PLoS ONE: Prostorni raspored LGR5 + stanica u korelaciji s rakom želuca Progression

Sažetak pregled

U ovom istraživanju smo testirali prevalenciju, histoanatomical distribuciju i tumora biološki značaj Wnt ciljnog proteina i markera raka matičnih stanica LGR5 u tumori ljudske gastrointestinalnog trakta. Diferencijalna ekspresija LGR5 je studirao na transkripcijske (real-time lančana reakcija polimeraze) i razine translacijska (imunohistokemijski) u zloćudnim i odgovarajuće ne-malignih tkiva 127 pacijenata koji sadrži šest različitih primarnih tumora mjesta, odnosno jednjaka, želuca, jetre, gušterače, debelog crijeva i rektuma. Kliničko patološki značaj LGR5 ekspresije istraživana je u 100 bolesnika s želučanim karcinoma (GC). Non-tumora, najčešće gajio samo vrlo malo razbacane LGR5 ^{+ stanica. Odgovarajući karcinomi jednjaka, želuca, jetre, gušterače, debelog crijeva i rektuma su pokazali znatno više LGR5 + stanica, kao i značajno višu razinu LGR5-mRNA u usporedbi s odgovarajućim ne-neoplastičnim tkivom. Dupli eksperimenti bojanja otkrila koekspresiji LGR5 s pretpostavljenim matičnih stanica biljega CD44, Musashi-1 i ADAM17. Zatim smo testirali hipotezu da su sekvencijalni promjene želučane karcinogeneze, tj kronični atrofični gastritis, crijevne metaplazije i invazivni karcinom, povezane su s preraspodjelom na LGR5 + stanica. Zanimljivo je da je prostorna raspodjela LGR5 promijenilo: ne-neoplastičnim sluznicu želuca, LGR5 + stanice se nalaze uglavnom u vratu regiji sluznice; u intestinalne metaplazije LGR5 + stanice su lokalizirani na kripte bazi, te u GC LGR5 + stanica su bili prisutni na površine lumena, središte tumora i invazijom naprijed. Izraz LGR5 u tumora središnjeg i invazijom pred GC značajno korelira s porastom lokalnim tumora (T-skupinu) i čvora širenja (N-kategorija). Nadalje, bolesnici s LGR5 + GCS imali kraći medijan preživljenja (28,0 ± 8,6 mjeseci) od pacijenata sa LGR5 - GCS (54,5 ± 6,3 mjeseci). Naši rezultati pokazuju da LGR5 različito izražena kod gastrointestinalnih karcinoma i da je prostorna histoanatomical distribucija LGR5 + stanica mora se uzeti u obzir kada se traži njihov tumor biološki značaj pregled}

Izvor:. Simon E Petke D, Boger C Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) Prostorni raspored LGR5 ^{+ stanica u korelaciji s rakom želuca progresiju. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10,1371 /journal.pone.0035486 pregled}

Urednik: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 5. srpnja 2011; Prihvaćeno: 16. ožujak 2012; Objavljeno: 18. travanj 2012 pregled

Copyright: © 2012 Simon et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovi autori nemaju podršku ili sredstva za prijaviti pregled

suprotstavljenih interesa.. autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Probavni karcinomi su među najčešćim zloćudnih bolesti i vodeći uzrok smrti od raka u svijetu [1], [2]. Razlozi za siromašne prognoze su složeni: mnoge vrste raka probavnog trakta dijagnosticira u naprednim fazama bez kurativno tretiranje, ne postoje pouzdani tumorski markeri koji mogu omogućiti rano otkrivanje ili probir populacije s visokim rizikom. Mogućnosti liječenja su ograničene na lokalno uznapredovalim i metastatske bolesti, a značajan broj tumora ponavljati unatoč početnoj terapijskom odgovoru. [3] Potencijalnog objašnjenje neučinkovite terapije je prisutnost raka matičnih stanica (CSC). CSC hipoteza postulira da tumor je konglomerat staničnih populacija heterogenih. Samo subpopulacija ovog konglomerata održava sposobnost formiranja kolonija, a time recidiva i metastaziranju. Eksplozivnim dizanjem utega su otporna na kemoterapiju, što dovodi do tumorski recidiva, napredovanju i smrt pacijenta konačno [4], [5]. Dok je CSC-modela sve više prihvaćena, identifikacija i potvrda tzv markera matičnih stanica u nativnom ljudsko tkivo je teško i uglavnom nedostaje. Nedavno je leucin-bogata, G-proteinski receptor (GPCR) i Wnt ciljanih gena LGR5 pregled je identificiran kao novi matičnih stanica marker tankog crijeva, debelog crijeva i u folikula miševa [6] , Izražavanje LGR5 u više drugih organa ukazuje na to da on može predstavljati globalnu biljeg matičnih stanica odraslih. Međutim, malo je poznato o njegovu ekspresiju u jetre i probavnog trakta ljudi. Pregled

U ovom radu cilj ispuniti tu prazninu informacija i testirali hipotezu da se marker raka matičnih stanica LGR5 ima prognostički i tumor biološka značaj. pregled

Materijali i metode pregled

tema pregled

formalinom fiksne i parafin uklopljenih zloćudne i odgovarajuće ne-maligno tkivo od 127 pacijenata koji obuhvaća šest anatomskim smještajem iz jetre i probavnog sustava sustava (tj jednjaka, želuca, jetre, gušterače, debelog crijeva i rektuma) su preuzete iz arhiva Zavode patologiju kršćanske-Albrechts-University Kiel i sveučilišne bolnice Charité Berlinu (oba Njemačka). Svi su operirani na oba University Hospital Schleswig-Holstein (1997-2009) ili sveučilišne bolnice Charite Berlin (1995-2008; Tablicu 1). Pomjeren, svježe smrznute tkivo je dostupan od 105 tih pacijenata sa osam različitih tipova tumora, tj Barrett-ov adenokarcinoma (9 pacijenata) i karcinom pločastih stanica (7) jednjaka, crijevnih (19) i raširene (21) tip raka želuca, adenokarcinoma kolona (19) i rektum (20), hepatocelularni karcinom (HCC, 4), i kolangiokarcinom (KZ, 6). Karakteristike bolesnika prikazani su u tablici 1. pregled

Nezavisni serija 487 pacijenata oboljelih od raka želuca je izvučen iz arhiva Zavoda za patologiju kršćanske-Albrechts sveučilištu (Tablica 2 i Tablica 3). Ovi pacijenti su prošli bilo potpunog ili djelomičnog gastrektomije za adenokarcinoma želuca ili oesophago-želučane spoju. Svaki resekcija primjerak je kroz histološki pregled kod obučenih kirurških patologa. Vrijeme smrti pacijenta dobiven iz Epidemiološka Registra za rak Netlogu države Schleswig-Holstein, Njemačka. Follow-up podataka pacijenata još živ preuzeti su iz bolničkih zapisa i kontaktiranjem opće prakse. Pregled

Izjava Etika pregled

Svi uzorci tkiva dobiveni su kao dio dijagnostičkog ili terapijskog zahvata provodi se nakon pacijent dao pisani pristanak. Pacijenti koji nude uzorke za studije su pseudonymized i analizirani anonimno, tako da nema pojedinačnih povezanih podaci sadržani u bazi podataka. Istraživanje je odobreno od strane lokalnih etičkog odbora Sveučilišne bolnice u Kielu, Njemačka (ref. Broj D 453/10). Pregled

Real-time-povratne transkriptaze lančana reakcija polimeraze pregled

Ukupna RNA bila izoliran iz kulture stanica i tkiva pomoću cryoconserved Ambion je mirVana Mirni izolacije kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Njemačka), a zatim obradom s DNase Turbo DNA slobodnog kit (Ambion). Kvaliteta RNA je procijenjena na agaroznom gelu 1,5%. Za sintezu cDNA, 2 ug ukupne RNA je obratnoj transkripciji pomoću Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Njemačka). Genski specifične primere su sintetizirani Biomers.net (Ulm, Njemačka) (tablica S1). Stvarnom vremenu reverzne transkriptaze lančane reakcije polimeraze (u realnom vremenu RT-PCR) se provodi uporabom LightCyler® 480 sonde Master (Roche) i LightCycler® 480 System (Roche). Usporedni Ct vrijednosti su normalizirane na one tri domaćih gena: Homo sapiens sukcinat dehidrogenaza kompleksu, podjedinica A, flavoproteina (Fp) (SDHA) Homo sapiens kalpain 2 (CAPN2) pregled i ciklofilin C ( CYCC) pregled. Nema predloška kontrole (bez cDNA u PCR) se kandidira za svaki gen za otkrivanje nespecifičnih ili genomske pojačanje i primera dimerizacije. Svi pokusi su provedeni u duplikatu. Pregled

Proizvodnja i Pročišćavanje
anti-LGR5-antitijela

Poliklonalni antiserumi generirani karboksiterminalnih rep ljudskog LGR5 receptora. Zečevi su imunizirani s tri različita peptida identitetu SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (tzv Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (zove 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (zove 12) Pineda-abservice (Berlin, Njemačka). Monospecifičnog IgG je pročišćen tekućinskom kromatografijom s brzim proteina ÄKTAprime ™ sustav (GE Healthcare, Uppsala, Sweden), pomoću proteina A-stupac (GE Healthcare). Za sve naknadne analize, tj imunofluorescencije, imunocitokemiju, Western blot i imunohistokemijski je monospecifično IgG frakcija je srodno pročišćeno protiv imunizirajuće peptida od strane Pineda-abservice. U dot blot analize i imunohistokemijski istraživanja je monospecifično IgG anti-LGR5-11b antitijela prikazana visok afinitet zajedno s jakim i specifičnim imunološkim. Dakle, ovo antitijelo je korišten u cijelom ovom radu. Reaktivnost i specifičnost protutijela monospecifičnog karakteriziraju western blot; imunofluorescencija i imunocitokemijskom testovi. pregled

plazmida konstruirati pregled

Expression konstrukciju za LGR5 je generirana pojačavanjem cijelu kodnu sekvencu ljudskog LGR5
(NM_003667.2) pomoću PCR (tablica S1 ). Kako bi se olakšalo Subkloniranje amplificiranim fragmentom u ekspresijski vektor pcDNA3.1 (-), forward primer je sadržavao Nhel restrikcijskog stranice adapter a sekvenca reverznog primera je sadržavao BamHl i c-myc oznaku za potvrdu uspješno transfekciju. PCR fragmenti i pcDNA3.1 (-) ekspresijski vektor je digestiran odvojeno s Nhel i BamHI prije ligacije s T4-ligazom (Roche). Plazmid je provjereno digestijom s Nhel i BamHI i sekvenciranje DNA pomoću ABI PRISM BigDye Terminator Ciklus sekvenciranje brzi odgovor Kits, verzija 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Njemačka). Pregled

kultura stanica i transfekcija pregled

ljudska stanična linija karcinoma želuca MKN74 dobiven je iz japanske Health Science Research Resource banke (Osaka, Japan), a MKN45 iz njemačkog zbirci mikroorganizama i staničnih kultura (Braunschweig, Njemačka). HEK293 EBNA stanice su kupili Invitrogcna (Carlsbad, CA, USA). Stanice su uzgojene u RPMI 1640 mediju (MKN74, MKN45) ili Dulbecco Modified Eagle Medium (HEK293), uz dodatak 10% (MKN74, HEK293) ili 20% (MKN45) fetalnog goveđeg seruma, 100 U /mL penicilina i 100 ug /ml streptomicin (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austrija). DNA transfekcije HEK293 ebna, MKN74 i MKN45 stanica vrši se pomoću Lipofektaminje LTX reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Ukratko, stanice koje su uzgojene u pločicama sa šest jamica. Stabilna transfekcija MKN74 i MKN45 ekspresijskim plazmidima izvedena je kako je prethodno [7] opisano. Za prolazne transfekcije stanice HEK293 1 ug plazmida DNA i 5 ul Lipofectamine LTX reagens je razrijeđen u 500 ul Dulbecco Modified Eagle mediju bez seruma, respektivno. Nakon inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi, smjesa se doda u stanice HEK293. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, transfektirane stanice se prikupe i RNA ili proteina su izolirani. Stanice transfektirane s vektorom pcDNA3.1 (-), samostalno i netransfektiranih stanice poslužio kao negativna kontrola pregled

Imunofluorescencija pregled

Dvadeset i četiri sata nakon nacijepljivanja na CultureSlides (BD Biosciences, erembodegem, Belgija). stanice su isprane sa slanom otopinom puferiranom fosfatom, fiksirane u 7:3 acetone:methanol (20 minuta, 20 ° C), a nakon toga natopljeni s 0,1% Triton-X (5 minuta, sobna temperatura). Ploče su zatim inkubira s c-myc mišje monoklonsko antitijelo (Clontech, Mountain View, CA, USA) preko noći na 5 ° C u vlažnoj komori, nakon čega slijedi anti-miš Alexa Fluor 555 konjugiranih sekundarnih antitijela (Invitrogen). Otkriti uspješno transfekciji LGR5, stanice su inkubirane s anti-LGR5-antitijela nakon čega slijedi anti-kunić sekundarnim antitijelom konjugiranim s Alexa Fluor 488 (Invitrogen) svaki za jedan sat na sobnoj temperaturi. Izostavljanje primarnih antitijela na LGR5 transfektirane HEK293 EBNA stanice služile su kao negativni nadzor. Montaža i counterstaining učinjeno s Vectashield Hard-Set uključujući DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA). Pregled

fosforilacija pregled

Imunocitokemijska bojenje je izvedena na formalinom fiksiranih, parafin- ugrađeni MKN45 želučanih stanica raka. Za ovu svrhu, MKN45 stanice su ugrađene u malim zrnaca agaroze kao što je prethodno opisano [8]. Daljnja obrada i imunološko s anti-LGR5-antitijela (razrjeđivanje 1:1000) provodi se u skladu s imunohistokemijske analize presjeka humanog tkiva (vidi dolje). Izostavljanje primarnog antitijela na LGR5 transficirane stanice MKN45 služio je kao negativna kontrola, dok je specifičnost bojanja anti-LGR5-antitijelo potvrđena inkubacijom protutijela s imunizirajuća blokiranje peptid. Pregled

Western blot pregled

Proteinske lizati dobiveni su inkubacijom humanog želučanog tkiva i kultiviranih stanica želuca s ProteoJET ™ sisavaca reagentom za lizu stanica (Fermantas, St. Leon-Rot, Njemačka) i koktel inhibitora proteaze (Potpuno bez EDTA, Roche). Uzorci proteina su denaturirani u Laemmli puferu (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% natrij dodecil sulfata, 10% glicerol, 5% β-merkaptoetanol i 0,01% bromfenol plavo) grijanjem na 95 ° C tijekom deset minuta, a bili su naknadno učitan 4.% do 16,5% SDS poliakrilamidnim gelovima i vizualizirati bojenjem Coomassie blue. Nakon odvajanja, proteini na neobojan poliakrilamidnim gelovima se prenesu na nitroceluloznu membranu (Amersham, Freiburg, Njemačka), imunoblot s anti-LGR5-antitijela (razrjeđivanje 1:20,000) i anti-P-aktin antitijelo (1:10,000; klon AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kako bi se osigurala jednaka učitavanje iznose. Membranu HRP označena sekundarna antitijela (DakoCytomation, Glostrup, Denmark) su detektirane pojačanom kemiluminescencijom pomoću sustava ECL (Amersham). Izostavljanje primarnog protutijela služila su kao negativna kontrola, dok je specifičnost bojanja anti-LGR5-antitijelo potvrđena inkubacijom protutijela s imunizirajuća blokiranje peptid. Pregled

Histologija pregled

histološka analiza tkiva uzorci se fiksiraju u 10% neutralizirane formalinu i uklopljene u parafin. Deparafmizirani Sekcije su označene korištenjem hematoksilinom i eozinom (H &E). Želučani karcinom je klasificiran prema klasifikaciji SZO [9]. PTNM faza određena je u skladu sa 7 ^{th izdanju Međunarodne unije protiv raka [10]. Pregled}

Tissue mikro niz konstrukcija pregled

formalinom fiksne i uzorci tkiva parafin uklopljenih su koristi se za generiranje mikro tkiva polja kao što je opisano [11]. Četiri mikrometra dijelovi dobivenog tumorskog tkiva mikro polja bloka su rezani za daljnju analizu. Uspješan prijenos tkiva tumora je potvrđena mikroskopski pomoću H &. E-obojenih dijelova pregled

Imunohistokem pregled

imunohistokemijski, korišteni su formalinom fiksiranih i dijelovi parafin ugrađen. Imunološko provedena je s anti-LGR5-antitijela (razrjeđivanje 1:1000), monoklonskim protutijelom usmjerenim protiv CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) i komercijalni poliklonska antitijela protiv LGR5 (LGR5 ^{Com , 1:400; Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (razrjeđenje 1:50, Sigma-Aldrich) i Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Nakon 20 minuta blokiranja s vodikovim peroksidom u bloku (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 5 minuta tretmana s Ultra V blok (Thermo Scientific) i inkubacije sa primarnim protutijelom je učinjeno u vlažnoj komori pri sobnoj temperaturi 30 minuta. Stakalca su isprane između koraka s Tris-puferiranoj slanoj otopini (TBS). Imunoloških su vizualizirani s n-Histofine Jednostavno Stain MAX PO sustav (Nichirei biomedicine, Tokyo, Japan) i DAB supstrat (Linaris, Wertheim-Bettingen, Njemačka). Za dvostruke bojenje LGR5 s CD44, ADAM17 i Musashi-1, slobodna vezna mjesta blokirana s mišem IgG i zec-IgG kontrola (Abcam) razrijeđena u sredstvu za razrjeđivanje antitijela (ZYTOMED Systems, Berlin, Njemačka) nakon DAB-tretmana. Uzorci su negativno hematoksilinom. Izostavljanje primarnog antitijela je poslužio kao negativna kontrola. Non-neoplastični ljudski želudac (CD44) i moždano tkivo (LGR5 com, LGR5 i Musashi-1) poslužio je kao pozitivna kontrola. Pregled}

Procjena imunološkim pregled

Imunobojanje ne-neoplastičnim epitela i tumorske stanice je postigao primjenom sustava imunoreaktivnost bodovanja (IRS). Ukratko, kategorija Dokumentirani intenzitet imunološkim kao 0 (nema imunološkeg), 1 (slabo), 2 (umjerena) i 3 (jaka). Kategorija B dokumentirani postotak imunološke reaktivnosti stanica kao 0 (negativni), 1 (rasutih pozitivnih stanica; ≤1%), 2 (2-10% pozitivnih stanica), 3 (11-50%), 4 (51-80%) i 5 (> 80%). Dodavanje kategorije A i B rezultiralo je IRS u rasponu od 0 do 8 za svaki pojedini slučaj. U promjenama distribucije LGR5 ^{+ stanica u 100 Sve se brdo dijelova crijevna tipa karcinoma želuca je postigao sljedeći način: broj imunološke reaktivnosti stanica je kategoriziran kao 0 (negativna), 1 (< 10 pozitivnih stanica), 2 (10 -50 pozitivne stanice) i 3 (> 50 pozitivnih stanica) odvojeno za površine lumena, tumora centra i invazijom ispred pregled}

Statističke analize pregled

Statističke analize su učinili pomoću PASW Statistika 18. statistički paket (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Usporedbe između skupina su ispitani korištenjem Fisher-ovog točnog testa. Korelacija LGR5 izražavanja unutar jedne grupe uspostavljena je Kendall je tau rang-red korelacije. Krivulje preživljavanja su opremljeni sa Kaplan-Meier metodi i razlike u preživljavanju ocjenjuje testa log rank. Značaj korelacija ekspresije LGR5 u primarnim tumorima i odgovarajuće ne-malignih tkiva je određena Wilcoxon testa. Real-time RT-PCR podaci, koji su ocijenjeni s uparenim dvostrani t-test, dobio logarithmized dobiti približno normalno distribuiranih podataka. P-vrijednosti. ≪ 0,05 smatrane su statistički značajno pregled

Rezultati

LGR5-mRNA različito izražava se u jetre i probavnog sustava karcinoma pregled

LGR5 navodno je izražena u mišjim matičnih stanica crijevne grobnica [12] i često je izraženo u staničnim linijama raka debelog crijeva [13]. Istražiti do izražaja kod ne-neoplastičnog i neoplastičnim tkivu, procijenili smo transkripcijsku ekspresiju LGR5 u kliničkim uzorcima sastoji od širokog spektra jetre gastrointestinalnog karcinoma. U realnom vremenu RT-PCR analiza je provedena na seriji 105 bolesnika koji sadrže maligni i odgovarajuće ne-malignih tkiva, koji je dobiven iz istih pacijenata, od osam različitih tipova tumora: jednjak [Barrettov adenokarcinoma (9 pacijenata) i skvamoznih stanica ( 7)], želuca [crijevna (19) i difuzni tip (21) gastrički karcinomi] jetre [HCCs (4), CC (6)], debelog crijeva (19) i rektum (20; Tablica 1) pregled <. p> LGR5-mRNA je bitno različito izražena u adenokarcinoma jednjaka (p = 0,007), želuca [crijevna tipa (p = 0,006) i difuzni tip (p = 0,013)], jetre [CCS (p = 0,022)], debelog crijeva (p < 0.001), kao i rektum (p = 0,002) u usporedbi s odgovarajućom non-neoplastičnog tkiva. Međutim, nema diferencijal ekspresija je pronađena u skvamoznih stanica jednjaka (p = 0,503) i HCCs usporedbi s odgovarajućim ne-maligne tkiva (p = 0,545; Slika 1). Pregled

Poliklonsko anti-LGR5- antitijela otkriva ljudsku LGR5 transficirana u HEK293 i MKN45 stanica pregled

kako bi se dodatno istražiti histoanatomical distribuciju LGR5 u ljudskim tkivima i istražiti svoje kliničko-patološki značaj, antitijelo LGR5 specifičan je odrastao, jer su komercijalno dostupna antitijela učinio ne ispunjava naše zahtjeve (slika 2a). Kako bi se isključili križnu reaktivnost novostvorenog antitijela s najviše strukturno slični LGRs, LGR4 i LGR6, proveli smo poravnavanje sekvenci s Nacionalnog centra za biotehnološke informacije pregled, alat za poravnanje unaprijed (podaci nisu prikazani). Ne homolognost je pronađena LGR4 ili LGR6 u području LGR5 peptid koristili smo za imunizaciju. Za izbor vrlo specifičnog antitijela protiv LGR5 klonirane cDNA pune duljine je transficiran u HEK293 EBNA stanice i koristi se kao pozitivna ciljni obavlja imunofluorescencije. LGR5 cDNA je izravno označene sa mic-epitop, što je omogućilo vrednovanje transfekciju s anti-myc tag antitijela. Koristeći imunofluorescencije, vezanje anti-myc tag antitijela pronađen nakon inkubacije s LGR5 /HEK293 stanica, ali ne i na prazan vektor transficiranih stanica (vektor /HEK293), netransfektiranim HEK293 stanica, ili u negativnom kontrolom LGR5 /HEK293 stanica inkubira sa sredstvom za razrjeđivanje antitijela umjesto primarnog antitijela. Isti rezultat se dobije kada se koristi anti-LGR5-antitijela (slika 3), pokazujući posebno označavanje LGR5. Pregled

Specifičnost LGR5-immunolabelling dodatno potvrđuju se formalinom fiksne i parafin uklopljenih MKN45 želuca stanice raka. Stanice su pripremljene i bojane na način koji se poklapa obradu kliničkim uzorcima humanog tkiva. Imunocitokemijska analize na parafinskim rezovima otkrila je pozitivno bojenje anti-LGR5-protutijela na MKN45 stanice su stabilno transficirane s cDNA LGR5 (LGR5 /MKN45). Umjesto toga, prazan vektor transfektirane MKN45 stanica (vektor /MKN45), kao i negativnu kontrolu (izostanak primarnog antitijela) i kontrolni peptid (pre-inkubacija antitijela sa svojim imunizaciju blokira peptid) iz LGR5 /MKN45 stanica pokazuje bez vezanja protutijela (Slika S1). pregled

LGR5 protein specifično detektirati anti-LGR5-antitijela u humanoj transfektirane stanice koje MKN74

staničnih linija raka želučanog MKN74, poznati posjeduju izraz umjereno LGR5-mRNA (podaci nisu prikazani) i ljudske ne-neoplastični želudac, i vrlo nisku ekspresiju LGR5 (Slika 1) izabrani su za karakterizaciju reaktivnost i specifičnost anti-LGR5-antitijela na razini proteina. pregled

u Western blot analizi, LGR5 protein je specifično prepoznat od anti-monospecifičnog LGR5-antitijela u razrjeđenju 1:20,000. Je identificiran jednu prugu s jasnom molekularnom težinom od 100 kDa u MKN74 staničnih lizata (slika 4), koji odgovara molekulsku masa izračunata za LGR5 protein. Nasuprot tome, nikakve band je otkriven u lizatima ljudske ne-neoplastičnim tkivu želuca, što isključuje poprečni reaktivnosti anti-LGR5-antitijela sa staničnim proteinima. U skladu s podacima mRNA ekspresije, jača ekspresija proteina LGR5 opažena u MKN74 stanice su stabilno transficirane s cDNA LGR5, u usporedbi s kontrolnim stanicama MKN74 transfeciranih sa praznim vektorom. LGR5 ekspresija proteina u ljudskom non-neoplastičnim sluznicu želuca je izvan granice detekcije zapadnoj upijajući, prikazujući ne bend. Izostavljanje anti-LGR5-antitijelo ili prethodne inkubacije antitijela s njegova imunizirajuća blokiranje peptid ne prikazuje proteinske vrpce, respektivno. Otkrivanje P-aktin proteina (približno 43 kDa; Slika 4) služi kao kontrola za punjenje i potvrdio jednoliko napunjen protein iznose sve trake pregled

LGR5 izražava u ne-neoplastičnog i neoplastičnim tkivom od jetre gastrointestinalnog. pregled sustava

ekspresija i histoanatomical distribucija LGR5 zatim proučavana imunohistokemijom u nizu 127 tkiva preparatima dobivenim iz odgovarajuće ne-neoplastičnih i neoplastične tkivo jetre i gastrointestinalnog trakta, koji sadrži jednjaka (14 bolesnika), želuca (32), jetre (24), gušterače (17), debelog crijeva (20), i rektum (20; Tablica 1). Iz ove skupine neoplastičnim i odgovarajuće ne-maligne uzoraka tkiva od 105 pacijenata također su proučavali na razini transkripcije (vidi gore). Pregled

LGR5 izraz cjelokupne skupine bio je pozitivan u 65 slučajeva (51%) svih nemalignih tkiva i 103 (81% slučajeva) svih tkiva raka. Lokacija LGR5 izražavanja zabilježen je uglavnom citoplazmatske, a došlo je i sporadična membrana ili jezgra opna naglašeni izraz. LGR5-imunoreaktivnost je pronađena u svim komponentama tkiva, tj stroma stanicama, endotelne stanice, stanice u ne-neoplastičnog epitela i na stanice raka (Slika 5). LGR5-imunoreaktivnost na stroma stanicama uočena je u 49 (39%) sve ne-malignim tkivima, te 80 slučajeva (63%) od svih tkiva raka. Endotela imunoreaktivnost LGR5 zabilježeno je u 42 slučajeva (33%) svih tkiva. Pregled

U ne-maligne epitela, LGR5 se obično nalaze u nekoliko razasutih stanica blizu bazalne membrane od želučane sluznice jedinici, gušterače kanali, i debelog grobnica. LGR5 nije pronađen u pločastim epitelom jednjaka, intrahepatičkih žučnih kanala, i hepatocitima (Slika 6). Za sve vrste tkiva osim jednjaka tkiva srednja vrijednost IRS bio je značajno veći tumor tkiva u odnosu na podudarne ne-malignih tkiva, potvrđujući svoje rezultate istraživanja o razini transkripcije (Tablica 1). Pregled

LGR5 je prisutan u razasute stanice normalne sluznice želuca Netlogu

postojanje multipotentnih matičnih stanica u mišjim želucu je pokazala i klonskih studija za označavanje. Definitivna identifikacija tih stanica nije do sada zbog nedostupnosti određenih endogenih markera [14]. Korištenje serijske dijelove dobivene iz rukava resekcija uzorka, koja je uobičajena za liječenje prekomjerne težine, a nisu pokazali histološki dokaz od raka želuca ili kronični gastritis, tražili smo LGR5 ^{+ epitelnih stanica. Zanimljivo, razasuti LGR5 + stanice se nalaze u vratu regiji sluznice između foveolae i žlijezda (slika 7). Pregled}

LGR5 se coexpressed s drugim potencijalnim matičnih stanica ili predak stanica markera želučanih pregled

Matične stanice nisu tumora, i eksplozivnim dizanjem utega obično su identificirani i validirani pomoću ekspresije više od jednog matičnih stanica marker [15]. Korištenjem imunohistokemijske smo pored analizirali koekspresiji LGR5 s drugim navodnim CSC markere, tj ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 je izabran, jer prethodne studije identificirati ADAM17 kao navodni matičnih stanica marker želuca [8]. Imunobojanje (ili dvostruko bojenje ili bojenje serijskih odjeljaka) provodi se na želučani uzorka raka i na zdravu uninflammed želučane sluznice dobiveni čahure gastrektomije. U principu samo nekoliko raštrkanih stanice pokazuju pozitivan imunološko jedne i /ili druge oznake navodni matičnih stanica. Zanimljivo je da je ne-neoplastični želučane sluznice krije stanice koje su međusobno ADAM17 ^{+ /LGR5 + (što predstavlja otprilike jednu trećinu svih imunološke reaktivnosti stanica) i ADAM17 + /LGR5 - (dvije trećine) i ADAM17 - /LGR5 + (nekoliko razasutih stanica, Slika 2C-E) pregled}

Musashi-1 (MSH-1) je opisan kao potencijalnog matičnih stanica markera na miša crijeva. i ljudski želudac [18], [22], a kao CSC markera u tumorima [23]. U maligne i ne-maligne želuca tkiva pozitivnih obojenih stanica sastavljene pretežno od MSH-1 ^{+ /LGR5 - (oko dvije trećine svih imunološke reaktivnosti stanica), u manjoj mjeri MSH-1 + /LGR5 + (jedna trećina), a malo MSH-1 - /LGR5 + stanica (Slika 2F-H). Konačno oznaka površine kolorektalnih i rak želuca matičnih stanica CD44 [21], [24] pokazala raspodjela usporedivu s MSH-1 (Slika 2i, J). Zajedno, ovi rezultati podupiru hipotezu da je naš anti-LGR5-antitijelo prepoznaje stanice s izrazom matičnih stanica uzoraka u ljudskoj želučane sluznice. Pregled}

Prostorni raspored LGR5 ^{+ stanica promjene tijekom tumourigenesis pregled}

Uzastopna promjene u sluznici želuca koji prethode razvoja invazivnog karcinoma su poznati kao 'pretkarcinomsku kaskada, prvi put opisao 1975. godine, gdje je normalno želučane sluznice transformiran kronični atrofični gastritis i razvija multifokalne atrofije i intestinalne metaplazije, nakon čega slijedi pojava displazije i konačno invazivni karcinom [25]. Zatim smo testirali hipotezu da su spomenute patohistološke promjene sluznicu želuca povezan s preraspodjelom na LGR5 ^{+ pretpostavljenim matičnih stanica. Sustavno istraživao histoanatomical distribuciju LGR5 + stanica u 100 bolesnika s crijevna tipa raka želuca. dijelovi Sve se brdo tkiva su korišteni koji prilaže non-neoplastične, metaplastičnim i neoplastične raka tkiva. Bilo je odmah jasno da je histoanatomical distribucija LGR5 promijenio + stanice (vidi sliku 7.): u ne-neoplastični i ne-metaplastičnim sluznicu želuca, malo razbacane LGR5 + stanice se nalaze u vrat regiji sluznice (Slika 7A, E). U probavnom metaplazije, nešto veći broj LGR5 + stanice su lokalizirani na dnu metaplastičnim kripti (Slika 7B, F). Međutim, u crijevnoj tipa karcinoma želuca lokalizacija i broj LGR5 + stanica bio je upadljivo promijenio. Kod karcinoma želuca, LGR5 + stanica su bili prisutni na površine lumena (Slika 7C, G), u centru tumora (između površine lumena i invazijom sprijeda), a na invazijom sprijeda (Slika 7d). Najzanimljivije je da je raspodjela LGR5 + želučanih stanica raka pokazala je karakteristične uzorke podataka: LGR5 + stanice se dogodila u kohezivnih zakrpe varijabilnog broja tumorskih stanica u rasponu od < 10, 10-50, pa čak i pri 50 tumorske stanice, često formiranje stupnjeve smanjenja bojenje intenziteta. Ukupna distribucija tih LGR5 + stanica zakrpe tumor bio neujednačen i nehomogeno. Zajedno smo primijetili povećanje broja i intenziteta LGR5 + stanica iz ne-neoplastičnim epitela na želučani karcinom koji podržava naše realnom vremenu RT-PCR i imunohistokemijski podatke uskladiti (ne-neoplastični odnosu neoplastični) slučajeva bolesnika (vidi tablica 1). Naši rezultati izmijenjenom strukturu distribucije LGR5 stanica + je u skladu s onima koje su opisali Takeda et al. za rak debelog crijeva [26]. pregled}

Ekspresija LGR5 u intestinalni tipa raka želuca korelira s rastom tumora i lokalnim čvora širenje

Pretpostavlja se da utjecaj CSC prognozom za pacijenta prema njihovoj sposobnosti da nastane tumor stanica kolonije, nezaobilazan preduvjet za metastatskog širenja i bolesti recidiva. Kako bi se dodatno istražiti značaj LGR5 za rak želuca, u korelaciji smo ekspresiju LGR5 u crijevnom tipa rakom želuca s raznim kliničko-patološka obilježja bolesnika.