PLoS ONE: Chrysin Remt Tumor-Promoter Induced MMP-9 Expressie door het blokkeren van AP-1 via Onderdrukking van ERK en JNK Pathways bij maagkanker Cells

Abstract

Mobiele invasie is een cruciaal mechanisme van kanker metastase en maligniteit . Matrix metalloproteïnase-9 (MMP-9) een belangrijke proteolytische enzym betrokken bij de kankercel invasie proces. Hoge expressie niveaus van MMP-9 bij maagkanker positief correleren met de tumor agressiviteit en hebben een significante negatieve correlatie met de patiënten 'survival tijden. Onlangs mechanismen onderdrukken MMP-9 door fytochemicaliën hebben steeds meer worden onderzocht. Chrysin, een natuurlijke chemische in planten, is beschreven dat tumormetastase onderdrukken. De effecten van chrysin MMP-9 expressie bij maagkanker zijn niet goed bestudeerd. In de onderhavige studie testten wij het effect van chrysin op MMP-9-expressie in maagkanker cellen en bepaalden de onderliggende mechanismen. We hebben gekeken naar de effecten van chrysin op MMP-9 expressie en activiteit via RT-PCR, zymografie, promotor studie, en western blotting in menselijke maagkanker AGS cellen. Chrysin remde forbol-12-myristaat 13-acetaat (PMA) geïnduceerde MMP-9 expressie op een dosis-afhankelijke wijze. Middels AP-1 decoy oligonucleotiden bevestigden we dat AP-1 is de cruciale transcriptiefactor voor MMP-9 expressie. Chrysin geblokkeerd AP-1 via onderdrukking van de fosforylering van c-Jun en c-Fos tot het blokkeren van de JNK1 /2 en ERK1 /2 wegen. Bovendien toonde AGS cellen voorbehandeld met PMA duidelijk versterkte invasiviteit, die gedeeltelijk werd geschrapt bij chrysin en MMP-9 antilichaam. Onze resultaten suggereren dat chrysin ten minste een deel van het antikanker effect kan uitoefenen door het regelen van MMP-9 tot expressie onderdrukking van AP-1 activiteit via een blok van de JNK1 /2 en ERK1 /2 signaalwegen in maagkanker AGS cellen.

Visum: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin Remt Tumor Promoter-Induced MMP-9 Expressie door het blokkeren van AP-1 via Onderdrukking van ERK en JNK Pathways bij maagkanker Cells. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10.1371 /journal.pone.0124007

Academic Editor: Pankaj K. Singh, Universiteit van Nebraska Medical Center, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 5 oktober 2014; Aanvaard: 9 maart 2015; Gepubliceerd: 15 april 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksbeurs (0720570) van het National Cancer Center (www.ncc.re.kr), Basic Science Research Program subsidie ​​door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (2010-0009910, www.moe.go.kr), en een Medical Research Center (2012-000-9442) subsidie ​​van de Koreaanse Science and engineering Foundation ( www.nrf.re.kr). Alle bovenstaande financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

introductie

Maagkanker staat momenteel tweede in de wereldwijde sterfte van kanker, met een geschatte 990.000 nieuwe gevallen en 738.000 doden door kanker als gevolg wereldwijd per jaar, hoewel de incidentie van maagkanker is afgenomen in de afgelopen decennia [1,2]. Distant orgaan of weefsel metastase is een teken van slechte prognose bij patiënten met maagkanker. Metastase is de meest dodelijke kenmerk van kwaadaardige tumoren, die meer dan 90% van tumor-gerelateerde sterfgevallen [2]. Het is aangetoond dat chemotherapie en radiotherapie kunnen niet significant verlengen en de kwaliteit van leven van patiënten die gevallen [3,4]. Tumorcellen metastase is een zeer complex proces bestaande uit proliferatie, migratie, invasie en de daaropvolgende aanhechting en angiogenese in andere organen of weefsels [3].

Omdat invasie is een van de fundamentele eigenschappen van kwaadaardige kankercellen, het beheersen van de invasie, is een belangrijk therapeutisch doel. Cel-extracellulaire matrix (ECM) interactions, onderbreking van intercellulaire adhesie, afbraak van de ECM en de invasie van lymfe- en bloedvaten zijn belangrijke stappen bij kanker en metastase [5]. Tumorinvasie vereist een verhoogde expressie van matrix metalloproteïnasen (MMPs) [6]. MMPs, een familie van zink-afhankelijke endopeptidasen die kankercel invasie en verspreiding induceren cruciale rol in metastase door de afbraak van de ECM en basaal membraan [7]. Matrix metalloproteïnase-9 (MMP-9), bekend als 92 kDa type IV collagenase en gelatinase B, is een van de belangrijkste MMPs, en wordt gecodeerd door de MMP-9 gen bij mensen [8]. Er werd gemeld dat overexpressie van MMP tumorcel onthechting en metastase die zijn geassocieerd met kanker en slechte klinische resultaten bij verschillende kankersoorten zoals maagkanker [9,10] kan verhogen.

Door de functie van MMP 9 tijdens maligniteit, de onderdrukking van MMP-9 niveaus is een belangrijke strategie voor kankerbestrijding. In de afgelopen jaren is er meer en meer aandacht besteed aan het vinden van een MMP-9 inhibitor, vooral uit natuurlijke materialen. Kim et al. ontdekte dat silibinin remt PMA geïnduceerde MMP-9 tot expressie onderdrukking van ERK fosforylatie in MCF-7 humane borstkankercellen [11]. Recenter Khoi et al. gemeld dat (-) - Epigallocatechin-3-gallaat blokken nicotine geïnduceerde MMP-9 expressie en invasiviteit door het vernietigen van NF-KB en AP-1 in endotheliale ECV304 cellen [12]. Chrysin, 5,7-Dihydroxyflavone, een soort natuurlijk voorkomend flavonoïde, is bekend dat angiogenese en metastase [13,14] te remmen. Lin et al. aangetoond dat chrysin onderdrukt IL-6 geïnduceerde angiogenese door neerwaartse regulatie van de oplosbare IL-6 receptor /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF signaleringsroute [13]. Onlangs is gemeld dat chrysin de caspase-afhankelijke apoptose gereguleerd door TRAIL in HCT 116 cellijn en CNE1 cellen [15] zou kunnen vergroten. Yang et al. ontdekt dat chrysin onderdrukt invasie in een dosisafhankelijke wijze TNBC cellen. Bovendien vermindert chrysin metastase gerelateerde moleculen vimentine, slak en slak, en blokkeert de Akt signaleringsroute [16]. De remmende effecten van chrysin MMP-9, en het mechanisme niet goed bestudeerd, met name bij maagkanker cellen. In de huidige studie hebben we onderzocht effecten chrysin op PMA-geïnduceerde MMP-9 expressie bij maagkanker, en onthulde de onderliggende mechanisme.

Materialen en methoden

Cell cultuur en kweekomstandigheden

de AGS menselijke maagkanker cellijn werd verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De cellen werden gekweekt in RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 0,6% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een atmosfeer die 5% CO _{2. Om de effecten van chrysin op PMA geïnduceerde MMP-9-expressie te bepalen, werden de cellen voorbehandeld met verschillende concentraties chrysin en vervolgens behandeld met PMA. Het niveau van MMP-9 messenger RNA (mRNA) werd bepaald door reverse transcriptie-polymerase kettingreactie analyse (RT-PCR). De rol van de specifieke signaalwegen in de PMA geïnduceerde MMP-9-expressie werd onderzocht door voorbehandelen van de cellen met de AGS ERK 1/2 inhibitor PD98059 (New England Biolabs, Beverly, MA), de JNK inhibitor SP600125 (Calbiochem, La Jolla , CA), de p38 MAPK remmer SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA), en chrysin (Sigma-Aldrich, USA) gedurende 1 uur voor stimulatie met PMA.}

Cellevensvatbaarheid

Cells ( 5 x 10 ^{3) werden in een 96-putjesplaat in RPMI met 10% FBS bevattende 0-100 uM chrysin gedurende 24 uur, en celademhaling werd bepaald door een gevestigde 3- [4,5-dimethylthiazol-2 yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT; Sigma-Aldrich) test. Na de incubatie werd 10 gl van 5 mg /ml MTT werd aan elk putje van de 96-well platen toegevoegd en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur. De formazan verkregen korrels werden opgelost in 100% dimethylsulfoxide, en de absorptie bij 570 nm werd gedetecteerd met een 96-gats ELISA reader (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).}

Gelatine zymografie

Cellen voorbehandeld met of zonder Chrysin gedurende 1 uur behandeld met 100 nM PMA gedurende 20 uur. Na incubatie, verzamelden we de media supernatant en uitgevoerd gelatine zymografie aan de MMP-9-activiteit te controleren. Vervolgens werd het medium gemengd met een gelijk volume 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glycerol, 4% SDS, en 0,01% broomfenolblauw] en een 7,5% acrylamide geladen: bisacrylamide (29: 1, Bio-Rad, USA) gel bevattende 625 ug /ml gelatine (Sigma). Na elektroforese werd de gel gewassen met 2,5% Triton X-100 driemaal (20 minuten per keer), vervolgens gedurende 24 uur bij 37 ° C, in de incubatiebuffer [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl _{2, en 1 pM ZnCl 2]. Gels werden gekleurd met Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) gedurende 3 uur en daarna gespoeld. Proteolytische activiteit werd weergegeven als duidelijke banden tegen de blauwe achtergrond van de gekleurde gelatine. Controle van de belasting voor gelatine zymografie: Coomassie Brilliant Blue R-250 kleuring van 10% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel zonder gelatine, gelijke hoeveelheid supernatant tonen werd op elke laan}

Omgekeerde transcriptie-PCR
<. p> Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de cellen met behulp AGS TRIzol reagens (Invitrogen). Eén ug totaal RNA werd gebruikt voor eerste streng complementair DNA-synthese met behulp van willekeurige primers en M-MLV transcriptase (Promega). De complementaire DNA werd onderworpen aan PCR amplificatie met primersets voor GAPDH en MMP-9 met behulp van een PCR master mix oplossing (Intron, Korea). De specifieke primers sequenties waren als volgt: GAPDH sense, 5'-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 'en GAPDH antisense, 5'-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 bp); en MMP-9 sense, 5'-AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT -3 en MMP-9 antisense, 5'-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3 '(497 bp); c-Jun sense, 5'-GGA AAC CTT GAC CTA CGA TGA TGC CCTCAA-3 ', en c-Jun antisense, 5'-GAA CCC CTC CTC CTG ATC TGT CTT CAC GTT-3' (287bp); c-Fos sense, 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 en c-Fos antisense, 5'-GAA GAT TAA TGC GGC AGC CAA ATG CCG CA-3 '(246bp). De PCR condities waren als volgt:. Denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 seconden, hybridisatie bij 52 ° C gedurende 20 seconden en verlenging bij 72 ° C gedurende 30 seconden

Meting van MMP-9 promoteractiviteit

de transcriptionele regulatie van MMP-9 werd onderzocht door de tijdelijke transfectie van een MMP-9 promotor-luciferase reporter construct (pGL4-MMP-9). Het plasmide pGL4-MMP-9 promoter (verspreid over nucleotiden van -925 tot 13) werd vriendelijk verschaft door Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Korea). AGS-cellen werden gezaaid en gekweekt totdat ze 70% samenvloeiing bereikt. Vervolgens werden de pGL4-MMP-9 promoter plasmiden getransfecteerd in de cellen met behulp van FuGENE 6 (Promega, USA) volgens het protocol van de fabrikant. PRL-TK werd getransfecteerd als een interne controle. Cellen werden geïncubeerd in het transfectie medium voor 12 uur en vervolgens behandeld met PMA gedurende 4 uur. De effecten van chrysin MMP-9 promoteractiviteit werden bepaald door voorbehandeling van cellen met chrysin gedurende 1 uur voorafgaand aan de toevoeging van PMA. De co-transfectie studies werden uitgevoerd in de aanwezigheid of afwezigheid van de expressievector codeert voor het dominant negatieve mutant MEK-1 (PMCL-K97M), dominant negatieve mutant JNK (PMCL-TAM67) of dominant negatieve mutant p38 MAPK (PMCL-MP38 ) die vriendelijk werd verschaft door Dr. NG Ahn (Universiteit van Colorado-Boulder, CO), door dr M.J. Birrer (NCI, Rockville, MD), en door Dr. J. Han (Scripps Research Institute, CA), respectievelijk. De cellen werden geoogst met een celkweek lysis reagens (Promega, USA) en de luciferase activiteiten werden bepaald met een luminometer (Centro XS lb960 microplaat luminometer, Berthold Technologies, USA) volgens het protocol van de fabrikant.

Transient transfectie van AP-1 reporter

De AP-1 luciferase reporterplasmide werd gekocht bij Clontech (Palo Alto, CA, USA). Wanneer AGS cellen bereikte 60-70% confluentie, werden zij gewassen met Opti-MEM medium en getransfecteerd met pGL-3 vector die de AP-1 reporter gebruikt FuGENE 6 (Promega) volgens het protocol van de fabrikant. -Reporter getransfecteerde cellen werden voorbehandeld met chrysin gedurende 1 uur en vervolgens behandeld met 100 nM PMA gedurende 4 uur en de luciferase- activiteiten werden gemeten met een luminometer.

Transfectie van AP-1 decoy oligonucleotiden

gebaseerd op de AP-1 bindingsplaats ATGAGTCAT, ontwierpen we de AP-1 decoy phosphorothioated dubbelstrengs oligo deoxynucleotide (ODNs) als volgt 5'-CGsT CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG Amway Klant Tevredenheidsgarantie-3 'en 3 '-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5'. Wanneer de AGS cellen gegroeid tot 60-70% confluentie, AP-1 en ODNs pGL4-MMP-9 promoter plasmiden werden gecotransfecteerd in cellen met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Na incubatie gedurende 20 uur werden de getransfecteerde cellen behandeld met PMA gedurende 4 uur en de luciferase- activiteiten werden gemeten met een luminometer.

Western blotanalyse

AGS cellen behandeld met PMA werden gewassen in fosfaat gebufferde saline (PBS), vrijstaande middels trypsine-EDTA-buffer, en opgeslagen bij -70 ° C totdat ze nodig. Het cellulair eiwit werd geëxtraheerd met RIPA buffer [1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS)] en proteaseremmers (aprotinine, leupeptine, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidine, trypsineremmer, natriumorthovanadaat ). Vijftig microgram van de eiwitten werd vervolgens gescheiden door 10% SDS-polyacrylamide gelelektroforese en overgebracht op Hybond-P membranen (Amersham Pharmacia Biotech). De membranen werden driemaal geblokkeerd in een TBST oplossing die 5% magere melk, geïncubeerd met een primair antilichaam in een blokkerende oplossing overnacht bij 4 ° C en gewassen met 0,1% Tween-20 in Tris gebufferde zoutoplossing (TBST) van 10 minuten . Mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) werd gebruikt om de immunoreactieve eiwitten gedetecteerd door chemiluminescentie. De volgende antilichamen werden gebruikt: anti-fosfo-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-fosfo-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP 9 (Cell Signaling Technology), anti-fosfo-c-Fos (Cell Signaling Technology), en anti-fosfo-c-Jun (Cell Signaling Technology). De totale eiwitniveaus werden bepaald door het wassen van de geblotte membraan met een stripoplossing bestaat uit 100 mM 2-mercaptoethanol, 2% SDS en 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) gedurende 30 minuten bij 50 ° C, en het membraan werd vervolgens opnieuw gesondeerd met hetzij het anti-β-actine (Cell Signaling Technology), anti-totaal ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-total JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) of anti-c-Jun (Santa Cruz).

Matrigel invasie assay

de cel invasie test werd met behulp van de 10-well chemotasis kamer uitgevoerd (Neuro probe, Gaithersburg, Maryland, USA) met 8 pM porie membraan (Neuro probe) met 10% FBS bevattend RPMI de chemoattractant in de onderste kamer. AGS cellen (10 ^{5 in 280 gl) werden aan bovenkamer met PMA in aanwezigheid van chrysin, MMP-9 antilichaam of niet-specifieke IgG en geïncubeerd met de Matrigel invasie gedurende 24 uur. Om het effect van chrysin en signalering remmers op PMA geïnduceerde celinvasie bepalen AGS-cellen werden vooraf geïncubeerd met chrysin, curcumin, PD98059 of SP600125 gedurende 1 uur en geïncubeerd met PMA gedurende de 24 uur periode invasie. De niet-binnendringende cellen op het bovenoppervlak van elk membraan werden uit de kamer verwijderd en de binnenvallende cellen op het onderoppervlak van elk membraan werden gekleurd met Quick-Diff vlek kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Na twee water wassen, werden de kamers aan de lucht drogen. Het aantal binnendringende cellen werd geteld met behulp van een fasecontrastmicroscoop.}

Statistieken

De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en stellen het gemiddelde van ten minste drie afzonderlijke experimenten uitgevoerd in drievoud. Verschillen tussen elke twee gegevenssets werden bepaald door t-testen. Verschillen beschreven als significant in de tekst komen overeen met P
. ≪ 0.05

Resultaten

remmende effect van chrysin op de PMA gestimuleerde MMP-9 expressie

aan het onderdrukkende effect van chrysin tegen de opregulatie van MMP-9 te testen werden cellen voorbehandeld met AGS chrysin geïncubeerd met PMA en gelatine zymografie en RT-PCR-analyse uitgevoerd. Zoals getoond in figuur 1A, PMA-gestimuleerde MMP-9 werd geremd door Chrysin op een dosis-afhankelijke manier zoals afgebeeld via de gelatine zymografie assay. Voor ons experiment, hetzij rechtstreeks chrysin remde de activiteit van MMP-9 en remde de expressie van MMP-9 is nog onbekend. Om deze vraag te beantwoorden, we co-bebroede de AGS-afgescheiden MMP-9 met chrysin 3 uur, en gelatine zymografie werd uitgevoerd om het uiteindelijke niveau van MMP-9-activiteit te controleren. Zoals figuur 1B toont, kon chrysin geen invloed afgescheiden MMP-9 activiteiten. Dus veronderstelden we dat de remming van chrysin tegen MMP-9 kan via onderdrukking van MMP-9 expressie. Om deze hypothese te controleren, reverse transcriptie PCR en MMP-9 promoter bepalingen werden uitgevoerd op de MMP-9 transcriptie te controleren. Zoals getoond in figuur 1C, na behandeling met chrysin de PMA geïnduceerde MMP-9 mRNA verlaagd in een dosis-afhankelijke wijze. Bovendien werd MMP-9 promoter luciferaseactiviteit geremd door Chrysin op een dosis-afhankelijke wijze (Figuur 1D). En Western blotting toonde ook het remmende effect van chrysin MMP-9 expressie (figuur 1E). De concentraties van chrysin gebruikt in deze studie geen invloed levensvatbaarheid van de cellen (Figuur 1F). Deze resultaten geven aan dat chrysin remt MMP-9-activiteit in AGS cellen via een verlaging van de transcriptie efficiëntie.

Rol van AP-1 in PMA geïnduceerde MMP-9 expressie

Zoals gerapporteerd door eerdere literatuur, AP-1 is de belangrijkste transcriptiefactor in MMP-9-expressie [17]. In deze studie, om te bevestigen dat de AP-1 kritisch nodig in deze cursus gaan we in dienst van een AP-1 decoy phosphorothioated dubbelstrengs oligodeoxynucleotide (ODNs) en pGL3-AP-1 luciferase plasmide om samen te transfecteren in de AGS cellen. De gecotransfecteerde cellen werden behandeld met PMA en de luciferase activiteiten werden bepaald met een luminometer. Zoals getoond in figuur 2A zijn de PMA geïnduceerde MMP-9 promotor luciferase activiteiten geremd door het AP-1 decoy. Consequent, AP-1 decoy remde ook PMA geïnduceerde MMP-9 mRNA (Figuur 2B). Er werd aangetoond dat neerhalen van de AP-1 component c-Fos en c-Jun verminderde ook PMA geïnduceerde MMP-9 expressie (figuur 2C). Bovendien, curcumine, een AP-1 inhibitor, ook werd gebruikt om de rol van AP-1 in PMA geïnduceerde MMP-9 expressie controleren. Aangezien de RT-PCR data illustreert, curcumine remde PMA geïnduceerde MMP-9 expressie op een dosis-afhankelijke wijze (Figuur 2D). De bovenstaande gegevens blijkt dat AP-1 is de essentiële factor in MMP-9 expressie. Na het aantonen van de cruciale rol van AP-1 in de hoge niveaus van MMP-9 expressie veronderstelden we dat het mechanisme van chrysin remming van MMP-9 expressie was door het vernietigen van AP-1 activiteit. Vervolgens AGS cellen getransfecteerd met AP-1 luciferase reporter plasmiden werden voorbehandeld met chrysin, en vervolgens gestimuleerd met PMA. Zoals getoond in figuur 2E, chrysin onderdrukte PMA geïnduceerde AP-1lucifease activiteit in een dosis-afhankelijke manier, wat aangaf dat chrysin heeft een vermogen om AP-1 activiteit te verlagen.

Chrysin remt PMA geïnduceerde MMP-9 expressie door het remmen van transcriptiefactor AP-1 via de onderdrukking van c-Jun en c-Fos fosforylering

het is bekend dat c-Jun en c-Fos zijn componenten van de AP-1 route [18]. We wilden het mechanisme achter remmende effect chrysin op AP-1 te bepalen, en onderzochten of chrysin daadwerkelijk het effect ervan op c-Jun en c-Fos uitgeoefend. We maten de totaal mRNA van zowel c-Jun en c-Fos door RT-PCR. Zoals getoond in figuur 2F heeft chrysin niet de expressie van c-Jun en c-Fos mRNA remmen. Vervolgens testen of chrysin de activering van c-Jun en c-Fos remt, werd Western blotting uitgevoerd om het gefosforyleerd c-Jun en c-Fos controleren. Figuur 2G en 2F toont dat chrysin deed onderdrukken de PMA-geïnduceerde c-Jun en c-Fos fosforylatie op een dosis-afhankelijke wijze.

Chrysin remt c-Jun en c-Fos fosforylering door het blokkeren JNK en ERK signalering pathway

vervolgens onderzochten we hoe chrysin onderdrukt c-Jun en c-Fos fosforylering. Door de belangrijke rol van MAPK speelt bij de activering van AP-1, onderzochten wij de rol van de MAPK route in MMP-9 expressie. Zoals getoond in figuur 3A, bij de MAPK-remmers, PD98059 (ERK1 /2 remmer), SP600125 (JNK1 /2-remmer) en SB203580 (p38 MAPK remmer), alleen PD98059 en SP600125 konden PMA geïnduceerde MMP-9 expressie remmen , waaruit bleek dat de ERK1 /2 en JNK1 /2 routes cruciaal kan zijn voor PMA geïnduceerde MMP-9 expressie. Verder, met de MEK-dominant negatief plasmide PMCL-K97M, JNK-dominante negatieve plasmide PMCL-TAM67 en p38 MAPK-dominant negatief plasmide PMCL-MP38, we bevestigde de cruciale rol van de ERK en JNK in MMP-9 expressie bij maagkanker AGS cellen (figuur 3B). Zoals getoond in figuur 3C, ERK1 /2 en JNK1 /2 kritisch nodig voor AP-1 activering door PMA, aangetoond door onze experimenten met MEK en JNK dominant negatieve plasmiden. We controleerden de volgende rollen van JNK1 /2 en ERK1 /2 in c-Jun en c-Fos activatie. Zoals getoond in figuur 3D, SP600125 en PD98059 onderdrukte PMA-geïnduceerde c-Jun en c-Fos fosforylatie, wat aangeeft dat JNK1 /2 kritisch stroomopwaarts van c-Jun, terwijl ERK1 /2 kritisch stroomopwaarts van c-Fos. Aangezien we ontdekten dat JNK1 /2 en ERK1 /2 speelde een essentiële rol in MMP-9 expressie via AP-1, we de hypothese dat chrysin kan werken door middel van een remming van JNK1 /2 of ERK1 /2 tot MMP-9 expressie te onderdrukken. Om onze hypothese te verifiëren, werd Western blotting uitgevoerd om het effect van chrysin op JNK1 /2 of ERK1 /2 fosforylering te bepalen. Zoals figuur 3E en 3F tonen, de PMA behandeling geleid tot een opmerkelijke stijging van de JNK1 /2 en ERK p42 /44 fosforylering; In aanwezigheid van chrysin, PMA geïnduceerde JNK1 /2 en ERK1 /2 fosforylering geremd op een dosisafhankelijke wijze.

Effect van chrysin op mobiele invasiviteit

Het is bekend dat hoge niveaus van MMP-9 expressie zijn belangrijk voor de invasieve fenotype van kankercellen. Om het effect van chrysin op PMA geïnduceerde celinvasie onderzoeken, onderzochten we celinvasie door middel van een gemodificeerde Boyden kamer invasie. AGS cellen geïncubeerd in PMA resulteerde in een verhoogd aantal binnengedrongen cellen die door de kunstmatige Matrigel doorgegeven. In aanwezigheid van chrysin of MMP-9 antilichaam wordt het aantal binnengedrongen cellen af ​​te geven chrysin kan de PMA-geïnduceerde invasieve cellen onderdrukken door het remmen van MMP-9 expressie (Figuur 4A en 4B). Bovendien, figuur 4C toonde chrysin verminderde PMA geïnduceerde AGS invasie in een dosis-afhankelijke wijze. Vervolgens hebben we het effect van de remmer op signalering PMA geïnduceerde AGS celinvasie. Zoals getoond in figuur 4D, chrysin, curcumin, PD98059 en SP600125 remde celinvasie geïnduceerd door PMA, wat aangeeft dat chrysin waarschijnlijk inhibeert PMA geïnduceerde MMP-9 via AP-1 onderdrukt, waardoor het blokkeren van de JNK1 /2 en ERK1 /2 routes .

Discussie

natuur voorkomende verbindingen met anti-kanker activiteiten verstoren tumorontwikkeling en progressie van kanker door het remmen van verschillende mechanismen, waaronder celmigratie, invasie en metastase. Chrysin, een natuurlijke flavonoïde algemeen gevonden in veel plantaardige extracten, honing, propolis en heeft chemopreventieve eigenschappen zoals antiproliferatieve en pro-apoptose activiteiten tegen verschillende kankers [19,20]. De anti-invasie eigenschappen van chrysin niet goed bestudeerd bij maagkanker cellen. Het is bekend dat MMPs zijn de kracht achter de vernietiging van de extracellulaire matrix, evenals de belangrijkste induceerders van cel invasiviteit. Wij onderzochten de remmende effecten van chrysin voor MMP expressie in maagkanker cellen. Chrysin remde MMP-9-expressie (figuur 1) en andere MMP's, zoals MMP-2 en MMP-7 (gegevens niet getoond). De regeling mechanisme chrysin kunnen worden afhankelijk van elke MMP en in deze studie richten we ons op de MMP-9 regualtion.

PMA, forbol-12-myristaat 13-acetaat, een proteïne kinase activator, wordt vaak gebruikt als een biomedisch onderzoek hulpmiddel in modellen van carcinogenese. In deze studie hebben we ontdekt PMA verhoogde MMP-9 activiteiten door middel van opwaartse regulatie van het expressieniveau. In aanwezigheid van chrysin de PMA geïnduceerde MMP-9 daalde in een chrysin dosis-afhankelijke wijze (Figuur 1A). Het lijkt echter dat chrysin remt MMP-9 niet vanwege remming van MMP-9 enzymactiviteit, maar vanwege de onderdrukking van MMP-9 expressie. Om het mechanisme waarmee chrysin remt PMA-geïnduceerde MMP-9 expressie te onderzoeken, hebben we geprobeerd om de essentiële transcriptie factor (s) in de PMA- geïnduceerde MMP-9 expressie route te ontdekken. Vermeld is dat AP-1 is de positieve regulator van MMP's: de AP-1 dat zich bevindt tussen -72 en -66 speelt een belangrijke rol in de transcriptionele regulatie van MMP-1 genexpressie en mutaties van dit element drastisch verminderen van de basale activiteit en responsiviteit van de MMP-1 promoter op externe prikkels [21]. In de MMP-9 promotorregulatie die stroomopwaarts zijn er twee AP-1 bindingsplaatsen (-533 en -79), die een essentiële rol in MMP-9 expressie spelen in humane Caski-cellen [22]. In onze studie, AP-1 decoy oligonucleotiden, AP-1 remmer curcumine, c-Jun en c-Fos siRNA verstoord PMA geïnduceerde MMP-9 expressie (figuur 2A-2D), die rechtstreeks bewijs mits AP-1 is kritisch verplicht MMP-9 transcriptie in maagkanker cellen verhogen. Op basis van bovenstaande resultaten, we afleiden dat chrysin remt MMP-9 expressie door onderdrukking van AP-1 activiteit. Figuur 2E toont het onderzoek van onze speculatie chrysin aanzienlijk kan verminderen AP-1-activiteit bij een dosis-afhankelijke wijze. Overeenkomstig onze vondst dat Chrysin remt AP-1 doelgen MMP-9 via onderdrukken AP-1 activiteit ook gerapporteerd dat chrysin remde andere AP-1 doelgenen zoals VEGF, COX-2 en ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. Consistent met andere bevindingen, is ontdekt dat luteoline, flavonoïde een plant met een soortgelijke structuur als chrysin, remt significant de LPS- geïnduceerde DNA bindingsactiviteit van AP-1 [26]. De remmende vermogen en het mechanisme van chrysin op AP-1 niet volledig onderzocht voorafgaand aan deze studie. Daarom bestudeerden we vervolgens het mechanisme waarmee chrysin remt AP-1.

Naast het mediëren MMP-9 expressie, AP-1 induceert ook zowel de expressie van invasie activators en suppressors onderdrukt invasie. Als zodanig, AP-1 is een essentiële transcriptiefactor voor de regulering van invasieve-genen [27]. AP-1 bestaat uit hetzij homodimeren van Jun familieleden of heterodimeren tussen leden van de c-Fos en c-Jun families. Zowel c-Jun en c-Fos gefosforyleerd en geactiveerd door de ERK, p38 en JNK kinase systemen [28-30]. Om het mechanisme van chrysin inhibitie van AP-1 te onderzoeken, onderzochten we c-Jun en c-Fos, de twee hoofdbestanddelen van AP-1. We ontdekten dat chrysin remde c-Jun en c-Fos activatie door het blokkeren van hun fosforylatie. In overeenstemming met onze bevindingen, een aantal eerdere literatuur ook gemeld dat andere flavonen bijv. quercetine, verminderde AP-1 activiteit door middel van het onderdrukken van c-Jun van translocatie in de nucleus [31].

We waren verder geïnteresseerd in remmingsmechanisme chrysin op c-Jun en c-Fos. JNK (c-Jun-N-terminaal kinase), een lid van de MAPK (mitogen activated protein kinase) familie die verschillende biologische processen betrokken bij tumorigenese regelt, wordt het essentiële kinase c-Jun-activering [32] . ERK, extracellulair signaal gereguleerde kinase, speelt een rol bij de regulatie van verschillende cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en ontwikkeling [33] en is gemeld aan de belangrijke regulerende kinase c-Fos activatie [34] zijn. In deze studie, zien we direct bewijs in maagkanker AGS cellen die JNK kritisch voor c-Jun-activering vereist, terwijl ERK is de kritische kinase c-Fos activatie (figuur 3D).

Based op de bovenstaande conclusie, om verdere onderzoeken mechanisme van het onderdrukken van MMP-9 chrysin's, ontdekten we dat chrysin hadden een vermogen JNK1 /2 en ERK1 /2 fosforylering (figuur 3E en 3F) blokkeren. Volgens deze bevinding de remmende effecten van andere flavonen op ERK1 /2 ook gerapporteerd.

Liu et al. gemeld dat apigenine, een polyfenolische flavon (4,5,7-trihydroxyflavone), gevonden in een verscheidenheid van kruiden en groene bladgroenten, celmigratie remt via de onderdrukking van ERK1 /2 fosforylering in menselijk blaas gladde spiercellen [35]. Ook is ontdekt door Ishikawa et al. dat H _{2O 2 verhoogt apoptose, wat leidt tot de snelle fosforylering van JNK, ERK en p38 MAPK, terwijl quercetine de activering van deze drie MAPK's kunnen afschaffen reactie op H 2O 2 [ ,,,0],36].}

in het onderhavige onderzoek onderzochten we het remmende effect van chrysin MMP-9 expressie en onthulde het onderliggende mechanisme maagkanker AGS cellen voor het eerst. Op basis van onze bevindingen beschrijven we een hypothetisch model illustreert schematisch het mechanisme van chrysin remmen MMP-9 expressie, zoals getoond in figuur 5. Andere onderzoeken worden uitgevoerd om te onderzoeken of er een enzym stroomopwaarts van zowel JNK1 /2 en ERK1 /2 kritisch regelen JNK1 /2 en ERK1 /2 fosforylering. Als dat zo is, kan chrysin direct interageren met het enzym, die grondig onderzocht moeten worden als een potentiële anti-kanker therapeutische.

Diverse adjuvante therapeutische strategieën om tumormetastase te onderdrukken en voorkomen tumorrecidief zijn onderzocht en bieden vele mogelijkheden voor herstel van patiënten. Onlangs is het gebruik van natuurlijke fytochemicaliën uitgebreide studie ter preventie van kanker [37] ontvangen. Bovendien is de inname van fytochemicaliën ontving onlangs de aandacht bij maagkanker voorkomen [38]. In deze studie hebben we vastgesteld dat-chrysin behandelde cellen kanker invasieve karakter kan afnemen via het remmen van MMP-9 expressie door middel van de onderdrukking van de JNK /c-Jun en ERK /c-Fos signaalwegen. Deze bevindingen kunnen nuttig bewijs leveren voor de ontwikkeling van toekomstige anti-kanker therapeutica voor maagkanker.

• PLoS ONE: Verlies van Expressie van Reprimo, een p53-geïnduceerde celcyclus Gene, correleert met Invasieve fase van de progressie van de tumor en p73 expressie in Gastric Cancer
• PLoS ONE: Deregulering tussen miR-29b /c en DNMT3A wordt geassocieerd met Epigenetische Silencing van de CDH1 Gene, die van invloed Cell Migratie en invasie bij maagkanker