PLOS ONE: Chrysin Inhibe Tumor Promoteur-Induced MMP-9 Expression par blocage AP-1 via Suppression des voies ERK et JNK dans les cellules du cancer gastrique

Résumé

L'invasion cellulaire est un mécanisme crucial de métastases du cancer et la malignité. La matrice métalloprotéinase-9 (MMP-9) est une enzyme protéolytique importante impliquée dans le processus d'invasion des cellules cancéreuses. les niveaux d'expression élevés de MMP-9 dans le cancer gastrique corrélation positive avec l'agressivité tumorale et ont une corrélation négative significative avec les temps de survie des patients. Récemment, des mécanismes de suppression de la MMP-9 par phytochimiques sont devenus de plus en plus étudié. Chrysine, un produit chimique se produisant naturellement dans les plantes, a été rapportée pour supprimer les métastases tumorales. Cependant, les effets de la chrysine sur MMP-9 expression dans le cancer gastrique n'a pas été bien étudiée. Dans la présente étude, nous avons testé les effets de la chrysine sur la MMP-9 expression dans les cellules de cancer gastrique, et déterminé son mécanisme sous-jacent. Nous avons examiné les effets de la chrysine sur la MMP-9 expression et l'activité par RT-PCR, zymographie, étude de promoteur et western blot dans les cellules AGS de cancer gastrique humain. Chrysine inhibe phorbol-12-myristate 13-acétate (PMA) induite par MMP-9 expression d'une manière dépendante de la dose. Utilisation de AP-1 leurres oligodésoxynucléotides, nous avons confirmé que AP-1 est le facteur de transcription essentiel pour la MMP-9 expression. Chrysine bloqué AP-1 par la suppression de la phosphorylation de c-Jun et c-Fos en bloquant les JNK1 /2 et ERK1 /2 voies. En outre, les cellules AGS pré-traitées avec du PMA ont montré nettement améliorées invasivité, qui a été partiellement supprimée par la chrysine et MMP-9 anticorps. Nos résultats suggèrent que la chrysine peut exercer au moins une partie de ses effets anticancéreux en contrôlant la MMP-9 expression par la suppression de l'AP-1 activité par l'intermédiaire d'un bloc des JNK1 /2 et ERK1 /2 voies de signalisation dans les cellules AGS de cancer gastrique.

Citation: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin inhibitions Tumor Promoteur-Induced MMP-9 Expression par blocage AP-1 via Suppression de ERK et JNK Pathways dans les cellules du cancer gastrique. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10.1371 /journal.pone.0124007

Editeur académique: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, ETATS-UNIS

reçues: 5 Octobre 2014; Accepté 9 Mars 2015; Publié: 15 Avril 2015

Droit d'auteur: © 2015 Xia et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:. Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche (0720570) à partir du Centre national du cancer (www.ncc.re.kr), subvention du Programme de recherche en sciences de base par la national Research Foundation de Corée (NRF), financé par le Ministère de l'éducation, de la science et de la technologie (2.010 à 0009910, www.moe.go.kr), et un centre de recherche médicale (2012-000-9442) subvention de la science coréenne et la Fondation Engineering ( www.nrf.re.kr). Tous les bailleurs de fonds ci-dessus ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Présentation

le cancer gastrique se classe actuellement deuxième de la mortalité mondiale du cancer, avec environ 990.000 nouveaux cas et 738.000 décès par cancer dans le monde entier chaque année résultant, bien que l'incidence du cancer de l'estomac a diminué au cours des dernières décennies [1,2]. organe Distant ou des métastases des tissus est un signe de mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer gastrique. Métastase est la caractéristique la plus mortelle des tumeurs malignes, ce qui représente plus de 90% de la mortalité liés à la tumeur [2]. Il a été démontré que la chimiothérapie et la radiothérapie ne peuvent pas prolonger et d'améliorer la qualité de vie des patients dans les cas [3,4] de manière significative. Les cellules tumorales métastase est un processus très complexe comprenant la prolifération, la migration, l'invasion et l'adhésion ultérieure et de l'angiogenèse dans d'autres organes ou tissus [3].

Depuis l'invasion est l'une des propriétés fondamentales des cellules cancéreuses malignes, maîtrise de l'invasion, est une cible thérapeutique importante. Cell-matrice extracellulaire (ECM) interactions, la déconnexion de l'adhésion intercellulaire, la dégradation de l'ECM, et l'invasion des vaisseaux lymphatiques et sanguins sont des étapes importantes dans l'invasion du cancer et des métastases [5]. l'invasion tumorale nécessite une expression accrue de métalloprotéinases de matrice (MMPs) [6]. MMP, une famille de endopeptidases dépendantes du zinc qui induisent l'invasion des cellules cancéreuses et la propagation, jouent un rôle crucial dans les métastases par la dégradation de l'ECM et la membrane basale [7]. La matrice métalloprotéinase-9 (MMP-9), connu sous le nom 92 kDa type IV collagénase ou gélatinase B, est l'une des plus importantes MMPs, et elle est codée par le gène de MMP-9 chez les humains [8]. Il a été rapporté que la surexpression de MMP peut augmenter le détachement des cellules tumorales et des métastases, qui sont associées à une tumeur maligne et de mauvais résultats cliniques dans divers cancers, y compris le cancer gastrique [9,10].

En raison de la fonction du MMP 9 dans le cadre de la malignité, la suppression de la MMP-9 niveaux est une stratégie importante pour lutter contre le cancer. Dans les dernières années, de plus en plus d'attention a été concentrée sur la recherche d'un inhibiteur de MMP-9, en particulier à partir de matériaux d'origine naturelle. Kim et al. découvert que la silibinine inhibe le PMA induit l'expression de MMP-9 par la suppression de la phosphorylation de ERK dans les cellules MCF-7 du cancer du sein humain [11]. Plus récemment, Khoi et al. a rapporté que (-) - épigallocatéchine blocs-3-gallate la nicotine induit l'expression de MMP-9 et l'invasivité par la suppression du NF-kB et AP-1 dans les cellules endothéliales ECV304 [12]. Chrysine, la 5,7-dihydroxy, un type de flavonoïde naturel, est connue pour inhiber l'angiogenèse et les métastases [13,14]. Lin et al. a démontré que la chrysine inhibe l'angiogenèse d'IL-6 induite par la régulation négative de la voie de signalisation de l'IL-6 soluble /récepteur gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF [13]. Récemment, il est rapporté que la chrysine pourrait améliorer l'apoptose caspase-dépendant régulé par TRAIL dans HCT 116 lignée cellulaire et les cellules CNE1 [15]. Yang et al. a découvert que la chrysine supprime l'invasion cellulaire d'une manière dose-dépendante dans les cellules TNBC. En outre, la chrysine diminue les molécules liées métastase-vimentine, escargot et limace, et bloque la voie de signalisation Akt [16]. Cependant, les effets inhibiteurs de la chrysine sur la MMP-9, ainsi que le mécanisme n'a pas été bien étudiés, en particulier dans les cellules cancéreuses gastriques. Dans la présente étude, nous avons étudié les effets de chrysine sur PMA induite par MMP-9 expression dans le cancer gastrique, et révélé son mécanisme sous-jacent.

culture cellulaire et des conditions de culture
Matériels et Méthodes

la lignée humaine AGS de cellules de cancer gastrique a été obtenue à partir de l'American type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 0,6% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5% de CO _{2. Afin de déterminer les effets de la chrysine sur le PMA induit l'expression de MMP-9, les cellules ont été prétraitées avec des concentrations différentes de la chrysine et ensuite traitées avec du PMA. Le niveau de MMP-9 ARN messager (ARNm) a été déterminé par réaction en chaîne de polymérase-transcription inverse (RT-PCR). Le rôle des voies de signalisation spécifiques à la MMP-9 expression PMA induite ont été examinées en prétraitant les cellules AGS avec l'inhibiteur PD98059 ERK 1/2 (New England Biolabs, Beverly, MA), le SP600125 inhibiteur de JNK (Calbiochem, La Jolla , CA), le SB203580 inhibiteur de p38 MAPK (Calbiochem, la Jolla, CA), et chrysine (Sigma Aldrich, USA) pendant 1 heure avant la stimulation par le PMA.}

la viabilité des cellules

cellules ( 5 × 10 ^{3) ont été incubées dans une plaque à 96 puits dans du RPMI avec 10% de FBS contenant de 0 à 100 uM pendant 24 heures chrysine et la respiration cellulaire a été déterminée par un établi 3- [4,5-diméthylthiazol-2 -yl] -2,5-diphényltétrazolium (MTT, Sigma-Aldrich) le dosage. Après l'incubation, 10 ul de 5 mg /ml de MTT a été ajouté à chaque puits des plaques à 96 puits et incubées à 37 ° C pendant 2 heures. Les granulés formazan obtenus ont été dissous dans 100% de diméthylsulfoxyde, et l'absorbance à 570 nm a été détectée avec un 96 puits ELISA lecteur (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).}

Gélatine zymographie

Les cellules prétraitées avec ou sans chrysine pendant 1 heure, ont été traitées avec 100 nM de PMA pendant 20 heures. Après incubation, nous avons recueilli le surnageant des médias et effectué zymographie de gélatine pour vérifier l'activité de MMP-9. Ensuite, le milieu a été mélangé avec un volume égal de 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 25% de glycerol, 4% de SDS et 0,01% de bleu de bromophénol] et chargé dans un acrylamide à 7,5%: bisacrylamide (29: 1; Bio-Rad, USA) gel contenant 625 pg /ml de gélatine (Sigma). Après électrophorèse, le gel a été lavé avec 2,5% de Triton X-100 trois fois (20 minutes par heure), puis mis à incuber pendant 24 heures à 37 ° C dans le tampon d'incubation [Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, mM CaCl 5 _{2, et 1 uM ZnCl 2]. Les gels ont été colorés avec du bleu brillant de Coomassie R250 (BioRad, USA) pendant 3 heures, puis on rince. L'activité protéolytique a été traduit sous forme de bandes claires sur le fond bleu de la gélatine colorées. Contrôle des sollicitations pour la gélatine zymographie: Coomassie Brilliant Blue R-250 gel tache pour 10% de dodécyl sulfate de sodium polyacrylamide sans gélatine, de montrer la même quantité de surnageant a été chargé sur chaque voie}

transcription inverse-PCR
<. p> ARN total a été extrait des cellules en utilisant le réactif Trizol AGS (Invitrogen). Un pg d'ARN total a été utilisé pour la synthèse d'ADN complémentaire du premier brin en utilisant des amorces aléatoires et la transcriptase M-MLV (Promega). L'ADN complémentaire a été soumis à une amplification par PCR avec des ensembles d'amorces pour GAPDH et MMP-9 en utilisant une solution de mélange maître de PCR (Intron, Corée). Les amorces des séquences spécifiques sont les suivantes: sens GAPDH, 5'-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 'et GAPDH antisens, 5'-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 pb); et MMP-9 sens, 5'AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT -3 'et MMP-9 antisens, 5'-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3' (497 pb); c-Jun sens, 5'-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ', et c-Jun antisens, 5'-GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3' (287bp); c-Fos sens, 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 'et c-Fos antisens, 5'-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG GCC CA-3' (246bp). Les conditions de PCR étaient les suivantes:. Dénaturation à 94 ° C pendant 30 secondes, de recuit à 52 ° C pendant 20 secondes et extension à 72 ° C pendant 30 secondes

Mesure de l'activité de MMP-9 promoteur

la régulation de la transcription de MMP-9 a été examinée par la transfection transitoire d'une construction rapporteur promoteur de MMP-9-luciférase (pGL4-MMP-9). Le plasmide pGL4-MMP-9 promoteur (couvrant les nucléotides de -925 à +13) a été aimablement fourni par le Dr Young-Han Lee (Université Konkuk, Corée). les cellules AGS ont été ensemencées et cultivées jusqu'à ce qu'ils atteignent 70% de confluence. Ensuite, les pGL4-de MMP-9 plasmides promoteurs ont été transfectés dans les cellules en utilisant du FuGENE 6 (Promega, USA) selon le protocole du fabricant. PRL-TK a été transfecté comme témoin interne. Les cellules ont été incubées dans le milieu de transfection pendant 12 heures puis traitées avec du PMA pendant 4 heures. Les effets de la chrysine sur la MMP-9 activité de promoteur ont été déterminées par le prétraitement des cellules avec chrysine pendant 1 heure avant l'addition de PMA. Les études de co-transfection ont été effectuées en présence ou l'absence du vecteur d'expression codant pour le dominant négatif mutant MEK-1 (PMCL-K97M), JNK mutant dominant négatif (PMCL-TAM67), ou dominant MAPK mutant négatif de p38 (PMCL-MP38 ) qui ont été aimablement fourni par le Dr NG Ahn (University of Colorado-Boulder, CO), par le Dr M.J. Birrer (NCI, Rockville, MD), et par le Dr J. Han (Scripps Research Institute, CA), respectivement. Les cellules ont été récoltées avec un réactif de culture cellulaire de lyse (Promega, USA) et les activités luciférase ont été déterminées à l'aide d'un luminomètre (Centro XS lb960 microplaque luminomètre Berthold Technologies, USA) selon le protocole du fabricant.

transitoire transfection de l'AP-1 journaliste

L'AP-1 plasmide rapporteur luciférase a été acheté chez Clontech (Palo Alto, CA, USA). Lorsque les cellules ont atteint 60 à 70 AGS% de confluence, elles ont été lavées avec du milieu Opti-MEM et transfectées avec un vecteur pGL-3 contenant le rapporteur AP-1 en utilisant du FuGENE 6 (Promega) selon le protocole du fabricant. cellules rapporteur transfectées ont été prétraités avec chrysine pendant 1 heure et ensuite traitées avec 100 nM de PMA pendant 4 heures et les activités luciférase ont été mesurées à l'aide d'un luminomètre.

Transfection de AP-1 leurre oligodésoxynucléotides

sur la base de l'AP-1 site de liaison ATGAGTCAT, nous avons conçu l'AP-1 leurre phosphorothioates désoxynucléotide double brin oligo (ODN) comme suit, 5'-CGST CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACSG-3 'et 3 «GAA -GsCA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TSGC-5 '. Lorsque les cellules AGS ont atteint 60 à 70% de confluence, AP-1 et ODN-pGL4 de MMP-9 plasmides promoteurs ont été cotransfectés dans les cellules en utilisant la Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) selon le protocole du fabricant. Après une incubation de 20 heures, les cellules transfectées ont été traitées avec du PMA pendant 4 heures et les activités luciférase ont été mesurées à l'aide d'un luminomètre.

Analyse par Western blot

cellules AGS traitées avec du PMA ont été lavées dans du phosphate une solution saline tamponnée (PBS), détaché en utilisant un tampon de trypsine-EDTA et stockés à -70 ° C jusqu'à leur utilisation. La protéine cellulaire a été extraite avec un tampon RIPA [1% de NP-40, le désoxycholate de sodium à 0,5%, 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS)] et des inhibiteurs de la protéase (aprotinine, leupeptine, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), la benzamidine, l'inhibiteur de la trypsine, de l'orthovanadate de sodium ). Cinquante microgrammes de protéines a ensuite été séparé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS à 10% et transférés sur Hybond-P membranes (Amersham Pharmacia Biotech). Les membranes ont été bloquées dans une solution de TBST contenant 5% de lait écrémé, mis en incubation avec un anticorps primaire dans une solution de blocage pendant une nuit à 4 ° C et lavées trois fois avec 0,1% de Tween-20 dans du tampon Tris salin (TBST) à intervalles de 10 minutes . anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) a été utilisé pour détecter les protéines immunoréactives par chimiluminescence. Les anticorps suivants ont été utilisés: anti-phospho-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-phospho-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP 9 (Cell Signaling Technology), anti-phospho-c-Fos (Cell Signaling Technology), et anti-phospho-c-Jun (Cell Signaling Technology). Les taux de protéines totales ont été analysés par lavage de la membrane épongée avec une solution de décapage composée de 100 mM de 2-mercaptoéthanol, 2% de SDS et 62,5 mM de Tris-HCl (pH 6,7) pendant 30 minutes à 50 ° C, et la membrane a ensuite re-sondé avec soit l'anti-β-actine (Cell Signaling Technology), anti-totale ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-totale JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) ou anti-c-Jun (Santa Cruz).

Matrigel test d'invasion

le test de l'invasion des cellules a été réalisée à l'aide de la chambre de chemotasis 10 puits (Neuro Probe, Gaithersburg, Maryland, Etats-Unis) avec 8 membrane uM de pores (Neuro Probe) avec 10% de FBS contenant RPMI comme chimiotactique dans la chambre inférieure. les cellules AGS (10 ^{5 dans 280 ul) ont été ajoutés à la chambre supérieure avec du PMA, en présence de la chrysine, la MMP-9 ou un anticorps IgG non spécifique, et on fait incuber à envahir le Matrigel pendant 24 heures. Afin de déterminer l'effet de la chrysine et les inhibiteurs de la signalisation sur l'invasion des cellules PMA induit, les cellules AGS ont été pré-incubées avec la chrysine, la curcumine, le PD98059, ou SP600125 pendant 1 heure, et on fait incuber avec du PMA pendant la période d'invasion de 24 heures. Les cellules non-invasion sur la surface supérieure de chaque membrane ont été retirés de la chambre, et les cellules d'invasion sur la surface inférieure de chaque membrane ont été colorées avec le Quick-Diff kit de coloration (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Après deux lavages à l'eau, les chambres ont été autorisés à sécher à l'air. Le nombre de cellules envahissantes a été compté en utilisant un microscope à contraste de phase.}

Statistiques

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, et représentent la moyenne d'au moins trois expériences distinctes effectuées en triple. Les différences entre toutes les deux ensembles de données ont été déterminées par des tests t. Les différences décrites comme significatif dans le texte correspondent à P
<. 0.05

Résultats

Effet inhibiteur de la chrysine sur PMA stimulé MMP-9 expression

Afin d'étudier l'effet inhibiteur de la chrysine contre la régulation positive de la MMP-9, les cellules AGS prétraités avec chrysine ont été incubées avec du PMA et zymographie sur gélatine et de l'analyse par RT-PCR ont été effectuées. Comme cela est représenté sur la figure 1A, stimulées par PMA MMP-9 a été inhibée par chrysine d'une manière dépendante de la dose comme cela est illustré par l'essai de gélatine zymographie. Avant notre expérience, que ce soit directement Chrysin inhibé l'activité de MMP-9 ou inhibé l'expression de MMP-9 était encore inconnue. Pour répondre à cette question, nous avons co-incubé la MMP-9 AGS-sécrétée avec chrysine pendant 3 heures, et la gélatine zymographie a été effectuée pour vérifier le niveau final de MMP-9 activité. Comme le montre la figure 1B, la chrysine ne pouvait affecter sécrétée MMP-9 activités. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que l'inhibition de la chrysine contre MMP-9 peut se faire par la suppression de l'expression de MMP-9. Pour vérifier cette hypothèse, inverse PCR de transcription et de dosages MMP-9 promoteur ont été effectuées pour vérifier les niveaux de transcription de MMP-9. Comme cela est représenté sur la figure 1C, après avoir été traitée avec la chrysine, l'AGP induite par MMP-9 de l'ARNm a diminué d'une manière dépendant de la dose. En outre, l'activité de MMP-9 de la luciférase de promoteur a été inhibée par chrysine d'une manière dépendante de la dose (figure 1D). Et western blot a également montré l'effet inhibiteur de la chrysine sur la MMP-9 expression (figure 1E). Les concentrations de chrysine utilisées dans la présente étude n'a pas affecté la viabilité des cellules (figure 1F). Ces résultats indiquent que la chrysine inhibe l'activité de MMP-9 dans les cellules AGS par une réduction de l'efficacité de la transcription.

Rôle de l'AP-1 induite par le PMA dans la MMP-9 expression

Tel que rapporté par précédent littérature, AP-1 est le facteur de transcription le plus important dans l'expression de MMP-9 [17]. Dans cette étude, pour confirmer que AP-1 est critique nécessaire dans ce cours, nous avons utilisé un AP-1 leurre phosphorothioates oligodésoxynucléotide double brin (ODN) et pGL3-AP-1 luciférase plasmide à co-transfecter dans les cellules AGS. Les cellules cotransfectées sont traitées avec du PMA et les activités luciférase ont été déterminées à l'aide d'un luminomètre. Comme on le voit sur la figure 2A, les activités de luciférase promoteur de MMP-9 ont été induits par PMA inhibée par l'AP-1 leurre. Constamment, AP-1 leurre également inhibée PMA induite par MMP-9 expression de l'ARNm (figure 2B). Il a été montré que renversant le composant AP-1 c-fos et c-Jun a également diminué par PMA induit l'expression de MMP-9 (figure 2C). En outre, la curcumine, un inhibiteur AP-1, a également été employé pour vérifier le rôle de l'AP-1 dans le PMA induit par la MMP-9 expression. Comme les données de RT-PCR montre, la curcumine inhibée par PMA induite par MMP-9 expression d'une manière dépendante de la dose (figure 2D). Les données ci-dessus indiquent que l'AP-1 est un facteur essentiel dans l'expression de MMP-9. Après avoir démontré le rôle crucial de l'AP-1 dans les niveaux élevés de MMP-9 expression, nous avons supposé que le mécanisme d'inhibition de la chrysine de MMP-9 expression était par la suppression de l'AP-1. Par la suite, les cellules AGS transfectées avec AP-1 luciférase plasmides rapporteurs ont été prétraités avec chrysine, puis stimulées par le PMA. Comme on le voit sur la figure 2E, la chrysine supprime l'activité AP-1lucifease PMA induit d'une manière dépendante de la dose, ce qui indique que la chrysine a une capacité à diminuer l'activité d'AP-1.

chrysine inhibe le PMA induit par la MMP-9 en inhibant l'expression du facteur de transcription AP-1 par la suppression de c-Jun et c-Fos phosphorylation

Il est bien connu que c-Jun et c-Fos sont des composants de la voie AP-1 [18]. Nous voulions déterminer le mécanisme derrière l'effet inhibiteur de la chrysine sur AP-1, et cherché à savoir si chrysine effectivement exercé son effet sur c-Jun et c-Fos. Nous avons mesuré la quantité d'ARNm total des deux c-Jun et c-Fos par RT-PCR. Comme cela est représenté sur la figure 2F, la chrysine n'a pas inhibé les taux de c-Jun et c-Fos expression de l'ARNm. Ensuite, pour tester si chrysine inhibe l'activation de c-Jun et c-Fos, western blot a été réalisée pour surveiller la phosphorylée c-Jun et c-Fos. La figure 2G et 2F montre que la chrysine a fait supprimer la c-Jun PMA induit par c-Fos phosphorylation d'une manière dose-dépendante.

chrysine inhibe c-Jun et c-Fos phosphorylation en bloquant JNK et ERK voie

Nous avons ensuite étudié comment chrysine supprimé c-Jun et c-Fos phosphorylation. En raison des rôle important que joue MAPK dans l'activation de AP-1, nous avons étudié le rôle de la voie MAPK dans l'expression de MMP-9. Comme on le voit sur la figure 3A, parmi les inhibiteurs de la MAPK, PD98059 (ERK1 /2 inhibiteur), SP600125 (JNK1 /2 inhibiteur) et SB203580 (inhibiteur de la MAPK p38), seul le PD98059 et SP600125 étaient capables d'inhiber la PMA induite par MMP-9 expression , qui a indiqué que les ERK1 /2 et JNK1 /2 voies peuvent être cruciales pour PMA-induite MMP-9 expression. En outre, avec le MEK-dominante plasmide négatif PMCL-K97M, JNK-dominante plasmide négatif PMCL-TAM67 et p38 MAPK-dominante plasmide négatif PMCL-MP38, nous avons confirmé les rôles critiques de ERK et JNK dans MMP-9 expression dans le cancer gastrique AGS cellules (figure 3B). En outre, comme le montre la figure 3C, ERK1 /2 et JNK1 /2 sont critique nécessaire pour l'AP-1 activation par PMA démontré par notre expérience avec MEK et JNK plasmides négatifs dominants. Nous avons ensuite vérifié les rôles de JNK1 /2 et ERK1 /2 c-Jun et activation c-Fos. Comme cela est représenté sur la figure 3D, SP600125 et PD98059 supprimées c-Jun PMA induit et la phosphorylation de c-Fos, respectivement, indiquant que JNK1 /2 est en amont critique de c-Jun, tandis que ERK1 /2 est en amont critique de c-Fos. Depuis que nous avons découvert que JNK1 /2 et ERK1 /2 a joué un rôle essentiel dans l'expression de MMP-9 par l'intermédiaire de l'AP-1, nous avons supposé que la chrysine peut travailler à travers une inhibition de JNK1 /2 ou ERK1 /2 pour supprimer la MMP-9 expression. Pour vérifier notre hypothèse, western blot a été effectuée pour déterminer l'effet de la chrysine sur JNK1 /2 ou ERK1 /2 phosphorylation. Comme la figure 3E et 3F montrent, le traitement PMA a conduit à une augmentation remarquable de JNK1 /2 et ERK p42 /44 phosphorylation; JNK1 cependant, en présence de la chrysine, PMA-induite /2 et ERK1 /2 phosphorylation a été inhibée de manière dose-dépendante.

Effet de la chrysine sur invasivité des cellules

Il a été connu que des niveaux élevés de MMP-9 sont importants pour l'expression du phénotype invasif des cellules cancéreuses. Pour examiner l'effet de la chrysine sur l'invasion cellulaire induite par PMA, nous avons examiné l'invasion des cellules à travers une chambre d'invasion de Boyden modifiée. les cellules AGS incubées dans du PMA ont donné lieu à un nombre accru de cellules envahies qui passaient à travers le Matrigel artificiel. Cependant, en présence d'un anticorps ou chrysine MMP-9, le nombre de cellules envahies a diminué, ce qui indique chrysine peut inhiber l'invasivité de cellules induite par PMA en inhibant l'expression de MMP-9 (Figure 4A et 4B). En outre, la figure 4C montre une diminution chrysine invasion AGS PMA induit de manière dose-dépendante. Ensuite, nous avons étudié l'effet de l'inhibiteur de la signalisation sur l'invasion de cellules AGS PMA induit. Comme cela est représenté sur la figure 4D, la chrysine, la curcumine, le PD98059 et SP600125 inhibé l'invasion des cellules induite par le PMA, ce qui indique que la chrysine inhibe probablement le PMA induit par la MMP-9 par l'intermédiaire de l'AP-1 de suppression, qui résulte de bloquer les JNK1 /2 et ERK1 /2 voies .

Discussion

composés d'origine naturelle avec des activités anti-cancer interfèrent avec le développement de la tumeur et la progression du cancer en inhibant divers mécanismes, y compris la migration cellulaire, l'invasion et les métastases. Chrysin, un flavonoïde naturel largement trouvé dans de nombreux extraits de plantes, le miel et la propolis a des propriétés chimioprévention tels que les anti-prolifératives et pro-apoptose activités contre divers cancers [19,20]. Cependant, les propriétés anti-invasion de chrysine n'ont pas été bien étudiée dans les cellules de cancer gastrique. Il est bien connu que les MMP sont la force derrière la destruction de la matrice extracellulaire, ainsi que les principaux inducteurs de l'invasivité des cellules. Nous avons étudié les effets inhibiteurs de MMPs chrysine sur l'expression dans les cellules cancéreuses gastriques. Chrysine inhibe l'expression de MMP-9 (figure 1) et les autres MMPs, tels que la MMP-2 et MMP-7 (données non présentées). Le mécanisme de régulation de la chrysine peut être dépendait de chaque MMP et, dans cette étude, nous concentrer sur la MMP-9 regualtion.

PMA, le phorbol-12-myristate 13-acétate, un activateur de la protéine kinase, est couramment utilisé comme un outil de recherche biomédicale dans les modèles de la cancérogenèse. Dans cette étude, nous avons découvert PMA a augmenté de MMP-9 activité par régulation positive de son niveau d'expression. En présence de la chrysine, la MMP-9 par PMA induit une diminution d'une manière chrysine dose-dépendante (figure 1A). Toutefois, il semble que la chrysine inhibe la MMP-9, non pas à cause de l'inhibition de la MMP-9 l'activité enzymatique, mais en raison de sa suppression de l'expression de MMP-9. Pour étudier le mécanisme par lequel la chrysine inhibe PMA-induite MMP-9 expression, nous avons essayé de découvrir le facteur de transcription essentiel (s) dans la MMP-9 voie d'expression PMA- induite. Il a été rapporté que l'AP-1 est le régulateur positif de la PGF: l'élément AP-1 située entre -72 et -66 joue un rôle majeur dans la régulation de la transcription de MMP-1 expression du gène et les mutations de cet élément de réduire considérablement le activité basale et la réactivité de la MMP-1 promoteur à des stimuli externes [21]. Dans le promoteur séquence de régulation en amont de la MMP-9, il y a deux AP-1 (sites de liaison -533 et -79) qui jouent un rôle essentiel dans l'expression de MMP-9 dans des cellules humaines Caski [22]. Dans notre étude, oligodésoxynucléotides AP-1 leurre, AP-1 inhibiteur de la curcumine, c-Jun et c-Fos siRNA interféré avec PMA induite par MMP-9 expression (figure 2A-2D), qui a fourni une preuve directe que AP-1 est critique nécessaire pour augmenter la transcription de MMP-9 dans les cellules cancéreuses gastriques. Sur la base des résultats ci-dessus, on déduit que la chrysine inhibe l'expression de MMP-9 par suppression de l'activité AP-1. La figure 2E représente la vérification de notre spéculation: chrysine peut diminuer de manière significative l'activité d'AP-1 d'une manière dépendante de la dose. En accord avec notre découverte actuelle que chrysine inhibe l'AP-1 gène ciblé MMP-9 par l'intermédiaire de suppression activité AP-1, il a également été rapporté que la chrysine inhibe d'autres AP-1 des gènes cibles, tels que le VEGF, de la COX-2 et ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. Compatibles avec les autres résultats, il a été découvert que la lutéoline, un flavonoïde de plante avec une structure similaire à la chrysine, inhibe de manière significative l'activité de liaison de l'ADN induite par le LPS de l'AP-1 [26]. Toutefois, la capacité d'inhibition et le mécanisme de chrysine sur AP-1 avaient pas été entièrement étudiées avant cette étude. Par conséquent, nous avons ensuite étudié le mécanisme par lequel la chrysine inhibe l'AP-1.

Outre la médiation de l'expression de MMP-9, AP-1 également à la fois induit l'expression des activateurs d'invasion et réprime les suppresseurs d'invasion. En tant que tel, AP-1 est un facteur de transcription essentiel pour la régulation des gènes relatifs aux envahissements [27]. AP-1 consiste en soit homodimères de membres de la famille juin ou hétérodimères entre les membres du c-Fos et les familles c-Jun. Les deux c-Jun et c-Fos sont phosphorylée et activée par l'ERK, p38 et JNK systèmes kinase [28-30]. Afin d'étudier le mécanisme d'inhibition de la chrysine de l'AP-1, nous avons étudié c-Jun et c-Fos, les deux principales composantes de l'AP-1. Nous avons découvert que la chrysine inhibée c-Jun et l'activation de c-Fos en bloquant leur phosphorylation respective. Conformément à nos résultats, une certaine littérature précédente a également signalé que d'autres flavones par exemple quercétine, une diminution de l'AP-1 activité par la suppression de la translocation de c-Jun dans le noyau [31].

Nous étions plus intéressés par le mécanisme d'inhibition de la chrysine sur c-Jun et c-Fos. JNK (c-Jun N-terminal kinase), un membre de la MAPK (mitogen-activated protein kinase) famille qui régule une gamme de processus biologiques impliqués dans la tumorigenèse, est considérée comme la kinase essentielle de l'activation c-Jun [32] . ERK, extracellulaire kinase de signalisation régulée, joue un rôle dans la régulation de divers processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et le développement [33], et il a été signalé comme étant la kinase importante régulation activation c-Fos [34]. Dans la présente étude, nous trouvons des preuves directes dans les cellules AGS de cancer gastrique que JNK est critique requise pour l'activation de c-Jun, tandis que ERK est la kinase critique pour l'activation de c-Fos (représenté sur la figure 3D).

Based sur la conclusion ci-dessus, afin d'étudier plus avant le mécanisme de chrysine de supprimer MMP-9, nous avons découvert que chrysine avait une capacité à bloquer JNK1 /2 et ERK1 /2 phosphorylation (Fig 3E et 3F). Conformément à cette conclusion, les effets inhibiteurs d'autres flavones sur ERK1 /2 également ont été rapportés.

Liu et al. a rapporté que l'apigénine, un flavone polyphénolique (4,5,7-Trihydroxyflavone), trouvée dans une variété d'herbes et les légumes verts, inhibe la migration cellulaire via la suppression de ERK1 /2 phosphorylation dans la vessie des cellules musculaires lisses humaines [35]. Il a également été découvert par Ishikawa et al. que H _{2 O 2 augmente l'apoptose, ce qui conduit à la phosphorylation rapide des JNK, ERK et p38, tandis que la quercétine peut abroger l'activation de ces trois MAPK en réponse à H 2 O 2 [ ,,,0],36].}

dans la présente étude, nous avons étudié l'effet inhibiteur de la chrysine sur la MMP-9 expression et révélé le mécanisme sous-jacent dans les cellules AGS de cancer gastrique pour la première fois. Sur la base de nos résultats, nous décrivons un modèle schématique hypothétique illustrant le mécanisme de la chrysine inhibant MMP-9 expression, comme le montre la figure 5. D'autres études devraient être entreprises pour vérifier s'il y a une enzyme essentielle en amont des deux JNK1 /2 et ERK1 /2, en contrôlant de façon critique JNK1 /2 et ERK1 /2 phosphorylation. Si oui, chrysine peut interagir directement avec l'enzyme essentielle, qui doit être soigneusement étudiée comme un anti-cancer potentiel thérapeutique.

Différentes stratégies thérapeutiques adjuvantes pour supprimer les métastases de la tumeur et de prévenir la récurrence de la tumeur ont été explorées et de fournir de nombreuses options pour les recouvrements des patients. Récemment, l'utilisation de composés phytochimiques naturelles a reçu une étude approfondie pour la prévention du cancer [37]. En outre, l'apport alimentaire de phytochimiques a récemment reçu une attention dans la prévention du cancer gastrique [38]. Dans cette étude, nous avons constaté que les cellules chrysine traitées peuvent diminuer l'invasivité du cancer en inhibant la MMP-9 expression par la suppression de la JNK /c-Jun et ERK /c-Fos voies de signalisation. Ces résultats peuvent fournir des données utiles pour le développement de futures thérapies anti-cancer pour le cancer gastrique.

• PLOS ONE: perte d'expression de Reprimo, un arrêt du cycle cellulaire Gene induit p53, corrèle avec Invasive stade de progression de la tumeur et de p73 expression dans gastrique Cancer
• PLOS ONE: Déréglementation entre miR-29b /c et Dnmt3a est associée à épigénétique Silencing du CDH1 Gene, affectant la migration cellulaire et l'invasion dans gastrique Cancer