PLoS ONE: Chrysin Koči tumorske Promoter izazvan MMP-9 izraza blokiranjem AP-1 preko suzbijanje ERK i JNK ciklusa u želudac stanica raka

Sažetak pregled

invazije stanica je ključni mehanizam metastaze raka i malignih oboljenja. Matriks metaloproteinaza 9 (MMP-9) je važan proteolitički enzim koji su uključeni u proces invazije stanica raka. Visoke razine ekspresije MMP-9 u rak želuca pozitivno korelira s tumora agresivnosti i imaju značajnu negativnu korelaciju sa pacijenata vremena preživljavanja. Nedavno, mehanizmi suzbijanja MMP-9 od fitokemikalija postaju sve istražiti. Krizin, kemijski se prirodno nalaze u biljkama, objavljeno je da suprimira tumorskih metastaza. Međutim, učinci Chrysin na MMP-9 izražavanja u raka želuca nisu dobro istražena. U ovom istraživanju, testirali smo učinke krizin na MMP-9 ekspresije u želuca stanica karcinoma, i odredila temeljni mehanizam. Ispitali smo učinke krizin na MMP-9 ekspresije i aktivnosti putem RT-PCR, zimografije, promotora studija, i western blotting u ljudskim karcinoma želuca AGS stanica. Krizin inhibirana forbol-12-miristat-13-acetata (PMA) induciranu MMP-9 ekspresija na način ovisan o dozi. Korištenje AP-1 mamac oligonukleotidima, utvrdili smo da AP-1 bio je ključan transkripcijski faktor za MMP-9 izražavanja. Krizin blokiran AP-1 preko supresije fosforilacije c-Jun i c-fos kroz blokiranje JNK1 /2 i ERK1 /2 putova. Nadalje, AGS stanice su prethodno PMA izrazito pokazali poboljšana invazivnost, koji je djelomično poništava sa krizin i MMP-9 antitijela. Naši rezultati pokazuju da krizin može vršiti bar dio svoje antitumorski učinak kontroliranjem MMP-9 ekspresija kroz suzbijanje AP-1 aktivnost preko bloka od JNK1 /2 i ERK1 /2 signalni putova rak želuca AGS stanica. Pregled

Izvor: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin Sprječava Tumor Promotor izazvan MMP-9 izraza blokiranjem AP-1 preko suzbijanje ERK i JNK ciklusa u želudac stanica raka. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10,1371 /journal.pone.0124007 pregled

Akademska Urednik: Pankaj K. Singh, Sveučilište Nebraska Medical Center, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 5. listopada 2014; Prihvaćeno: 9 ožujak 2015; Objavljeno: 15. travanj 2015 pregled

Copyright: © 2015 Xia et al. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan od strane grant istraživanja (0720570) iz National Cancer Center (www.ncc.re.kr), Osnovna Science Research program dodjele bespovratnih sredstava kroz National Research Foundation of Koreja (NRF) financira Ministarstvo obrazovanja, znanosti i tehnologije (2010-0009910, www.moe.go.kr), a Medical Research Center (2012-000-9442) u iznosu od korejskog znanosti i inženjerstva Foundation ( www.nrf.re.kr). Svi gore navedeni donatori imali nikakvu ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

karcinoma želuca trenutno nalazi na drugom mjestu globalne smrtnosti od raka, s procijenjenih 990,000 novih slučajeva i 738,000 smrtnih slučajeva raka nastalih u svijetu svake godine, iako je incidencija karcinoma želuca je smanjen u posljednjih nekoliko desetljeća [1,2]. Udaljeni organa ili metastaze tkivo je znak loše prognoze u bolesnika s karcinomom želuca. Metastaza je najviše fatalna karakteristika malignih tumora, što čini više od 90% smrtnosti vezana za tumor [2]. Pokazano je da kemoterapija i zračenje ne može značajno produljiti i poboljšanje kvalitete života pacijenata u ovim slučajevima [3,4]. Tumorske stanice metastaza je vrlo složen proces se sastoji od proliferacije, migracije, invazije i kasnije prianjanje i angiogeneza u drugim organima ili tkivima. [3] pregled

Od invazije je jedno od temeljnih svojstava malignih stanica raka, kontroliranje invazija je važan terapijski cilj. Cell-izvanstanični matriks (ECM) interakcije, isključenje međustanične adhezije, degradacija ECM, a invazija limfnih i krvnih žila su važni koraci u invazije i metastaziranja raka [5]. Tumor invazija zahtijevaju povećanu ekspresiju metaloproteinaza matriksa (MMP) [6]. MMP, porodica cink ovisnih endopeptidaza koje uzrokuju invazije stanica raka i širenja, igraju ključne uloge u metastaze do razgradnje ECM-a i bazalnoj membrani [7]. Matriks metaloproteinaza 9 (MMP-9), poznat kao 92 kDa Tip IV kolagenaze-ili želatinaze B, jedan je od najznačajnijih MMP, te je kodirana od strane MMP-9 gena u ljudi. [8] On je izvijestio da prekomjerna ekspresija MMP može povećati tumorskih stanica i metastaziranje odvajanje, koje su povezane s malignosti i lošim kliničkim rezultatima u različitim oblicima raka, uključujući rak želuca [9,10]. Pregled

Zbog funkciju MMP 9 u tijeku malignosti, supresija razine MMP-9 je važna strategija za kontrolu karcinoma. U posljednjih nekoliko godina, sve više i više je pozornost usmjerena na pronalaženje inhibitor MMP-9, naročito od prirodnih materijala. Kim et al. otkrili su da silibinin inhibira PMA-induciranog MMP-9 ekspresija kroz suzbijanje ERK fosforilacije na MCF-7 stanica humanog raka dojke [11]. U novije vrijeme, Khoi et al. izvijestili da (-) - epigalokatehin-3-galat blokira nikotinom izazvan MMP-9 ekspresija i invazivnost kroz suzbijanje NF-kB i AP-1 u endotelnim stanicama ECV304 [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, vrsta prirodno pojavljuje flavonoida, je poznato da inhibiraju angiogenezu i metastaze [13,14]. Lin et al. pokazali da krizin suprimira IL-6 u angiogenezi induciranoj kroz podreguliranjem topljivog receptora IL-6 /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF signalnog puta [13]. Nedavno je objavljeno da chrysin bi mogao povećati kaspaze-ovisne apoptoze uredjena staza u HCT 116 stanične linije i CNE1 stanica [15]. Yang et al. otkrili su da potiskuju krizin invaziju stanica na način ovisan o dozi kod TNBC stanicama. Štoviše, chrysin smanjuje molekule metastaza povezanih vimentin, puž i puža, i blokira Akt signalnog puta [16]. Međutim, inhibitorni učinci krizin na MMP-9, kao i mehanizam se nije dovoljno istražena, posebno u želučanim stanice raka. U ovom istraživanju ispitivali smo učinak Chrysin o PMA-induciranog MMP-9 izražavanja kod raka želuca, a objavio svoj temeljni mehanizam. Pregled

materijali i postupci

Kultura stanica i uvjeti uzgoja pregled

AGS ljudska stanična linija karcinoma želuca dobiven je iz American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Stanice su kultivirane u RPMI-1640, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 0.6% penicilin-streptomicina, na 37 ° C u atmosferi koja je sadržavala 5% CO _{2. Za određivanje učinaka na krizin PMA induciranu ekspresiju MMP-9 stanice se predtretira s različitim koncentracijama krizin i zatim obrađena s PMA. Razina MMP-9 u RNK (mRNK) određena je lančana reakcija reverzne transkripcije polimeraze (-RT-PCR) analizom. Uloga specifičnih signalnih putova u PMA-induciranog MMP-9 ekspresija je pregledao prethodno tretirani AGS stanica s inhibitorom PD98059 ERK 1/2 (New England Biolabs, Beverly, MA), inhibitora JNK SP600125 (Calbiochem, La Jolla , CA), inhibitor p38 MAPK SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA) i krizin (Sigma Aldrich, USA) kroz 1 sat prije stimulacije s PMA,}

Stanična održivost

Stanice ( 5 × 10 ^{3) inkubirani su u 96 jažica u RPMI s 10% FBS koji sadrži 0-100 uM krizin na 24 sata, a stanična respiracija određena je uspostavljen 3- [4,5-dimetiltiazol-2 il] -2,5-difeniltetrazolij bromida (MTT; Sigma-Aldrich) analiza. Nakon inkubacije, 10 ul 5 mg /ml MTT je dodano u svaku jažicu ploče s 96 jažica s i inkubira na 37 ° C tijekom 2 sata. Formazan granule su otopljeni u 100% -tnom dimetil-sulfoksidu, a apsorbancija pri 570 nm je detektirano 96 jažica ELISA čitaču (Biotek Inc., Winooski, VT, USA). Pregled}

želatinske zimografije pregled

Stanice su prethodno, sa ili bez krizin tijekom 1 sata pomiješa se s 100 nM PMA 20 sati. Nakon inkubacije, prikupili smo medijsku supernatant i izvodi želatinu zimografije provjeriti aktivnost MMP-9. Nakon toga, medij je pomiješan sa jednakom zapreminom 2P-9 activityrazolium b [62.5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glicerol, 4% SDS, 0,01% bromfenol plavo] i napuni u akrilamid 7,5%: bisakrilamid (29: 1, Bio-Rad, USA) gel koji sadrži 625 ug /ml želatina (Sigma). Nakon elektroforeze, gel se ispere s 2,5% Triton X-100 tri puta (20 minuta po vremenu), a zatim inkubirane 24 sata na 37 ° C u puferu za inkubaciju [50 mM Tris (pH 7.5), 100 mM NaCl, 5 mM CaClz _{2, a 1p.M ZnCl 2]. Gelovi su obojani sa Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad, USA) tijekom 3 sata, a zatim isprana. Proteolitičke aktivnosti odrazilo jasne bendova protiv plavoj pozadini obojenog želatine. Učitavanja kontrolu želatinske zimografije: Coomassie Brilliant Blu R-250 boja za 10% natrijev dodecil sulfat poliakrilamid gel bez želatina, pokazati jednaku količinu supernatanta je nanesen na svaku traku pregled}

Reverzna transkripcija-PCR pregled <. p> Ukupna RNA je ekstrahirana iz stanica AGS pomoću Trizol reagensa (Invitrogen). Jedan ug ukupne RNA korištena je za prvi niti koja je komplementarna DNA sinteze pomoću nasumičnih početnika i M-MLV transkriptaze (Promega). Komplementarna DNA je podvrgnuta je PCR povećavanju u primera kompleta za GAPDH i MMP-9 pomoću PCR master mix otopina (introna Koreja). Specifični sekvence primera su kao što slijedi: GAPDH smislu, 5'-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 "i GAPDH antisense, 5'-TGA AGT CAA GGT CGT TGA GG-3 '(836 bp); i MMP-9 smislu, 5'AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT -3 'i MMP-9 antisense, 5'-TTT CCC ATC AGC GCC ATT GT-3' (497 bp); c-Jun smislu, 5'-GGA GAC AAC CTT CTA CGA TGA TGC CCTCAA-3 ', i c-Jun antisense, 5'- GAA CCC CTC CTG ATC TGT CTC CAC GTT CTT-3' (287bp); c-Fos smislu, 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 'c-Fos antisense, 5'-GAA GAT GGC TAA TGC CAA AGC ATG CCG CA-3' (246bp). PCR uvjeti su bili kao što slijedi: a. Denaturacije na 94 ° C tijekom 30 sekundi, žarenja na 52 ° C kroz 20 sekundi i ekstenzijom na 72 ° C tijekom 30 sekundi pregled

Mjerenje MMP-9 promotora pregled

transkripcijska regulacija MMP-9 je ispitana prolazne transfekcije s MMP-9 promoter-luciferaze reporterskim konstruktom (pGL4-MMP-9). Plazmid pGL4-MMP-9 promotor (u rasponu nukleotida od -925 do +13) ljubazno je od Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Koreja). AGS stanice su nasađene i raste sve dok su dosegle 70% konfluenciju. Tada su pGL4-MMP-9 promotor Plazmidi su transfecirani u stanice pomoću Fugene 6 (Promega, SAD), prema uputama proizvođača. PRL-TK je transficiran kao internom kontrolom. Stanice su bile inkubirane u mediju transfekcije 12 sati, a zatim obrađuje s PMA tijekom 4 sata. Učinci krizin na MMP-9 aktivnost promotora su određeni prethodno obrađivanje stanica s krizin tijekom 1 sata prije dodavanja PMA. Studije co-transfekcije provedene su u prisutnosti ili odsutnosti ekspresijski vektor kodira dominantno negativnog mutant MEK-1 (PMCL-K97M), dominantni negativni mutant JNK (PMCL-TAM67) ili dominantnih negativnih mutanta p38 MAPK (PMCL-mP38 ) koji su osiguran ljubaznošću Dr. NN Ahn (University of Colorado-Boulder, CO), dr M. J. Birrer (NCI, Rockville, MD) i dr J. Han (Scripps Research Institute, CA), respektivno. Stanice su sakupljene sa stanične kulture reagensom za liziranje (Promega, SAD), te luciferaze aktivnosti određuje se pomoću luminometra (Centro XS lb960 mikropločnom luminometru, Berthold Technologies, USA) prema protokolu proizvođača. Pregled

Transient transfekcija AP-1 reporter Netlogu

AP-1 reporter plazmida luciferaze je kupljen od Clontech (Palo Alto, CA, USA). Kada AGS stanice dostigle 60-70% konfluentnosti, bili su isprani s Opti-MEM mediju i transfektirane sa PGL-3 vektor koji sadrži AP-1 reporter pomoću Fugene 6 (Promega) prema protokolu proizvođača. Reporter-transfektirane stanice se predtretira s krizin 1 sat i zatim se pomiješa s 100 nM PMA tijekom 4 sata i aktivnosti luciferaze su izmjerene pomoću luminometra. Pregled

Transfekcija AP-1 mamac oligonukleotidima pregled

na temelju AP-1 vezno mjesto ATGAGTCAT, dizajnirali smo AP-1 mamac phosphorothioated dvostruke uzvojnice oligo deoxynucleotide (SNF) kako slijedi, 5'-CGsT CTT CTG AGT MAČKA GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 ', i 3 '-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5'. Kada AGS stanice narastu do 60-70% konfluence, AP-1 i ODN pGL4-MMP-9 promotor plazmidi su ko-transfektirane u stanice pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) prema protokolu proizvođača. Nakon inkubacije tijekom 20 sati, transfektirane stanice su tretirane s PMA 4 sata i aktivnosti luciferaze su izmjerene pomoću luminometra. Pregled

Western blot analiza pregled

AGS stanice tretirane PMA isperu fosfata puferirana slana otopina (PBS), odvojene od podloge koristeći tripsin-EDTA pufera, i čuva na -70 ° C do upotrebe. Stanični protein ekstrahira s RIPA puferom [1% NP-40, 0.5% natrijevog deoksikolata, 0.1% natrij dodecil sulfata (SDS)] i inhibitori proteaze (aprotinin, leupeptin, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidin, inhibitor tripsina, natrijevog ortovanadata ). Pedeset mikrograma proteina tada se odvoji pomoću 10% SDS-poliakrilamidnom gel elektroforezom i transferirana Hybond-P membrane (Amersham Pharmacia Biotech). Membrane su blokirane u otopini TBST sadrži 5% obranog mlijeka, inkubirane s primarnim protutijelom u otopina za blokiranje preko noći na 4 ° C, i ispere se tri puta s 0,1% Tween-20 u Tris puferskoj fiziološkoj otopini (TBST) u vremenskim razmacima od 10 minuta , Peroksidaza-konjugiranog sekundarnog antitijela (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) je korišten za detekciju imunoreaktivnih proteina pomoću kemiluminiscencije. Korišteni su slijedeći antitijela: anti-fosfo-P44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-fosfo-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP 9 (Cell Signaling Technology), anti-fosfo-c-Fos (Cell Signalling Technology) i anti-fosfo-c-Jun (Cell Signaling Technology). Ukupna razina proteina je ispitivana ispiranjem blotted membranu s odvajanje otopine koja se sastoji od 100 mM 2-merkaptoetanola, 2% SDS, te 62,5 mM Tris-HCl (pH 6.7) tijekom 30 minuta na 50 ° C, a membrana je bila tada ponovno ispitane s bilo anti-β-aktin (Cell Signaling Technology), anti-ukupni ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-ukupni JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) ili anti-c-Jun (Santa Cruz). pregled

Matrigelovu invaziju test pregled

test invazije stanica provedeno je upotrebom chemotasis komoru 10-i (Neuro sonda, Gaithersburg, Maryland, USA) s 8 uM pora membrane (Neuro probe) s 10% FBS je sadržavao RPMI kao kemoatraktant u donje komore. AGS stanice (10 ^{5 u 280 ul) doda se u gornju komoru s PMA u prisutnosti krizin, MMP-9 antitijela ili nespecifičnim IgG, te se inkubira na invaziju u Matrigel 24 sata. Kako bi se odredio učinak krizin i inhibitori signalizacije na PMA-induciranog stanične invazije, AGS stanice preinkubiraju sa krizin, kurkumina, PD98059, ili SP600125 1 sat, te inkubirane s PMA za invazivne razdoblja od 24 sata. Ne-invaziju stanica na gornjoj površini svakog membrane su uklonjene iz komore, a na invaziju stanica na donje površine svakog membrane obojene su s Quick-Diff mrlja kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) , Nakon dvije vode ispire, komore su ostavljene da se osuše na zraku. Broj invazivnih stanica se broji upotrebljavajući faznokontrastne mikroskopa. Pregled}

Statistika pregled

Podaci prikazani su kao srednja vrijednost ± SD, a predstavljaju prosjek od najmanje tri odvojena pokusa provedenih po tri puta. Razlike između svaka dva skupa podataka određene su pomoću t-testa. Razlike opisane kao značajne u tekstu odgovarati P pregled. ≪ 0,05 pregled

Rezultati

Inhibicijski učinak Chrysin na PMA stimulirana MMP-9 ekspresija pregled

da se istraži supresivni učinak krizin protiv upregulation MMP-9, AGS stanice su prethodno krizin su inkubirani s PMA, koji su izvršeni želatinske zimografije i RT-PCR analize. Kao što je prikazano na slici 1A, PMA-stimuliranih MMP-9 je inhibirana krizin na način ovisan o dozi, kao što je prikazano preko testu želatinske zimografije. Neposredno prije pokusa bilo krizin izravno inhibira aktivnost MMP-9 ili inhibira ekspresiju MMP-9 je još nepoznata. Za odgovor na to pitanje, ko-inkubirani u AGS-izlučuju MMP-9 sa Chrysin 3 sata i želatina zimografiia je provedeno za provjeru konačnog iznosa MMP-9. Kao Slika 1B prikazuje, chrysin nije mogao prouzročiti izlučuje MMP-9. Dakle, pretpostavili smo da inhibiranje krizin protiv MMP-9 može biti preko potiskivanja MMP-9 ekspresiju. Da biste potvrdili ovu hipotezu, obrnuti transkripcije PCR i MMP-9 promotor ispitivanja vrše se za provjeru razine MMP-9 transkripcije. Kao što je prikazano na slici 1C, poslije tretmana sa krizin, PMA-induciranog MMP-9 mRNA smanjena na način ovisan o dozi. Nadalje, MMP-9 aktivnost promotora luciferaze je inhibirana krizin na način ovisan o dozi (Slika 1D). I western bloting također pokazuju inhibicijski učinak na krizin MMP-9 ekspresija (Slika 1E). Koncentracije krizin korištene u ovom istraživanju nije utjecala na vijabilnost stanica (Slika 1F). Ovi rezultati pokazuju da krizin inhibira MMP-9 u AGS stanicama putem redukcije transkripcije učinkovitosti. Pregled

Uloga AP-1 u PMA-induciranog MMP-9 ekspresija pregled

Kao što je izvijestio prethodna književnost, AP-1 je najvažniji faktor transkripcije MMP-9 izrazu [17]. U ovom istraživanju, kako bi potvrdili da AP-1 kritički je potrebno u ovom tečaju, zaposleni smo AP-1 mamac phosphorothioated dvostruke uzvojnice oligodeoxynucleotide (SNF) i pGL3-AP-1 plazmida luciferaze co-transfckciju u AGS stanice. Co-transfektirane stanice su tretirane s PMA, a luciferaze aktivnosti određuje se pomoću luminometra. Kao što je prikazano na slici 2A, PMA-inducirana aktivnosti MMP-9 promotor luciferaze se inhibira AP-1 mamac. Dosljedno, AP-1 mamac također inhibira PMA-induciranog MMP-9 ekspresija mRNA (Slika 2B). Pokazano je da rušeći AP-1 komponentu c-fos i c-jun je smanjio PMA-induciranog MMP-9 ekspresija (Slika 2C). Štoviše, kurkumin, AP-1 inhibitor, također je korišten za provjeru ulogu AP-1 u PMA-induciranog MMP-9 ekspresiju. I podatke RT-PCR ilustrira, kurkumin inhibirana PMA-induciranog MMP-9 ekspresija na način ovisan o dozi (Slika 2D). Gore navedeni podaci pokazuju da AP-1 je ključni čimbenik u MMP-9 ekspresiju. Nakon što pokazuje ključnu ulogu AP-1 u visokim razinama MMP-9 izražavanja, pretpostavili smo da je mehanizam Chrysin inhibicije MMP-9 izražavanja bilo kroz suzbijanje AP-1 aktivnost. Nakon toga, AGS stanice transfektirane sa AP-1 Luciferaze plazmida su tretirani sa krizin i zatim stimulirane PMA. Kao što je prikazano na slici 2E, krizin potiskuje PMA-induciranog AP-1lucifease aktivnost na način koji ovisi o dozi, što ukazuje da chrysin ima sposobnost da smanji AP-1 aktivnost. Pregled

Chrysin inhibira PMA-induciranog MMP-9 ekspresija inhibirajući faktor transkripcije AP-1 preko potiskivanja c-jun i c-fos za fosforilaciju

poznato je da c-Jun i c-Fos su komponente AP-1 puta [18]. Željeli smo utvrditi mehanizam iza inhibitorni učinak Chrysin-a na AP-1, a istraživao je li chrysin stvarno je pokazao svoj utjecaj na c-jun i c-fos. Izmjerili smo količinu ukupnog mRNA oba c-jun i c-fos pomoću RT-PCR. Kao što je prikazano na slici 2F, krizin ne inhibira razine ekspresije c-jun i c-Fos mRNA. Dalje, za testiranje ako krizin inhibira aktivaciju c-Jun i c-fos, western blot ispitivanje je provedeno pratiti fosforiliranog c-Jun i c-fos. Slika 2G i 2F pokazuje da krizin je suzbiti PMA-induciranog c-jun i c-fos fosforilaciju na način ovisan o dozi. Pregled

Chrysin inhibira c-jun i c-fos fosforilaciju blokiranjem JNK i ERK signalizaciju put pregled

sljedeći istražuju kako chrysin potisnut c-jun i c-fos fosforilaciju. S obzirom na važnu ulogu MAPK predstava u aktivaciji AP-1, istražili smo ulogu MAPK putanje u MMP-9 izražavanja. Kao što je prikazano na slici 3A između inhibitora MAP kinaze, PD98059 (ERK1 /2 inhibitor), SP600125 (JNK1 /2 inhibitor) i SB203580 (MAPK inhibitor p38) samo PD98059 i SP600125 su sposobni da inhibiraju PMA-induciranog MMP-9 ekspresija , što ukazuje da su ERK1 /2 i JNK1 /2 putevi mogu biti od presudne važnosti za PMA-induciranog MMP-9 izražavanja. Nadalje, s MEK-dominantnog negativnog plazmida PMCL-K97M, negativan plazmid JNK-dominantna PMCL-TAM67 i p38 MAPK-dominantni negativni plazmid PMCL-mP38 utvrdili smo kritične uloge ERK i JNK u MMP-9 izražavanja kod raka želuca AGS stanice (Slika 3B). Osim toga, kako je prikazano na slici 3C, ERK1 /2 i JNK1 /2 kritično potrebni za AP-1 aktivacije PMA pokazali putem eksperimenta s MEK i JNK dominantnih negativnih plazmida. Sljedeće smo provjerili uloge JNK1 /2, i ERK1 /2, c-Jun i aktivaciju c-fos. Kao što je prikazano na slici 3D SP600125 i PD98059 potiskuje PMA-induciranog c-jun i c-fos fosforiliranje, odnosno, što ukazuje da JNK1 /2 kritično uzvodno od c-Jun, a ERK1 /2 kritično uzvodno od c-fos. Budući da smo otkrili da JNK1 /2 i ERK1 /2 započela bitne uloge u MMP-9 ekspresije preko AP-1, pretpostavili smo da krizin mogu raditi preko inhibicije JNK1 /2, i ERK1 /2 za suzbijanje MMP-9 ekspresija. Da biste potvrdili našu hipotezu, western blot ispitivanje je provedeno kako bi se utvrdilo djelovanje Chrysin na JNK1 /2 ili ERK1 /2 fosforilacije. Kao Sl 3E i 3F show, PMA liječenje dovelo do izvanredne povećanja JNK1 /2 i ERK P42 /44 fosforilacije; Međutim, u prisutnosti krizin, PMA-induciranog JNK1 /2 i ERK1 /2 fosforilacije je spriječeno na način ovisan o dozi. pregled

Učinak krizin na staničnu invazivnosti pregled

Poznato da visoke razine MMP-9 ekspresija je važno za invazivne fenotip stanica raka. Ispitati učinak krizin na PMA-induciranog invazije stanica, ispitali smo staničnu invaziju pomoću modificiranog Boyden invazijske komore. AGS stanice inkubira u PMA rezultirao povećanim brojem napali stanica koje su prošli kroz umjetnu Matrigel. Međutim, u prisutnosti krizin ili MMP-9 antitijela, broj je napao stanice smanjena, što ukazuje krizin može suzbiti PMA-induciranu staničnu invazivnost inhibicijom MMP-9 ekspresija (Slika 4A i 4B). Osim toga, slika 4C je pokazala smanjeni krizin PMA-induciranog AGS invaziju na način ovisan o dozi. Dalje, istražili smo učinak inhibitora signalizaciju PMA-induciranog invazije AGS stanica. Kao što je prikazano na slici 4D, krizin, kurkumin, PD98059 i SP600125 inhibirao staničnu invaziju induciranu PMA, što ukazuje da krizin vjerojatno inhibira PMA-induciranog MMP-9 pomoću AP-1 potiskivanje, koja proizlazi iz blokiranje JNK1 /2 i ERK1 /2 putova . pregled

Rasprava pregled

Prirodni spojevi s anti-kancerogeno djelovanje ometa razvoj tumora i napredovanja raka inhibicijom različite mehanizme uključujući migraciju stanica, invaziju i metastaziranje. Krizin, prirodni flavonoid široko nalaze u brojnim biljnim ekstraktima, meda i propolisa ima kemoprevencijske svojstva kao što je djelovanje protiv proliferativnih i pro-apoptoze protiv različitih karcinoma [19,20]. Međutim, protiv invazija svojstva Chrysin nisu dobro studirao u želučanim stanicama raka. Dobro je poznato da su MMP snaga uništenja ekstracelularnog matriksa, kao glavni induktori stanične invazivnosti. istraživali smo inhibitorske učinke krizin na ekspresiju MMP u stanicama raka želuca. Krizin inhibirana MMP-9 ekspresija (Slika 1) i druge MMP, kao što su MMP-2 i MMP-7 (podaci nisu prikazani). Mehanizam regulacija Chrysin može ovisio o svakoj MMP, au ovom istraživanju ćemo se usredotočiti na MMP-9 regualtion. Pregled

PMA, forbol-12-miristat-13-acetat, aktivator protein kinaze, obično se koristi kao biomedicinskih istraživanja alat u modelima karcinogeneze. U ovom istraživanju, otkrili smo PMA povećava MMP-9 do podizanja regulacije njegove razine ekspresije. U nazočnosti krizin, PMA-induciranog MMP-9 na način smanjio krizin-ovisan o dozi (Slika 1A). Međutim, čini se da krizin inhibira MMP-9 ne zbog inhibicije MMP-9 aktivnosti enzima, ali zbog potiskivanja MMP-9 ekspresiju. Da bi istražili mehanizam kojim chrysin inhibira PMA-induciranog MMP-9 izraz, pokušali smo otkriti bitne transkripcijski faktor (e) u PMA- inducirane MMP-9 izražavanja putem. To je izvijestio da je AP-1 je pozitivan regulator MMP: AP-1 element koji se nalazi između -72 i -66 igra važnu ulogu u regulaciji transkripcije ekspresije MMP-1 gena i mutacije ovog elementa dramatično smanjiti Osnovna aktivnost i odgovornost prema MMP-1 promotora na vanjske podražaje [21]. Na promotorsku uzvodno regulacije sekvence MMP-9, postoje dva AP-1 vezna mjesta (-533 i -79), koji igraju osnovne uloge za MMP-9 ekspresije u ljudskim stanicama CaSki [22]. U našoj studiji, AP-1 mamac oligonukleotidima, AP-1 inhibitora Kurkumin, c-jun i c-Fos siRNA ometao PMA-induciranog MMP-9 izražavanja (Slika 2A-2D), koja je dala izravan dokaz da je AP-1 je kritično potrebno povećati MMP-9 u transkripciju želuca stanica raka. Na temelju navedenih rezultata, zaključuje se da chrysin inhibira MMP-9 ekspresija suzbijanje AP-1 aktivnost. Slika 2E prikazuje provjeru našeg spekulacija: krizin može značajno smanjiti AP-1 aktivnost na način koji ovisi o dozi. U skladu s našim ovog otkrića da krizin inhibira AP-1 ciljnog gena MMP-9 pomoću suzbijanju AP-1 aktivnost, također je objavljeno da krizin inhibiran vrstu AP-1 ciljnih gena, kao što su VEGF, COX-2 i ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. U skladu s drugim nalazima, otkriveno je da luteolin, biljka flavonoid sa sličnom strukturom u krizin, značajno inhibira LPS-izazvanu aktivnosti vezanja na DNA AP-1 [26]. Međutim, inhibicijski sposobnost i mehanizam krizin AP-1 nije bio u potpunosti istraženi prije studije. Stoga, sljedeći je proučavao mehanizam kojim chrysin inhibira AP-1. Pregled

Uz posredovanje MMP-9 izraz, AP-1 također i izaziva izlučivanje aktivatora invazije i potiskuje invazije uklanjanje smetnji. Kao takav, AP-1 je bitan transkripcijski faktor za regulaciju invazivnih vezanih gena [27]. AP-1 sastoji se od bilo dimeri članova lip obitelji ili heterodimera između članova c-fos i c-Jun obitelji. I c-Jun i c-Fos fosforilirana i aktivirana od ERK, p38 i JNK kinaze sustava [28-30]. Da bi se istražilo mehanizam Chrysin inhibicije AP-1, istražili smo c-jun i c-fos, dvije glavne komponente AP-1. Mi smo otkrili da krizin inhibiran c-jun i c-fos aktivacija blokiranjem njihove odgovarajuće fosforilaciju. U skladu s našim saznanjima, neki prethodni literatura je također izvijestio da drugi flavona npr kvercetin, smanjen AP-1 aktivnost kroz potiskivanje c-Jun-a translokacije u jezgru [31]. pregled

Bili smo i dalje zainteresirani za inhibitorni mehanizam Chrysin je na c-jun i c-fos. JNK (c-Jun N-terminal kinaza), član MAPK (mitogenski aktivirane protein kinaze) obitelji koji regulira niz bioloških procesa implicirano u tumorogenezi, smatra se bitno kinaze c-Jun aktivacije [32] , ERK, ekstracelularne signalne regulirane kinaze ima značajnu ulogu u regulaciji različitih staničnih procesa, kao što je proliferacija, diferencijacija i razvoj [33], a objavljeno je da su važne kinaze regulira c-fos aktivacija [34]. U ovom istraživanju, nalazimo izravne dokaze u rak želuca AGS stanica koje JNK kritički je potrebno za c-Jun aktivacije, dok ERK je kritična kinaza za c-Fos aktivacije (prikazan na slici 3D). Pregled

Like na gornji zaključak, kako bi se dodatno istraži krizin mehanizam supresije MMP-9, otkrili smo da krizin imali mogućnost blokiranja JNK1 /2 i ERK1 /2 fosforilaciju (Slika 3E i 3F). U skladu s ovim nalazom, inhibitorni učinci drugih flavona na ERK1 /2, također su opisani. Pregled

Liu et al. izvijestio da apigenin, A polifenolni flavone (4,5,7-trihydroxyflavone), naći u različitim bilja i zelenog lisnatog povrća, inhibira migraciju stanica preko suzbijanje ERK1 /2 fosforilacije u ljudskim stanicama glatkih mišića mokraćnog mjehura [35]. Također je otkrivena Ishikawa et al. da H _{2O 2 povećava apoptoze, što dovodi do brzog fosforilacije JNK, ERK i p38 MAPK, dok kvercetin može ukinuti aktivaciju tih triju MAPK odgovor H 2O 2 [ ,,,0],36]. pregled}

u ovoj studiji istraživali smo inhibitorni učinak Chrysin na MMP-9 izražavanja i otkrio temeljni mehanizam u rak želuca AGS stanica po prvi put. Na temelju naših saznanja, opisuju hipotetski shematski modela koji prikazuje mehanizam Chrysin inhibirajući MMP-9 izraz, kao što je prikazano na slici 5. Daljnja istraživanja trebaju biti poduzete kako bi istražili da li postoji bitna enzima uzvodno od oba JNK1 /2 i ERK1 /2, kritički kontrolu JNK1 /2 i ERK1 /2 fosforilaciju. Ako je tako, chrysin mogu izravno komunicirati s bitnom enzima, koji bi trebao biti temeljito istražena kao potencijalni anti-raka terapijskog. Pregled

Razne adjuvantne terapijske strategije za suzbijanje metastaza i spriječiti ponavljanje tumora su istraženi i pružaju mnogo mogućnosti za povratima pacijenata. Nedavno je korištenje prirodnih fitokemikalija je dobio opsežnu studiju za prevenciju raka [37]. Osim toga, prehrambene unos fitokemikalija nedavno dobila pozornost u želučanom prevenciji raka [38]. U ovom istraživanju, otkrili smo da stanice Chrysin liječenih može smanjiti raka invazivnosti putem inhibira MMP-9 izražavanje kroz suzbijanje JNK /c-Jun i ERK /c-Fos signalizacije. Ovi rezultati mogu pružiti korisne dokaze za razvoj budućih terapijskih protiv raka za rak želuca. Pregled

• PLoS ONE: Gubitak iskazivanje Reprimo, p53 izazvanog staničnog ciklusa Gene, korelira s invazivnom stadiju napredovanja tumora i p73 izražavanja u želučani Cancer
• PLoS ONE: Deregulacija između Mir-29b /c i DNMT3A je povezana s Epigenetske utišavanje od CDH1 gena, koji utječu na mobitel migraciju i invaziju u želučanom Cancer