PLoS ONE: Chrysin Inibisce tumore promotore-Induced MMP-9 Espressione bloccando AP-1 attraverso la soppressione di ERK e JNK percorsi di cancro gastrico Cells

Estratto

Cell invasione è un meccanismo fondamentale di metastasi del cancro e di malignità . Metalloproteinasi della matrice-9 (MMP-9) è un importante enzimi proteolitici coinvolti nel processo di invasione delle cellule del cancro. Alti livelli di espressione di MMP-9 in cancro gastrico correlano positivamente con l'aggressività del tumore e hanno una significativa correlazione negativa con tempi di sopravvivenza dei pazienti. Recentemente, i meccanismi di soppressione MMP-9 da sostanze fitochimiche sono diventati sempre più indagato. Chrysin, una sostanza chimica naturale nelle piante, è stato segnalato a sopprimere metastasi tumorali. Tuttavia, gli effetti di chrysin su MMP-9 espressione di cancro gastrico non sono stati ben studiati. Nel presente studio, abbiamo testato gli effetti di chrysin su MMP-9 espressione in cellule di cancro gastrico, e determinato il suo meccanismo sottostante. Abbiamo esaminato gli effetti di chrysin su MMP-9 espressione e l'attività mediante RT-PCR, zimografia, studio promoter, e western blotting nel carcinoma gastrico cellule AGS umane. Chrysin inibito forbolo-12-miristato 13-acetato (PMA) indotta MMP-9 in modo dose-dipendente. Utilizzando AP-1 oligonucleotidi decoy, abbiamo confermato che AP-1 è stato il fattore di trascrizione cruciale per MMP-9 espressione. Chrysin bloccato AP-1 attraverso la soppressione della fosforilazione di c-Jun e c-Fos attraverso il blocco dei /2 e ERK1 /2 percorsi JNK1. Inoltre, le cellule AGS pretrattate con PMA hanno mostrato nettamente migliorate invasività, che è stata parzialmente abrogata dal Chrysin e MMP-9 anticorpi. I nostri risultati suggeriscono che chrysin può esercitare almeno parte del suo effetto antitumorale controllando MMP-9 attraverso la soppressione di AP-1 tramite un blocco dei JNK1 /2 e ERK1 /2 vie di segnalazione nelle cellule AGS cancro gastrico.

Visto: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin inibisce tumore promotore-Induced MMP-9 Espressione bloccando AP-1 attraverso la soppressione di ERK e JNK percorsi in cellule cancro gastrico. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10.1371 /journal.pone.0124007

Editor Accademico: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Stati Uniti |

Ricevuto: 5 ottobre 2014; Accettato: 9 marzo 2015; Pubblicato: 15 apr 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

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Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto da un assegno di ricerca (0.720.570) dal National Cancer center (www.ncc.re.kr), concessione Scienza di base del programma di ricerca attraverso la Fondazione nazionale delle Ricerche di Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (2.010-0.009.910, www.moe.go.kr), e un centro di ricerca medica (2012-000-9442) concessione dal Science Foundation coreano e Ingegneria ( www.nrf.re.kr). Tutti i finanziatori di cui sopra hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico attualmente al secondo posto nella mortalità globale del cancro, con una stima di 990.000 nuovi casi e 738.000 decessi per cancro in tutto il mondo ogni anno risultanti, anche se l'incidenza del carcinoma dello stomaco è diminuita negli ultimi decenni [1,2]. organo a distanza o metastasi dei tessuti è un segno di scarsa prognosi nei pazienti con cancro gastrico. Metastasi è la caratteristica più fatale di tumori maligni, che rappresentano oltre il 90% di casi di mortalità tumore-correlati [2]. E 'stato dimostrato che la chemioterapia e la radioterapia non possono prolungare in modo significativo e migliorare la qualità della vita dei pazienti in quei casi [3,4]. Le cellule tumorali metastasi è un processo molto complesso composto di proliferazione, migrazione, invasione e la successiva adesione e angiogenesi in altri organi o tessuti [3].

Poiché invasione è una delle proprietà fondamentali delle cellule tumorali maligne, controllare l'invasione, è un importante obiettivo terapeutico. Matrice Cell-extracellulare (ECM) interazioni, disconnessione di adesione intercellulare, degradazione della ECM, e l'invasione dei vasi linfatici e sanguigni sono passi importanti nella invasione del cancro e metastasi [5]. Tumore invasione richiede un aumento dell'espressione di metalloproteinasi della matrice (MMP) [6]. MMP, una famiglia di endopeptidasi zinco-dipendente che inducono l'invasione delle cellule tumorali e la diffusione, giocano un ruolo cruciale nella metastasi attraverso la degradazione della ECM e la membrana basale [7]. Matrix metalloproteinasi-9 (MMP-9), noto come 92 kDa tipo IV collagenasi o gelatinasi B, è uno dei più importanti MMPs, ed è codificata dal gene MMP-9 in esseri umani [8]. E 'stato riportato che la sovraespressione di MMP può aumentare il distacco delle cellule tumorali e metastasi, che sono associati con tumori maligni e gli esiti clinici poveri in vari tipi di cancro tra cui il cancro gastrico [9,10].

A causa della funzione di MMP- 9 nel corso di malignità, la soppressione di MMP-9 livelli è una strategia importante per controllare il cancro. Negli ultimi anni, sempre maggiore attenzione è stata focalizzata sulla ricerca di un inibitore di MMP-9, in particolare da materiali naturali. Kim et al. scoperto che silibinin inibisce PMA-indotta MMP-9 espressione attraverso la soppressione di ERK fosforilazione in MCF-7 cellule di cancro al seno umano [11]. Più recentemente, Khoi et al. riportato che (-) - blocchi epigallocatechina-3-gallato nicotina indotta MMP-9 e invasività attraverso la soppressione di NF-kB e AP-1 in cellule endoteliali ECV304 [12]. Chrysin, 5,7-Dihydroxyflavone, un tipo di flavonoide naturale, è stato conosciuto per inibire l'angiogenesi e le metastasi [13,14]. Lin et al. ha dimostrato che chrysin sopprime l'angiogenesi IL-6 indotta attraverso la down-regolazione del pathway di segnalazione solubile del recettore IL-6 /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF [13]. Recentemente è stato riferito che chrysin potrebbe migliorare l'apoptosi caspasi-dipendente regolato da TRAIL in linea di cellule HCT 116 e le cellule CNE1 [15]. Yang et al. scoperto che chrysin soppresso l'invasione delle cellule in modo dose-dipendente in cellule TNBC. Inoltre, chrysin diminuisce molecole metastasi legati vimentina, lumaca e lumaca, e blocca la via di segnalazione Akt [16]. Tuttavia, gli effetti inibitori di chrysin on MMP-9, così come il meccanismo, non sono stati studiati, in particolare in cellule di cancro gastrico. In questo studio, abbiamo studiato gli effetti di Chrysin sulla PMA-indotta MMP-9 espressione nel carcinoma gastrico, e rivelato la sua meccanismo sottostante.

Materiali e Metodi

coltura cellulare e condizioni di coltura

la linea di cellule umane di cancro gastrico AGS è stato ottenuto dalla American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Le cellule sono state coltivate in RPMI-1640 supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS) e 0,6% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in atmosfera contenente 5% di CO _{2. Per determinare gli effetti di chrysin sulla PMA indotto MMP-9, le cellule sono state pretrattate con diverse concentrazioni di chrysin e poi trattate con PMA. Il livello di MMP-9 RNA messaggero (mRNA) è stata determinata mediante reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR). Il ruolo delle specifiche vie di segnalazione della MMP-9 espressione PMA-indotta sono stati esaminati da pretrattamento delle cellule AGS con l'inibitore PD98059 ERK 1/2 (New England Biolabs, Beverly, MA), il SP600125 inibitore di JNK (Calbiochem, La Jolla , CA), il SB203580 inibitore p38 MAPK (Calbiochem, la Jolla, CA), e chrysin (Sigma Aldrich, USA) per 1 ora prima della stimolazione con PMA.}

la vitalità cellulare

celle ( 5 × 10 ^{3) sono stati incubati in una piastra a 96 pozzetti in RPMI con 10% FBS contenente 0-100 mM chrysin per 24 ore, e la respirazione cellulare è stato determinato da un consolidato 3- [4,5-dimetiltiazol-2 -yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT, Sigma-Aldrich) test. Dopo l'incubazione, 10 microlitri di 5 mg /ml di MTT è stato aggiunto a ciascun pozzetto di piastre da 96 pozzetti e incubate a 37 ° C per 2 ore. I granuli formazano ottenuti sono stati sciolti in 100% dimetilsolfossido, e l'assorbanza a 570 nm è stato rilevato con un pozzo-96 lettore ELISA (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).}

gelatina zimografia

cellule pretrattate con o senza chrysin per 1 ora sono stati trattati con 100 nM PMA per 20 ore. Dopo l'incubazione, abbiamo raccolto il surnatante media e effettuato la gelatina zimografia per controllare l'attività di MMP-9. Successivamente, il supporto è stato mescolato con un volume uguale di 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM Tris-HCl (pH6.8), 25% glicerolo, 4% SDS, e 0,01% blu di bromofenolo] e caricato in un acrilammide 7,5%: bisacrylamide (29: 1; Bio-Rad, Stati Uniti d'America) gel contenente 625 mg /ml di gelatina (Sigma). Dopo l'elettroforesi, il gel è stato lavato con 2,5% Triton X-100 per tre volte (20 minuti per volta), poi incubate per 24 ore a 37 ° C, nel buffer di incubazione [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl _{2, e 1 micron ZnCl 2]. I gel sono stati colorati con Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) per 3 ore, quindi risciacquati. attività proteolitica è riflessa come bande chiare sullo sfondo azzurro del gelatina macchiato. Controllo delle sollecitazioni per la gelatina zimografia: Coomassie Brilliant Blue R-250 gel macchia per il 10% sodio dodecil solfato poliacrilammide, senza gelatina, per mostrare la stessa quantità di surnatante è stato caricato su ogni corsia}

Reverse trascrizione-PCR
<. p> RNA totale è stato estratto dalle cellule AGS utilizzando TRIzol reagente (Invitrogen). Uno mg di RNA totale è stato utilizzato per la sintesi del DNA complementare primo filamento usando primer casuali e M-MLV trascrittasi (Promega). Il DNA complementare è stato sottoposto a PCR con i set di primer per GAPDH e MMP-9 con una soluzione master mix PCR (introne, Corea). I primer specifiche sequenze sono state le seguenti: senso GAPDH, 5'-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 'e GAPDH antisenso, 5'-CAA TGA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 bp); e MMP-9 senso, 5'-AAG TGG CAC CAC CAC AAC a -3 'e MMP-9 antisenso, 5'-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3' (497 bp); c-Jun senso, 5'-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ', e c-Jun antisenso, 5'-GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3' (287bp); c-Fos senso, 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 'e c-Fos antisenso, 5'-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3' (246bp). Le condizioni di PCR erano le seguenti:. Denaturazione a 94 ° C per 30 secondi, ricottura a 52 ° C per 20 secondi e estensione a 72 ° C per 30 secondi

Misurazione di MMP-9 promotore attività

la regolazione trascrizionale di MMP-9 è stato esaminato dal trasfezione transiente di MMP-9 promotore-luciferasi costrutto giornalista (pGL4-MMP-9). Il plasmide pGL4-MMP-9 promotore (che copre nucleotidi da -925 a +13) è stato gentilmente fornito dal Dr. Young-Han Lee (Konkuk Università, Corea). cellule AGS sono state seminate e coltivate fino a raggiungere il 70% di confluenza. Poi, i pGL4-MMP-9 plasmidi promotore sono state trasfettate nelle cellule utilizzando FuGENE 6 (Promega, USA) secondo il protocollo del produttore. PRL-TK è stato trasfettate come controllo interno. Le cellule sono state incubate in mezzo trasfezione per 12 ore e poi trattate con PMA per 4 ore. Gli effetti di chrysin su MMP-9 promotore attività sono state determinate mediante pretrattamento delle cellule con chrysin per 1 ora prima dell'aggiunta PMA. Gli studi co-trasfezione sono state eseguite in presenza o assenza del vettore di espressione codificante la dominanti negativi mutante MEK-1 (PMCL-K97M), dominante JNK mutante negativo (PMCL-TAM67), o dominante negativo mutante p38 MAPK (PMCL-MP38 ), che sono stati gentilmente forniti dal Dr. NG Ahn (University of Colorado at Boulder, CO), dal Dr. M.J. Birrer (NCI, Rockville, MD), e da, Dr. J. Han, rispettivamente (Scripps Research Institute, CA). Le cellule sono state raccolte con un reagente coltura cellulare lisi (Promega, USA), e le attività luciferasi sono stati determinati utilizzando un luminometro (Centro XS lb960 micropiastre luminometro, Berthold Technologies, USA) secondo il protocollo del produttore.

Transient trasfezione di AP-1 giornalista

L'AP-1 luciferasi giornalista plasmide è stato acquistato da Clontech (Palo Alto, CA, USA). Quando le cellule AGS raggiunto 60-70% di confluenza, sono state lavate con terreno Opti-MEM e trasfettate con un vettore PGL-3 contenente il reporter AP-1 usando FuGENE 6 (Promega) secondo il protocollo del produttore. cellule Reporter-trasfettate sono stati pretrattati con chrysin per 1 ora e poi trattate con 100 nM PMA per 4 ore e le attività luciferasi sono stati misurati utilizzando un luminometro.

Transfection di AP-1 oligonucleotidi decoy

sulla base della AP-1 sito di legame ATGAGTCAT, abbiamo progettato l'AP-1 esca phosphorothioated deossinucleotide oligo a doppio filamento (ODN) come segue, 5'-CGST CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACSG-3 'e 3 'GAA -GsCA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5'. Quando le cellule AGS crebbe fino a 60-70% di confluenza, AP-1 e ODN pGL4-MMP-9 plasmidi promotore sono state co-trasfettate in cellule utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) secondo il protocollo del produttore. Dopo incubazione per 20 ore, le cellule trasfettate sono state trattate con PMA per 4 ore e le attività di luciferasi sono stati misurati usando un luminometro.

Western blot

cellule AGS trattate con PMA sono stati lavati in fosfato salina tamponata (PBS), indipendente utilizzando tampone tripsina-EDTA, e conservato a -70 ° C fino al momento dell'uso. La proteina cellulare è stato estratto con tampone RIPA [1% NP-40, 0,5% di sodio desossicolato, 0,1% sodio dodecil solfato (SDS)] e inibitori della proteasi (aprotinina, leupeptina, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidine, inibitore della tripsina, orthovanadate sodio ). Cinquanta microgrammi di proteine ​​è poi separato 10% elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide e trasferiti su membrane Hybond-P (Amersham Pharmacia Biotech). Le membrane sono state bloccate in una soluzione TBST contenente 5% di latte scremato, incubate con un anticorpo primario in una soluzione bloccante notte a 4 ° C e lavate tre volte con 0,1% Tween-20 in Tris tamponata salina (TBST) ad intervalli di 10 minuti . Perossidasi di rafano-coniugato anticorpo secondario (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) è stato utilizzato per rilevare le proteine ​​immunoreattive per chemiluminescenza. I seguenti anticorpi sono stati utilizzati: anti-fosfo-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology Danvers, MA, USA), anti-fosfo-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP- 9 (Cell Signaling Technology), anti-fosfo-c-Fos (Cell Signaling Technology), e anti-fosfo-c-Jun (Cell Signaling Technology). I livelli di proteine ​​totali sono stati dosati lavando membrana Blotted con una soluzione di rimozione composto da 100 mM 2-mercaptoetanolo, 2% SDS, e 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) per 30 minuti a 50 ° C, e la membrana era poi ri-sondato sia con l'anti-β-actina (Cell Signaling Technology), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-totale JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology anti-totale , Inc., CA, USA) o anti-c-Jun (Santa Cruz).

Matrigel saggio di invasione

il saggio invasione delle cellule è stata effettuata utilizzando la camera chemotasis 10-bene (Neuro Probe, Gaithersburg, Maryland, USA) con 8 pori mM membrana (Neuro Probe) con il 10% FBS contenente RPMI come chemiotattico nella camera inferiore. cellule AGS (10 ^{5 in 280 microlitri) sono stati aggiunti alla camera superiore con PMA in presenza di crisina, MMP-9 anticorpo o non specifico IgG, e incubate per invadere il Matrigel per 24 ore. Al fine di determinare l'effetto di crisina e inibitori di segnalazione sul invasione delle cellule PMA-indotta, cellule AGS sono stati pre-incubate con chrysin, curcumina, PD98059 o SP600125 per 1 ora, e incubate con PMA per il periodo dell'invasione 24 ore. Le cellule non invadono sulla superficie superiore di ogni membrana sono stati rimossi dalla camera, e le cellule invadono sulla superficie inferiore di ogni membrana sono state colorate con Quick-Diff kit di colorazione (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Dopo due lavaggi con acqua, le camere sono stati autorizzati a asciugare all'aria. Il numero di cellule invasione è stato contato con un microscopio a contrasto di fase.}

Statistiche

I dati sono mostrati come media ± SD, e rappresentano la media di almeno tre esperimenti separati condotti in triplicato. Le differenze tra ogni due insiemi di dati sono stati determinati da t-test. Le differenze descritte come significativo nel testo corrispondono a P
. ≪ 0,05

Risultati

effetto inibitorio di chrysin sulla PMA stimolato MMP-9 espressione

per studiare l'effetto soppressivo del chrysin contro la sovraregolazione di MMP-9, le cellule AGS pretrattate con chrysin sono state incubate con PMA, e sono stati eseguiti la gelatina zimografia e RT-PCR. Come mostrato in figura 1A, PMA-stimolata MMP-9 è stata inibita da chrysin in modo dose-dipendente, come illustrato per mezzo della prova di gelatina zimografia. Prima del nostro esperimento, se chrysin direttamente inibito l'attività di MMP-9 o inibita l'espressione di MMP-9 era ancora sconosciuto. Per rispondere a questa domanda, abbiamo co incubate l'AGS-secreto MMP-9 con chrysin per 3 ore, e la gelatina zimografia è stata effettuata per verificare il livello finale di MMP-9 attività. Come dimostra la figura 1B, chrysin non poteva influire secreto MMP-9 attività. Così, abbiamo ipotizzato che l'inibizione di Chrysin contro MMP-9 può essere attraverso la soppressione di MMP-9 espressione. Per verificare questa ipotesi, invertono trascrizionale PCR e saggi di MMP-9 promotore sono stati effettuati per verificare i livelli di trascrizione di MMP-9. Come mostrato in figura 1C, dopo essere stati trattati con chrysin, PMA-indotta MMP-9 mRNA è diminuito in modo dose-dipendente. Inoltre, MMP-9 attività luciferasi promotore stata inibita da chrysin in modo dose-dipendente (Fig 1D). E Western blotting ha anche mostrato l'effetto inibitorio del Chrysin su MMP-9 espressione (Fig 1E). Le concentrazioni di chrysin utilizzati nel presente studio non ha influenzato vitalità cellulare (Fig 1F). Questi risultati indicano che chrysin inibisce l'attività di MMP-9 in cellule AGS attraverso una riduzione dell'efficienza trascrizionale.

Il ruolo di AP-1 in PMA-indotta MMP-9 espressione

Come riportato dal precedente letteratura, AP-1 è il più importante fattore di trascrizione in MMP-9 [17]. In questo studio, per confermare che AP-1 è critica necessaria in questo corso, abbiamo impiegato un AP-1 esca phosphorothioated oligodeoxynucleotide a doppio filamento (ODN) e pGL3-AP-1 luciferasi plasmide di co-trasfezione nelle cellule AGS. Le cellule co-trasfettate sono state trattate con PMA e le attività di luciferasi sono stati determinati usando un luminometro. Come mostrato in figura 2A, le attività luciferasi MMP-9 promotore PMA-indotta sono stati inibiti dal AP-1 richiamo. Coerentemente, AP-1 esca anche inibito PMA-indotta MMP-9 espressione di mRNA (Fig 2B). E 'stato dimostrato che abbattendo la componente AP-1 c-Fos e c-Jun ha anche diminuito PMA-indotta MMP-9 espressione (Fig 2C). Inoltre, la curcumina, un AP-1 inibitore, è stato anche impiegato per controllare il ruolo di AP-1 in PMA-indotta MMP-9 espressione. Poiché i dati RT-PCR illustra, curcumina inibito PMA-indotta MMP-9 in modo dose-dipendente (Fig 2D). I dati sopra indicato che AP-1 è il fattore essenziale MMP-9. Dopo la dimostrazione del ruolo cruciale di AP-1 negli alti livelli di MMP-9 espressione, abbiamo ipotizzato che il meccanismo di inibizione Chrysin di MMP-9 espressione era attraverso la soppressione di AP-1. Successivamente, le cellule AGS trasfettate con AP-1 luciferasi plasmidi reporter sono stati pretrattati con chrysin, e poi stimolate da PMA. Come mostrato in figura 2E, chrysin soppresso PMA-indotta attività AP-1lucifease in modo dose-dipendente, che indicava che chrysin ha una capacità di diminuire AP-1.

Chrysin inibisce PMA-indotta MMP-9 espressione inibendo fattore di trascrizione AP-1 mediante la soppressione di c-Jun e c-Fos fosforilazione

e 'ben noto che c-Jun e c-Fos sono componenti della AP-1 pathway [18]. Abbiamo voluto stabilire il meccanismo alla base dell'effetto inibitorio di chrysin su AP-1, e studiato se chrysin effettivamente esercitato il suo effetto sul c-Jun e c-Fos. Abbiamo misurato la quantità di mRNA totale sia di c-Jun e c-Fos mediante RT-PCR. Come mostrato in figura 2F, chrysin non ha inibito i livelli di espressione di c-Jun e c-Fos mRNA. Successivamente, per verificare se chrysin inibisce l'attivazione di c-Jun e c-Fos, western blotting è stato eseguito per monitorare la fosforilata c-Jun e c-Fos. Fig 2G e 2F mostra che chrysin ha fatto sopprimere il PMA-indotta c-Jun e c-Fos fosforilazione in modo dose-dipendente.

Chrysin inibisce c-Jun e c-Fos fosforilazione bloccando JNK e segnalazione ERK percorso

Abbiamo poi studiato come Chrysin soppresso c-Jun e c-Fos fosforilazione. A causa delle importanti ruolo svolto MAPK nell'attivazione di AP-1, abbiamo studiato il ruolo del pathway MAPK in MMP-9. Come mostrato in figura 3A, tra gli inibitori MAPK, PD98059 (ERK1 /2 inibitori), SP600125 (JNK1 /2 inibitori) e SB203580 (inibitore MAPK p38), solo PD98059 e SP600125 erano in grado di inibire PMA-indotta MMP-9 , che ha indicato che le /2 e JNK1 /2 percorsi ERK1 possono essere cruciale per PMA-indotta MMP-9 espressione. Inoltre, con il MEK dominante plasmide negativo PMCL-K97M, JNK-dominante plasmide negativo PMCL-TAM67 e p38 MAPK dominante plasmide negativo PMCL-MP38, abbiamo confermato i ruoli critici di ERK e JNK in MMP-9 espressione di cancro gastrico AGS cellule (Fig. 3B) Inoltre, come mostrato in Fig 3C, ERK1 /2 e JNK1 /2 sono criticamente richiesto per AP-1 attivazione con PMA, dimostrata attraverso il nostro esperimento con MEK e JNK dominanti negativi plasmidi. Abbiamo poi controllato i ruoli di JNK1 /2 e ERK1 /2 in c-Jun e l'attivazione di c-Fos. Come mostrato in figura 3D, SP600125 e PD98059 soppressi PMA-indotta c-Jun e c-Fos fosforilazione rispettivamente, indicando che JNK1 /2 è criticamente monte di c-Jun, mentre ERK1 /2 è criticamente monte di c-Fos. Dal momento che abbiamo scoperto che JNK1 /2 e ERK1 /2 giocato un ruolo essenziale nella MMP-9 espressione tramite AP-1, abbiamo ipotizzato che chrysin può funzionare attraverso una inibizione della JNK1 /2 o ERK1 /2 per sopprimere MMP-9 espressione. Per verificare la nostra ipotesi, Western blotting è stato eseguito per determinare l'effetto di chrysin su JNK1 /2 o ERK1 /2 fosforilazione. Come Fig 3E e 3F spettacolo, il trattamento PMA ha portato ad un notevole aumento JNK1 /2 e ERK P42 /44 fosforilazione; JNK1 tuttavia, in presenza di Chrysin, PMA-indotta /2 e ERK1 /2 fosforilazione è stato inibito in modo dose-dipendente.

Effetto della chrysin sulla invasività delle cellule

E 'noto che alti livelli di MMP-9 sono importanti per il fenotipo invasivo delle cellule tumorali. Per esaminare l'effetto di chrysin sulla invasione delle cellule PMA-indotta, abbiamo esaminato l'invasione delle cellule attraverso una camera di invasione Boyden modificata. cellule AGS incubate in PMA hanno portato ad un aumento del numero di cellule invase che passavano attraverso il matrigel artificiale. Tuttavia, in presenza di chrysin o un anticorpo MMP-9, il numero di cellule invase diminuito, indicando chrysin può sopprimere l'invasività delle cellule PMA-indotta inibendo MMP-9 (Fig 4A e 4B). Inoltre, Fig 4C mostrato chrysin diminuita PMA-indotta invasione AGS in modo dose-dipendente. Successivamente abbiamo studiato l'effetto dell'inibitore di segnalazione sul PMA-indotta invasione delle cellule AGS. Come mostrato nella figura 4D, chrysin, la curcumina, PD98059 e SP600125 inibito l'invasione delle cellule indotta da PMA, indicando che chrysin probabilmente inibisce PMA-indotta MMP-9 tramite AP-1 di soppressione, che deriva da bloccare le vie JNK1 /2 e ERK1 /2 .

Discussione

composti presenti in natura con attività anti-cancro interferire con lo sviluppo del tumore e la progressione del cancro inibendo vari meccanismi tra cui la migrazione cellulare, invasione e metastasi. Chrysin, un flavonoide naturale, ampiamente presente in molti estratti vegetali, miele e propoli, ha proprietà chemiopreventive quali le attività anti-proliferativa e pro-apoptosi contro vari tipi di cancro [19,20]. Tuttavia, le proprietà anti-invasione della chrysin non sono stati ben studiati in cellule di cancro gastrico. È ben noto che MMPs sono la forza dietro la distruzione della matrice extracellulare, così come le principali induttori di invasività cellulare. Abbiamo studiato gli effetti inibitori di chrysin sull'espressione MMP nelle cellule di cancro gastrico. Chrysin inibisce MMP-9 (Fig 1) e altre MMPs come MMP-2 e MMP-7 (dati non mostrati). Il meccanismo di regolazione con chrysin può fare affidamento su ogni MMP, e in questo studio ci concentriamo sulla MMP-9 regualtion
.

PMA, forbolo-12-miristato 13-acetato, un attivatore della proteina chinasi, è comunemente usato come strumento di ricerca biomedica in modelli di carcinogenesi. In questo studio, abbiamo scoperto PMA una maggiore attività di MMP-9 attraverso upregulation del suo livello di espressione. In presenza di crisina, PMA-indotta MMP-9 è diminuito in modo chrysin dose-dipendente (Fig 1A). Tuttavia, sembra che chrysin inibisce MMP-9 non a causa di inibizione di MMP-9 attività enzimatica, ma a causa della sua soppressione di MMP-9 espressione. Per studiare il meccanismo con cui Chrysin inibisce PMA-indotta MMP-9 espressione, abbiamo cercato di scoprire il fattore di trascrizione essenziale (s) nel PMA- indotto MMP-9 pathway di espressione. E 'stato riportato che la AP-1 è il regolatore positivo della MMP: l'elemento di AP-1 che si trova tra -72 e -66 svolge un ruolo importante nella regolazione trascrizionale di MMP-1 espressione genica, e le mutazioni di questo elemento drasticamente ridurre la attività basale e la reattività della MMP-1 promotore a stimoli esterni [21]. Nel promotore upstream sequenza di regolazione MMP-9, ci sono due AP-1 siti di legame (-533 e -79), che svolgono un ruolo essenziale nel MMP-9 espressione in cellule umane Caski [22]. Nel nostro studio, oligonucleotidi AP-1 da richiamo, AP-1 inibitore curcumina, c-Jun e c-Fos siRNA interferiva con PMA-indotta MMP-9 (fig 2A-2D), che ha fornito la prova diretta che la AP-1 è critica necessario per aumentare la MMP-9 trascrizione in cellule di cancro gastrico. Sulla base dei risultati di cui sopra, si deduce che chrysin inibisce MMP-9 espressione dalla soppressione di AP-1. Fig 2E illustra la verifica della nostra speculazione: chrysin può ridurre significativamente AP-1 in modo dose-dipendente. In linea con la nostra scoperta presente che chrysin inibisce AP-1 gene bersaglio MMP-9 tramite la soppressione AP-1, è anche stato riportato che chrysin inibito altri AP-1 geni bersaglio, come VEGF, COX-2 e ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. Coerentemente con altri risultati, si è scoperto che luteolina, un flavonoide pianta con una struttura simile a chrysin, inibisce significativamente l'attività di legame del DNA indotta da LPS di AP-1 [26]. Tuttavia, la capacità inibitoria e il meccanismo di chrysin sulla AP-1 non erano state pienamente investigate prima di questo studio. Pertanto, la prossima studiato il meccanismo con cui Chrysin inibisce AP-1.

In aggiunta a mediare MMP-9 espressione, AP-1 anche sia induce l'espressione di attivatori di invasione e reprime soppressori di invasione. Come tale, AP-1 è un fattore di trascrizione essenziale per la regolazione dei geni invasivi connessi [27]. AP-1 è costituito da entrambi i omodimeri di familiari Giugno o eterodimeri tra i membri del c-Fos e famiglie c-jun. Sia c-Jun e c-Fos sono fosforilata e attivata dal ERK, p38, e sistemi di chinasi JNK [28-30]. Per studiare il meccanismo di inibizione chrysin di AP-1, abbiamo studiato c-Jun e c-Fos, i due componenti principali di AP-1. Abbiamo scoperto che chrysin inibito c-Jun e l'attivazione di c-Fos, bloccando loro rispettivi fosforilazione. Coerentemente con i nostri risultati, un po 'di letteratura precedente ha anche riferito che altri flavoni es quercetina, diminuzione AP-1 attraverso la soppressione di traslocazione di c-Jun nel nucleo [31].

Siamo stati ulteriormente interessati meccanismo inibitorio di chrysin su c-Jun e c-Fos. JNK (c-Jun N-terminale chinasi), un membro della famiglia (mitogeno-activated protein kinase) MAPK che regola una serie di processi biologici implicati nella tumorigenesi, è considerata la chinasi essenziale di attivazione c-Jun [32] . ERK, extracellulare chinasi segnalazione regolate, gioca un ruolo nella regolazione di diversi processi cellulari quali la proliferazione, la differenziazione e lo sviluppo [33], ed è stato segnalato per essere la chinasi importante che regola c-Fos attivazione [34]. Nel presente studio, troviamo prove dirette nelle cellule gastriche AGS tumorali che JNK è critica necessaria per l'attivazione di c-Jun, mentre ERK è la chinasi critica per l'attivazione di c-Fos (mostrato in figura 3D).

Based sulla conclusione di cui sopra, al fine di approfondire il meccanismo di chrysin di sopprimere MMP-9, abbiamo scoperto che chrysin aveva una capacità di bloccare JNK1 /2 e ERK1 /2 fosforilazione (Fig 3E e 3F). In accordo con questa scoperta, gli effetti inibitori di altri flavoni su ERK1 /2 anche sono stati segnalati.

Liu et al. ha riferito che l'apigenina, un flavone polifenolica (4,5,7-trihydroxyflavone), trovato in una varietà di erbe e verdure a foglia verde, inibisce la migrazione delle cellule tramite la soppressione di ERK1 /2 fosforilazione nelle cellule umane vescica muscolari lisce [35]. E 'stato anche scoperto da Ishikawa et al. che H _{2O 2 aumenta l'apoptosi, che porta alla rapida fosforilazione di JNK, ERK e p38 MAPK, mentre la quercetina può abrogare l'attivazione di questi tre MAPK in risposta ad H 2O 2 [ ,,,0],36].}

in questo studio, abbiamo studiato l'effetto inibitorio di Chrysin su MMP-9 espressione e rivelato il meccanismo di base nelle cellule di cancro gastrico AGS per la prima volta. Sulla base dei nostri risultati, si descrive un modello schematico ipotetico illustra il meccanismo di chrysin inibendo MMP-9, come mostrato in Fig 5. Ulteriori studi dovrebbero essere intraprese per verificare se vi è un enzima essenziale monte sia JNK1 /2 e ERK1 /2, il controllo critico JNK1 /2 e ERK1 /2 fosforilazione. Se è così, chrysin può interagire direttamente con l'enzima essenziale, che dovrebbe essere studiato a fondo come un potenziale anti-cancro terapeutico.

Diverse strategie terapeutiche adiuvanti per sopprimere metastasi tumorali e prevenire le recidive del tumore sono state esplorate e fornire molte opzioni per i recuperi dei pazienti. Recentemente, l'uso di sostanze fitochimiche naturali ha ricevuto ampio studio per la prevenzione del cancro [37]. Inoltre, assunzione di sostanze fitochimiche ha recentemente ricevuto attenzione nella prevenzione del cancro gastrico [38]. In questo studio, abbiamo scoperto che le cellule trattate con Chrysin possono ridurre l'invasività del cancro tramite l'inibizione di MMP-9 espressione attraverso la soppressione delle vie di segnalazione ERK /c-Fos JNK /c-Jun e. Questi risultati possono fornire elementi utili per lo sviluppo di future terapie anti-cancro per il cancro gastrico.

• PLoS ONE: perdita di espressione di Reprimo, un p53 indotta Cell Cycle arresto Gene, correla con invasiva fase di progressione tumorale e p73 espressione in cancro gastrico
• PLoS ONE: Deregulation tra miR-29b /c e dnmt3a è associato con epigenetica silenziamento del gene CDH1, che colpisce migrazione cellulare e dell'invasione di cancro gastrico