторы риска включают высоким содержанием соли диета, курение, низкое потребление фруктов и овощей, хронический гастрит с glandularatrophy и кишечной метаплазией, и хеликобактер пилори (H.)
инфекции. Клинический результат H. Pylori
инфекции было показано, что под влиянием различных генетических факторов, в частности, H. пилори
-virulence связанные гены, такие как CAG
A, ВПТ
A, лед
А и баб
A [2]. H. пилори
инфекция также известно, индуцируют экспрессию провоспалительного фермента циклооксигеназы (ЦОГ-2), который показывает повышающей регуляции экспрессии при раке [3] желудка. Предыдущие исследования подтвердили важность генетических и эпигенетических изменений онкогенов, генов-супрессоров опухолей и генов репарации ошибочно спаренных в развитии рака желудка. Протокадгерина 10 [4], смерть-ассоциированный белок киназу [5], секретируемый прожарен-белок, связанный с [6] и пролиферации пероксисом активированный гамма-рецептор [7] было показано, что уменьшили экспрессию и функцию опухолевого супрессора в желудочном канцерогенезе. С другой стороны, ретиноевая кислота Регулируют ядерный матрикс-ассоциированный белок [8] и да-ассоциированный белок 1 [9] оба были повышающей регуляции и оказывают онкогенного функцию в развитии опухоли.
<Р> Stathmin1 (STMN1), также известный а онкобелок 18, является важным цитозольная микротрубочки дестабилизирует белок, который играет критическую роль в процессе митоза путем регуляции динамики микротрубочек, а также ряд других биологических процессов [10]. Высокий уровень экспрессии STMN1 ассоциируется с плохим прогнозом при различных злокачественных опухолей, включая рак молочной железы [11], [12], рак предстательной железы [13], злокачественные мезотелиомы [14], рак шейки матки [15], а также пищевода плоскоклеточный рак [16] , В 2010 году Чон и др. впервые сообщил, что STMN1 избыточная экспрессия положительно коррелирует с метастазов в лимфатических узлах и продвинутой постановке и сосудистой инвазии и отрицательно с безрецидивной выживаемости в диффузный типа карциномы желудка [17]. Та же группа продемонстрировала онкогенного роль STMN1 при раке желудка с помощью в пробирке
ингибирования пролиферации, миграции и инвазии в желудочном клеточных линиях, нокаутировав STMN1 вниз с помощью миРНК, и В естественных условиях
ингибирование рост опухоли ксенотрансплантатов у голых мышей с помощью миРНК трансфекции.
<р> Регуляция экспрессии STMN1 от MIR-223 было продемонстрировано в гепатоцеллюлярной карциномы на нашем предыдущем исследовании [18]. Микро-РНК представляют собой класс одноцепочечных молекул РНК 21-23 пар оснований в длину и регулируют экспрессию генов-мишеней с помощью специфических взаимодействий спаривания оснований между микроРНК и нетранслируемые области целевых мРНК [19]. МикроРНК будет функционировать в качестве онкогенов или супрессоров опухолей в злокачественных опухолях человека и потенциально использованы в качестве новых диагностических и прогностических биомаркеров и терапевтических целей. При раке желудка, несколько микроРНК, включая микроРНК-143 и -145 [20], микроРНК-141 [21], микроРНК-31 [22] и микроРНК-106а [23] являются подавлена, в то время как некоторые oncogenetic микроРНК, такие как MIR-21 и микроРНК-27а [24] усиливает свою активность.
<р> Это исследование направлено на изучение функциональной роли STMN1 в развитии рака желудка и механизмы регуляции STMN1 при раке желудка.

Результаты

повышающая регуляция STMN1 в желудочном линиях раковых клеток и первичных образцов желудочного рака
<р> экспрессия мРНК STMN1 была выше во всех 9 желудочных линий раковых клеток, чем нормальная желудочной ткани, как показано на рис. 1A. Вестерн-блот анализ подтвердил повышающую регуляцию белка STMN1 в 11 желудочных линий раковых клеток (рис. 1В). Повышающей регуляции экспрессии белка STMN1 наблюдалось у 4 из 5 первичных желудка аденокарциномы по сравнению с соответствующим неопухолевой слизистой оболочки желудка (рис. 1в). QRT-ПЦР проводили для исследования уровня экспрессии мРНК STMN1. При первичной аденокарциномы желудка, 28 из 50 случаев (56%) показали более чем в 1,5 раза повышающей регуляции экспрессии мРНК STMN1 в опухолевой ткани по сравнению с соответствующим неопухолевой слизистой оболочки. Средний уровень экспрессии мРНК STMN1 была значительно выше в образцах опухолей, чем в нераковых коллегами ( р
= 0,040, рис. 1D).

выражение STMN1 коррелирует с плохим прогнозом в диффузный тип
рак желудка <р> Immunohistochemistry проводили для оценки экспрессии белка STMN1 в 111 первичных образцов желудочного аденокарциномы. Экспрессии белка STMN1 в основном локализованы в цитоплазме опухолевых клеток (фиг. 2А). Положительная иммунореактивность наблюдали в 96-желудочных аденокарцином (86,5%). Среди этих STMN1-позитивных опухолей, 40 показали сильный (3+), 37 показал, промежуточное соединение (2+) и 19 показали слабую (1+) STMN1 окрашивание. Предыдущее исследование показало, что экспрессия STMN1 отрицательно регулируется гена супрессора опухоли TP53 [25]. Поэтому мы оценивали экспрессию белка р53 с помощью иммуногистохимии и исследовали ее корреляцию с уровнем экспрессии STMN1. Аномальная экспрессия ядерного p53 был обнаружен в 51 (45,9%) из желудка аденокарциномы и чаще в STMN1-положительной опухоли (50,0%), чем STMN1-отрицательной опухоли (20,0%) ( р
= 0,03). В клиникопатологическими характеристики 111 пациентов с аденокарциномой желудка и ассоциации с выражением STMN1 приведены в таблице 1. STMN1-позитивные опухоли были более вероятно, будут найдены в возрастной группе ( р
= 0,07) и связан с p53 ядерное выражение ( р
= 0,03), анализ показал, что одномерный старость ( р
&л; 0,036), гистологии с диффузной составляющей ( р
= 0,012), этап ( р
&л; 0,0001), Т стадия ( р
= 0,012), N стадия ( р
&л; 0,0001), M этап ( р
&л; 0,0001) и наличие метастазов в лимфатических узлах ( р
&л; 0,0001) коррелирует с плохим выживаемости без признаков заболевания специфичны. Многофакторный Кокса регрессионного анализа, только возраст ( р
&л; 0,0001) и стадия ( р
&л; 0,0001) были независимо связаны с выживаемостью конкретного заболевания (таблица 2). В диффузного типа аденокарциномы желудка, экспрессия STMN1 была связана с возрастом ( р
= 0,043), T этап ( р
= 0,004) и наличие метастазов в лимфатических узлах ( р
= 0,046). Выражение STMN1 в диффузный типа аденокарциномы желудка была связана с ухудшением выживаемости без признаков заболевания конкретным путем однофакторного анализа ( р
= 0,01, рис. 2В).

Сайленсинг STMN1 ингибирует агрессивный фенотип в пробирке

<р> Частое повышающая регуляция мРНК STMN1 и белка в опухолях желудка предложил потенциальную онкогенного роль этого гена. Нокдаун STMN1 малыми РНК-интерференция (миРНК) заметно снижена мРНК и уровень белка (фиг.3А.) И значительно уменьшенный пролиферации клеток в AGS и MKN7 клеток, что показано с помощью МТТ-анализа ( р
&л; 0,001, рис. 3B). STMN1 киРНК-опосредованного подавляющий рост эффект был далее подтвержден анкерного-зависимого анализа образования монослоя колонии. Значительное сокращение численности колоний наблюдали в клетках, трансфицированных STMN1 миРНК, по сравнению с контрольной группой скремблирования в монослойной культуре (снижена до 49,2% и 68,4% в контрольной группе скремблирования в AGS и MKN7 соответственно; <ЕМ> р
≪ 0,001, . фиг.3С)
<р> в анализах подвижности клеток, значительное снижение инвазивного фенотипа через Матригель покрытием Бойденом камеры ( р
&л;.. 0.001, рис 3D) была продемонстрирована в STMN1 миРНК-трансфицировали AGS и MKN7 клетки (снижение до 51,6% и 46,8% в контрольной группе скремблирования в AGS и MKN7 соответственно). В клеточной миграции анализов с использованием Transwell проницаемых штативы, значительное уменьшение количества клеток, мигрирующих через микропористую мембрану ( р
&л; 0,001, рис S1) был обнаружен в STMN1 миРНК трансфицировали AGS и MKN7 клетки (сводится к 65,9% и 42,7% в контрольной группе скремблирования в AGS и MKN7, соответственно), что свидетельствует siSTMN1 может препятствовать миграции способность клеток рака желудка
. <р> Так как эффект тормозящее рост наблюдался в siSTMN1 трансфицированных клетках, мы проанализировали трансфектантов для параметров клеточного цикла с использованием проточной цитометрии. Через двадцать четыре часа после трансфекции, наблюдали накопление G1 клеток в siSTMN1 трансфектантов по сравнению с контрольной группой скремблирования миРНК (рис. 4А). Клетки в G1 фазе были увеличены с 47,5% до 53,7% в AGS, 38,0% до 43,4% в MKN7, и 30,1% до 40,1% в SGC7901 клетках. И это сопровождалось уменьшением фазовых клеток S. В соответствии с остановки клеточного цикла, найденного в проточной цитометрии анализа, мы наблюдали значительное снижение фосфо-Rb (S807 /811) в siSTMN1 трансфектантов (рис. 4, б). Кроме того, siSTMN1 может вызвать апоптоз в конце четырех желудочных линий раковых клеток тестируемых, AGS, MKN1, BGC823 и SGC7901, которая была представлена ​​увеличением расщепленной-PARP (рис. 4б). Тем не менее, никаких существенных различий не было обнаружено в уровне р-AKT (S473) и п-Stat3 (T705) между siSTMN1 и отрицательного контроля трансфицированных.

siSTMN1 тормозит рост опухоли желудка В естественных условиях

<р> для дальнейшего изучения влияния STMN1 на в росте опухоли желудка естественных
, siSTMN1 и скремблирования трансфицируются клетки рака желудка подкожно вводили в правый и левый фланг спинного голых мышей соответственно. Так как AGS и MKN7 клетки не образуют ксенотрансплантаты в голых мышей, мы использовали SGC7901 клетки для В естественных условиях
исследования. siSTMN1-трансфектант образуются мелкие опухоли на правом фланге спинной чем в контрольной группе скремблирования на левом фланге спинного 3 недели после инъекции ( р
&л;. 0.01, рис 4C).

STMN1 является ниже по течению мишень MIR-223 в желудочном
рака <р> Как и предсказывали TargetScan, потенциальный сайт связывания микроРНК-223 был найден в STMN1 3'UTR (позиция 12-18 из STMN1 3'UTR). Выражение MIR-223 была подавлена ​​в 9 желудочных линиях раковых клеток по сравнению с нормальным эпителием желудка ткани (рис. 5А). Выражение MIR-223 отрицательно коррелировала с выражением STMN1 белка ( р
= 0,05). Кроме того, мы оценивали экспрессию белка STMN1 с помощью иммуногистохимии и уровень MIR-223 по QRT-ПЦР в 31 образцов желудочного первичного рака. Опухоли с более высоким STMN1 иммунореактивности (оценка 2+ и 3+) показал недостоверное тенденцию к более низкой микроРНК-223 уровня экспрессии ( р
= 0,137, рис. 5B).
<Р> К демонстрируют потенциальную подавляющий эффект MIR-223 на экспрессию STMN1, мы трансфецировали MIR-223 к действию желудочного линий раковых клеток AGS и MKN7. MIR-223 подавлено мРНК STMN1 и экспрессию белка в обеих клеточных линиях ( р
&л; 0,001, рис 5C.). Добавление микроРНК-223 блокатор спас экспрессию белка STMN1 в MKN7 клетках, предполагая, подавляющий эффект был специфически индуцируется MIR-223 (рис. 5D). Два репортера люциферазы анализы были проведены для изучения взаимодействия между микроРНК-223 и STMN1 3'UTR (рис. 5E). Репортер конструкции, содержащие предсказанных или мутированные сайты связывания котрансфицируют с микроРНК-223 имитируют до MKN28 клеток, желудочный линии раковых клеток с относительно низким уровнем экспрессии эндогенного STMN1. MIR-223 оказывали сильное угнетающее действие на STMN1 3'UTR (49,7%, р
&л; 0,001). Ингибирующий эффект был устранен, когда запальной зоне был удален (мутант 1), или облегчены при 4 нуклеотида по запальной зоне мутировали. (67,6%, <ЕМ> р
≪ 0,001, Мутант 2)

Обсуждение
<р> В этом исследовании мы показали повышающей регуляции экспрессии STMN1 как в мРНК и уровня белка в желудочном аденокарциномы по сравнению с нормальным эпителием желудка. Результат позволяет предположить, что STMN1 могут иметь онкогенного функцию в желудочном онкогенеза. STMN1 было сообщено быть прогностическим биомаркером в нескольких видов рака, включая колоректальный рак [26], пищевода плоскоклеточного рака [16], гепатоцеллюлярной карциномы [27], [28], [29], [30] и оральный рак плоскоклеточный клеток [31]. Мы показали, что выражение STMN1 связанное со старой возрастной группы, продвинутой стадии Т, наличие метастазов в лимфатических узлах, а также более коротким конкретному заболеванию время выживания в диффузный типа аденокарциномы желудка. В соответствии с этим выводом, Джеон и др. Сообщается, что STMN1 мог предсказать плохой прогноз в диффузного типа рака желудка и коррелируют с сосудистой инвазии [17].
<р> STMN1 регулирует динамику микротрубочек путем содействия деполимеризации микротрубочек и предотвращения полимеризации тубулина гетеродимеров. Подавление экспрессии STMN1 приводит к накоплению клеток в G2 /M фазах и связано с серьезными отклонениями веретена и трудности в выходе из митоза [10]. STMN1 также опосредует эффекты p27 (Kip1) на подвижность клеток [32]. В клетках саркомы [33] и немелкоклеточного рака легкого [34], STMN1 стимулируется подвижность клеток и через внеклеточный матрикс в пробирке
и увеличение метастатического потенциала В естественных условиях
. В плохо дифференцированной желудка линий раковых клеток SNU638 и SNU16, миРНК-индуцированной STMN1 репрессии могут подавлять пролиферацию клеток в пробирке
и В естественных условиях
[17]. В этом исследовании мы показали, что миРНК нокдаун STMN1 ингибирует пролиферацию клеток и образование колоний креплении-зависимой, нарушенную способность вторжения и миграцию, индуцированную G1 арест и поздний апоптоз в желудочном линиях раковых клеток. Кроме того, мы показали, что siSTMN1 тормозится в естественных условиях
рост рака желудка клеточной линии SGC7901. Функциональное ингибирование STMN1 легко уменьшилось пролиферацию клеток и инвазивный фенотип, что свидетельствует о protumorigenic роль STMN1 при раке желудка.
<Р> MIR-223 представляет собой эволюционно консервативны микроРНК, который был первоначально сообщалось в Гранулопоэз и миелоидной дифференцировки [35]. Выражение микроРНК-233 может быть вызвано миелоидных факторов транскрипции, PU.1 и C /EBPs [36]. Он может регулировать несколько генов-мишеней, таких как MEF2C [37], в transcriptive фактора, который способствует миелоидной пролиферации клеток-предшественников. Он также играет существенную роль в процессе дифференцировки остеокластов [38], и может быть подан в качестве потенциального биомаркера для рецидива рака яичников [39] и сепсиса [40]. Ранее мы сообщали, что STMN1 является предполагаемый нижестоящей мишенью микроРНК-223 в гепатоцеллюлярной карциномы [18]. В данном исследовании мы наблюдали низкий микроРНК-223 уровень экспрессии в желудочном линий раковых клеток и обратная связь между микроРНК-223 и экспрессии белка STMN1. По люциферазы анализов, мы подтвердили специфическое взаимодействие между микроРНК-223 и STMN1 3'UTR в раковых клетках желудка. Отрицательный эффект модуляции с помощью микроРНК-223 дополнительно подтверждается значительным снижением уровня белка STMN1 в желудочном линиях клеток рака после микроРНК-223 повторного выражения. Результаты поддержали, что STMN1 является предполагаемым объектом микроРНК-223 в клетках рака желудка. Интересно, что избыточная экспрессия микроРНК-223 не изменяет клеточную пролиферацию и апоптоз (рис S2A &Amp; 2B), но значительно индуцированное подвижность клеток в клетках рака желудка (рис S2C). В соответствии с этим выводом, недавнее исследование показало, что микроРНК-223 способствует подвижности клеток через пост-транскрипционной понижающей опухоли супрессор EPB41L3 в раковых клетках желудка [41]. В то время как один микроРНК может ориентировать на несколько генов, несколько микроРНК может регулировать один ген. Точная молекулярная механистической идентификация как данная микроРНК способствует фенотипических изменений остается неуловимым.
<Р> инактивация гена супрессора опухоли TP53 является наиболее распространенным и наиболее часто изучали молекулярные события в раковых заболеваний человека. Сообщалось, что p53 опосредованный подавление активности промотора STMN1, что приводит к негативной регуляции экспрессии STMN1 и G2 /M арест клеточного цикла [25], [42]. Было принято считать, что дикий тип белка р53 не обнаруживается с помощью иммуногистохимии, поскольку она нестабильна и имеет относительно короткий период полураспада. Мутантного белка р53 накапливается в ядре является относительно стабильным и имеет более длительный период полураспада, что делает его обнаружить с помощью иммуногистохимии. Таким образом, сильное и диффузное иммунореактивности, как правило, указывает на мутантного р53 [43]. Мы оценили статус p53 в аденокарциномы желудка с помощью иммуногистохимии и обнаружили, что отклоняющееся иммунореактивности р53, связанный с более высокой экспрессии STMN1. Поэтому вероятно, что избыточная экспрессия STMN1 может отчасти из-за инактивации гена супрессора опухоли р53 в рака желудка.
<Р> В заключение, мы продемонстрировали повышающей регуляции STMN1 в аденокарциномы желудка и выражение коррелировала с бедными выживаемость без признаков заболевания специфический при раке желудка диффузного типа. Онкогенная свойство STMN1 в желудочном онкогенеза было подтверждено функциональных исследований. Кроме того, мы показали, что экспрессия STMN1 отрицательно регулируется микроРНК-223 в клетках рака желудка. Наш вывод предположил, что STMN1 может служить в качестве прогностического маркера и потенциальной терапевтической мишени для диффузного типа аденокарциномы желудка.

Материалы и методы

Линия клеток и клеточных культур
<р> Одиннадцать желудка клеточные линии рака, MKN28, КАТО-III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901 были получены либо из Американской коллекции типовых культур (Роквилл, штат Мэриленд, США), RIKEN Cell Bank (Цукуба, Япония) или в качестве подарка от института заболевания пищеварительных (IDD) принца Уэльского больницы. Эти клеточные линии, выращивают в среде RPMI 1640 (GIBCO), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, ЕС GIBCO), 100 ед /мл пенициллина и 10 мкг /мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <югу> 2 при 37 ° C.

Клинические образцы аденокарциномы желудка
<р> в общей сложности 111 образцов желудочного аденокарциномы были получены из банка тканей анатомических и клеточной патологии, госпиталь принца Уэльского, Шатин, Гонконг. Еще 5 пар первичных опухолей и прилегающих к ним неопухолевых тканей во время операции у пациентов без каких-либо неоадъювантной терапии были собраны. Образцы были немедленно заморожены в температуре -80 ° С для последующего молекулярного анализа. Биоптаты из 50 пар рака желудка и соответствующего нераковая слизистой оболочки были любезно предоставлены йодной принца Уэльского больницы. Исследование одобрено Совместным Китайского университета в Гонконге новых территорий Восточной кластера Клинические исследования Комитета по этике, Гонконге (CREC Ref. No. 2009.521) и все участники дали письменное информированное согласие на сбор образцов и последующего анализа.

Выделение РНК, QRT-PCR и микроРНК QRT-PCR
<р> Общая Выделение РНК проводили с использованием тризола реагента (Invitrogen) в соответствии с инструкцией изготовителя. Концентрация РНК измеряли NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Высокой емкости кДНК с обратной транскрипцией комплекты (Applied Biosystems), были использованы для синтеза кДНК. Для количественного RT-PCR (QRT-PCR), Taqman Универсальный PCR Master Mix (Applied Biosystems) был применен для STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG антисмысловой: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; Зонд: Applied Biosystems, 185528556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). Уровень относительной экспрессии нормализовали с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и рассчитывается с использованием метода 2∧ (Гамма-Дельта Дельта Ct). Taqman микроРНК анализы (Applied Biosystems) были использованы для количественного определения уровней экспрессии зрелого микроРНК-223. Общую РНК была обратной транскрипции с помощью MultiScribe (Applied Biosystems) в реакционной смеси, содержащей микроРНК-специфический стволовой петли обратного transcriptive праймера. Все реакции проводили в трех повторностях и воды заготовки были включены в качестве отрицательного контроля.

вестерн-блоттинга и иммуногистохимии
<р> Белки экстрагировали из желудка линий раковых клеток и парными первичных тканей с использованием RIPa буфера для лизиса с протеиназы ингибитор. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (БПК-Rad) и 20 мкг белка, смешанного с 2 × SDS буфера для загрузки был загружен на полосу, разделенных на 12% электрофореза в SDS-полиакриламидном геле. STMN1 белок был обнаружен с помощью поликлональных анти-STMN1 антителом (Cell Signaling,ŏ2, 1:1000). Другие антитела от Cell Signaling коммерчески, расщепляется PARP (Asp214) (κ1, 1:1000), фосфо-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), фосфо-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) и фосфорно-Stat3 (T705) (Β5, 1:2000).
<р> Immunohistochemistry проводили в мкм срезы толщиной 4 из фиксированных формалином и залитых парафином образцов. После того, как де депиляции в ксилоле и градационной этанол, срезы инкубировали в 3% Н <суб> 2O <суб> 2 раствор в течение 25 минут, чтобы блокировать эндогенные действия пероксидазы и впоследствии подвергались микропомахивание в цитратном буфере для извлечения антигена. Первичные антитела (1:25 для STMN1 от Cell Signaling и 1:100 для р53 из DAKO), инкубировали при 4 ° С в течение ночи и развитие хромоген проводили с помощью системы Envision (DAKO). Цитоплазматической экспрессии STMN1 оценивали путем присвоения баллов пропорции и оценка интенсивности. Счет пропорция была в соответствии доля опухолевых клеток с положительным окрашивание цитоплазмы (0, нет; 1, &ЛТ; = 10%; 2, 10 до &лт; = 25%; 3, > от 25 до 50%; 4, > 50%). Счет интенсивности был назначен для средней интенсивности положительных опухолевых клеток (0, не имеет; 1, слабый; 2, промежуточный продукт; 3, сильные). Цитоплазмическая оценка STMN1 был продуктом пропорции и интенсивности баллов, в диапазоне от 0 до 12. цитоплазматической экспрессии подразделяются на отрицательный (0 баллов), 1+ (оценка от 1 до 3), 2+ (оценка 4-6), и 3+ (оценка 7-12). Выражение Ядерный р53 в &ГТ; 10% опухолевых клеток оценивали как аномальным оверэкспрессии

STMN1 функциональные тесты
<р> Трансфекция STMN1 миРНК и контроля скремблирования (QIAGEN) проводили с использованием Липофектамин 2000 Реагент для трансфекции (. Invitrogen). пролиферации клеток оценивали с использованием CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Анализ пролиферации (Promega) в соответствии с инструкцией изготовителя. Для анализов образования колоний в монослойных культурах, клетки, трансфицированные STMN1 миРНК или контролем скремблирования культивировали в течение 10 дней. Клетки фиксировали 70% -ным этанолом в течение 15 минут и окрашивали 2% кристаллическим фиолетовым. Колонии были подсчитаны с более чем 50 клеток на колонию. Эксперименты были повторены в трех экземплярах.
<Р> инвазии клеток анализы были проведены с использованием BD Biocoat Matrigel Invasion Чемберс (BD Biosciences). Трансфицированные клетки высевали на верхней камере в культуральной среде, содержащей 1% FBS, с полной среде (содержащей 10% FBS) добавляли в нижнюю камеру. Через 24 часа инкубации при 37 ° С, клетки, захватившие через Матригель мембраны, фиксировали 100% метанолом в течение 2 минут и окрашивали 1% толуидиновым синим в течение еще 2-х минут. Для анализа статистики, клетки на нижней стороне мембраны были подсчитаны от 5 случайных микроскопических полей (исходное увеличение × 400). Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах, и выражали среднее значение от 2-х независимых экспериментов.
<Р> Миграция клеток анализы проводили с использованием Transwell проницаемой для опоры (Корнинг, штат Нью-Йорк). Клетки собирали из чашек для культивирования через 24 часа после трансфекции, трижды промывали культуральной средой и ресуспендировали. Затем 300 мкл суспензии клеток (5 × 10 ^{4 клеток) добавляли в transwells, с 500 мкл культуральной среды, содержащей 10% FBS, в нижней камере. Через 24 часа инкубации при 37 ° С, клетки, которые могут мигрировать через микропористую мембрану фиксировали 100% метанолом в течение 2 минут и окрашивали 1% толуидиновым синим в течение еще 2-х минут. Для анализа статистики, мы насчитали прилагаемую номер ячейки в 3-х полей зрения каждой камеры в случайном порядке и взял среднее число клеток каждого поля.}

Анализ проточной цитометрией на арест клеточного цикла
<р> Для клеточного цикла анализ, АГС, MKN7 и SGC7901 клетки собирали в то время, через 24 часа после трансфекции в 6 см пластинах. Перед трансфекцией клетки подвергались голоданию в течение 12 часов для синхронизации. Клетки собирали с использованием холодного PBS и фиксировали в 70% этаноле в течение холодной ночи в 4 ° С и обрабатывают 1 нг /мл РНКазы А в течение 10 мин при 37 ° С. Клеточная ДНК окрашивали 15 нг /мл пропидий йодида (PI) в течение 30 минут при 37 ° C в темноте. Клетки затем сортировали с помощью FACS Calibur проточном цитометре (Becton Dickinson, CA) и профили клеточного цикла определяли с использованием программного обеспечения ModFitLT (Becton Dickinson, San Diego, CA). Эти эксперименты были повторены в течение двух отдельных раза.

В естественных условиях
туморогенность исследование
<р> SGC7901 клеток (2 × 10 6cells суспендировали в 0,1 мл PBS) трансфицированы с siScramble и siSTMN1 вводили подкожно в дорсальную фланг девять 4-недельного возраста мужского пола BALB /C голых мышей (siSTMN1 на правой стороне и клетки отрицательного контроля на левой стороне). Ксенотрансплантаты были вынуты и диаметр опухоли измеряли и задокументированы в конце недели 3. Объем опухоли (мм 3) оценивали путем измерения самый длинный и самый короткий диаметр опухоли и вычисляют следующим образом: объем = (короткий диаметр ) 2 × (длинный диаметр) × 0,5. Обработка животных и все экспериментальные процедуры были одобрены комитетом по этике Животных Китайского университета Гонконга по.

люциферазы репортер анализы и микроРНК-223 трансфекция
<р> Предположительный микроРНК-223 на сайт связывания 3 'нетранслируемой области (3'UTR) из STMN1 был клонирован в pMIR-REPORT вектора (Амбион Inc.). Два мутантные конструкции были сгенерированы либо делеции или мутации комплементарной последовательности семян к связывающей области микроРНК-223, как описано ранее [18]. Светлячка конструкция люциферазы котрансфицируют с управлением вектором люциферазы Renilla в MKN28 клетках в присутствии либо синтетических микроРНК-223 молекул или скремблирования управления микроРНК. Двойные люциферазы анализы (Promega) проводили через 36 часов после трансфекции. Липофектамин 2000 был использован для трансфекции MIR-223 в AGS и клеток MKN7.

Статистический анализ
<р> Тест Стьюдента был использован для сравнения различий в биологическом поведении между STMN1 нокдаун клеток и карабкаются миРНК-трансфицировали клетки, а также между микроРНК-223-трансфицировали и скремблирования микроРНК трансфецированных клеток. Корреляция между экспрессией STMN1 и клиникопатологическими параметров оценивали с помощью Rho ранга теста непараметрического Спирмена. Метод Каплана-Мейера использовали для оценки коэффициента выживаемости для каждой переменной. Эквиваленции кривых выживаемости были протестированы статистики журнала ранга. Для тех переменных, статистически значимые найти в анализе однофакторном выживаемости ( р
&л; 0,05), то Кокса модель со статистикой отношения правдоподобия использовали для дальнейшей оценки их для многомерного анализа выживаемости. Весь статистический анализ был проведен с помощью программного обеспечения SPSS (версия 16.0; SPSS Inc). Два хвостами р
-value менее 0,05 считалось статистически значимым и р
-value менее 0,001 считалось весьма значительным.

Поддержка информации <бр> Рисунок S1.
siSTMN1 ингибирует миграцию клеток при раке желудка. Типичные картины AGS и MKN7 клеток, которые были трансфецированных siSTMN1 и siScramble затем мигрировали через микропористую мембрану (**, <ЕМ> р
≪ 0,001)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0033919. S001
(TIF)
Рисунок S2.
Функциональное исследование микроРНК-223 в желудочном линиях раковых клеток. (A) MTT пролиферативные анализы AGS, MKN7 и SGC7901 после микроРНК-223 трансфекции (4 дня после трансфекции). (Б) Вестерн-блот-анализ расщепленного-PARP в AGS и MKN7 клеток на 24 часов после того, как микроРНК-223 трансфекции. (C) Представитель Матригель вторжения изображений AGS, MKN7 и SGC7901 показаны. микроРНК-223 усиливает вторжение клеток способность клеток рака желудка (*, р
&л; 0,01; **, р
&л; 0,001). Подсчитывали число клеток в 3-х случайных полей зрения и планки погрешностей представлены стандартные отклонения
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0033919.s002
(TIF)

• PLoS ONE: Glyoxalase-I является новым Прогноз фактор, связанный с раком желудка Progression
• PLoS ONE: прогностическое значение связанных с апоптозом биологических маркеров в китайских больных раком желуд…