Plos ONE: Chrysin Zavira tumorje-Promotorski povzročena MMP-9 Expression z blokiranjem AP-1 preko zatiranju ERK in JNK Poti v želodcu raka celic

Povzetek

Cell invazija je odločilen mehanizem metastaz raka in maligne bolezni. Matriks-metaloproteinaza-9 (MMP-9), je pomemben proteolitični encim vključeni v proces invazijo rakavih celic. Visoke stopnje izraženosti MMP-9 pri raku želodca pozitivno korelira z tumorja agresivnosti in znatno negativno korelacijo s časov preživetja bolnikov. V zadnjem času, mehanizmi zatiranja MMP-9, ki ga fitokemikalije so vedno bolj raziskati. Chrysin, naravno kemično v rastlinah, so poročali, da bi zatrl tumorskih metastaz. Vendar učinki chrysin na MMP-9 izražanja pri raku želodca niso dobro raziskano. V tej študiji smo testirali učinke chrysin na MMP-9 izražanja v želodčnih rakavih celicah, in določijo svoj osnovni mehanizem. Smo preučevali učinke chrysin na MMP-9 izražanja in delovanja preko RT-PCR, cimografijo, študija promotorja in zahodni s sušenjem v človeških rakavih želodca AGS celic. Chrysin inhibiran forbol-12-miristat 13-acetat (PMA) inducirano MMP-9 izraz na način, odvisen od doze. Z uporabo AP-1 umetnih oligodeoksinuk- leotidov, smo potrdili, da je bila AP-1 odločilno transkripcijski faktor za MMP-9 izražanja. Chrysin blokiran AP-1 preko zatiranje fosforilacijo c-jun in c-Fos z blokiranjem /2 in ERK1 /2 poti JNK1. Poleg tega pokazala AGS celice predhodno obdelane s PMA močno izboljšano invazivnosti, ki je delno odvzeto s chrysin in MMP-9 protitelesa. Naši rezultati kažejo, da lahko chrysin izvaja vsaj del svojega učinka proti raku, ki ga nadzoruje MMP-9 izražanje skozi zatiranje AP-1 aktivnostjo preko bloka signalnih poti JNK1 /2 in ERK1 /2 v želodcu rakavih AGS celic.

Navedba: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin zavira Tumor Promotor-inducirane MMP-9 Expression z blokiranjem AP-1 preko zatiranju ERK in JNK Poti v želodcu rakavih celic. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10,1371 /journal.pone.0124007

Akademska Urednik: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Prejeto: 5. oktober 2014; Sprejeto: 9. mar 2015; Objavljeno: 15 april 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v prispevku

Financiranje:. To delo je bilo podprto z raziskovalno donacije (0720570) iz National Cancer Center (www.ncc.re.kr), donacije Basic Science Research Program prek National Research Foundation of Korea (NRF), ki ga je Ministrstvo za šolstvo, znanost in tehnologijo (2010-0009910, www.moe.go.kr) financira, in Medical Research Center (2012-000-9442) nepovratna sredstva iz korejske znanosti in inženiring Foundation ( www.nrf.re.kr). Vsi zgoraj omenjeni financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je trenutno na drugem mestu v svetovnem umrljivosti za rakom, z ocenjenih 990.000 novih primerov in smrti 738,000 rakom, ki izhajajo po vsem svetu vsako leto, čeprav se je incidenca raka želodca v zadnjih nekaj desetletjih [1,2] zmanjšala. Distant organ ali tkivo metastaze je znak za slabo prognozo pri bolnikih z rakom želodca. Metastaze je najbolj usodna značilnost malignih tumorjev, ki predstavlja več kot 90% smrtnosti, povezane s tumorji [2]. Dokazano je, da kemoterapija in obsevanje ne more bistveno podaljša in izboljšanje kakovosti življenja bolnikov v teh primerih [3,4]. Tumorske celice metastaze je zelo kompleksen proces, ki obsega proliferacije, migracije, invazije, in posledično adhezijo in angiogenezo drugih organov ali tkiv [3].

Ker invazija je ena od temeljnih lastnosti malignih rakavih celic, zatiranje invazijo, je pomemben terapevtski cilj. Cell-ekstracelularni matriks (ECM) interakcije, odklop medcelično adhezijo, degradacija ECM in vdor v limfnih in krvnih žil so pomembni koraki v invaziji raka in metastaz [5]. Tumorske invazije zahteva povečano izražanje matriks metaloproteinaz (MMP-jev) [6]. MMP, družina cinka odvisna od endopeptidases ki sprožajo invazijo rakavih celic in širjenje, igrajo ključne vloge v metastaz prek degradacije ECM in bazalne membrane [7]. Matriks-metaloproteinaza-9 (MMP-9), znan kot 92 kDa-IV tipa kolagenaze ali želatinazo B, je eden izmed najpomembnejših MMP, ki je kodiran z genom MMP-9 pri ljudeh [8]. Ugotovljeno je bilo, da lahko prekomerno MMP poveča tumorskih celic nenavezanost in metastaz, ki so povezana z maligne bolezni in slabih kliničnih rezultatov v različnih vrst raka, vključno z rakom želodca [9,10].

Zaradi funkcijo MMP- 9 v teku malignosti, zatiranje ravni MMP-9 je pomembna strategija za nadzorovanje raka. V zadnjih letih je bilo več pozornosti namenjene iskanju inhibitor MMP-9, še posebej iz naravno prisotnih materialov. Kim et al. odkril, da silibinin zavira PMA-inducirane MMP-9 izražanje skozi zatiranje ERK fosforilacijo v MCF-7 človeških celic raka dojke [11]. V zadnjem času, Khoi et al. poročali, da je (-) - epigalokatehin-3-galata bloki nikotin-inducirane MMP-9 izražanja in invazivnosti skozi zatiranje NF-κB in AP-1 v endotelijskih celicah ECV304 [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, vrsta naravno pojavljajoče flavonoidov, je znano, da zavira angiogenezo in metastaze [13,14]. Lin et al. pokazale, da chrysin zavira IL-6-inducirano angiogenezo z navzdol-regulacijo signalne poti topnega IL-6 receptorja /gp130 /JAK1 /stat3 /VEGF [13]. Nedavno je bilo sporočeno, da bi chrysin okrepi kaspazo odvisni apoptozo s TRAIL urejeno v HCT 116 celične linije in CNE1 celic [15]. Yang et al. odkril, da chrysin zatreti celično invazijo na način, ki je odvisen od odmerka v TNBC celicah. Poleg tega chrysin zmanjšuje, povezanih z metastazami molekul vimentina, polž in slug, in prepreči Akt signalne poti [16]. Vendar pa zaviralni učinek chrysin na MMP-9, kot tudi mehanizem, ki niso bili dobro raziskano, še posebej v želodcu rakavih celic. V tej študiji smo raziskovali učinke chrysin na PMA-inducirane MMP-9 izražanja raka želodca, in pokazala svoj osnovni mehanizem.

Materiali in metode

celične kulture in pogoji kultiviranja

AGS človeška želodčni rak celično linijo smo dobili od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celice smo kultivirali v RPMI-1640 z dodatkom 10% fetalni goveji serum (FBS) in 0,6% penicilin-streptomicina pri 37 ° C v atmosferi, ki vsebuje 5% CO _{2. Za določitev učinkov chrysin na PMA inducirane MMP-9 izražanja smo celice obdelali z različnimi koncentracijami chrysin in nato obdelamo z PMA. Raven MMP-9 RNK (mRNA) je bila določena z reverzno prepisovanje-verižne reakcije s polimerazo analizo (RT-PCR). Vloga specifičnih signalnih poti v PMA-inducirane MMP-9 izražanja so bile pregledane s predobdelavo letnem pregledu rasti celic z zaviralcem PD98059 v ERK 1/2 (New England BioLabs, Beverly, MA), SP600125 zaviralcev JNK (Calbiochem, La Jolla CA), SB203580 inhibitor p38 MAPK (Calbiochem, La Jolla, CA), ter chrysin (Sigma-Aldrich, ZDA), 1 uro pred stimulacijo s PMA.}

preživetja celic

Cells ( 5 x 10 ^{3) inkubiramo pri 96 vdolbinicami v RPMI z 10% FBS, ki vsebuje 0-100 um chrysin za 24 ur, in celično dihanje je bila določena z uveljavljeno 3- [4,5-dimetiltiazol-2 il] -2,5-difeniltetrazolijevega bromida (MTT, Sigma-Aldrich) preizkus. Po inkubaciji 10 ul 5 mg /ml MTT dodamo vsako vdolbino 96 vdolbinami z in inkubiranih pri 37 ° C 2 uri. Formazana granule dobljene smo raztopili v 100% dimetilsulfoksida in absorbanco pri 570 nm je bila odkrita s 96-dobro ELISA čitalniku (Biotek Inc., WINOOSKI, VT, USA).}

želatina cimografijo

Celice, predhodno obdelane z ali brez chrysin 1 uro smo obdelali s 100 nM PMA 20 ur. Po inkubaciji smo zbrali medijske supernatant in izvedli želatinasto cimografijo preveriti aktivnost MMP-9. Pozneje smo medije zmešamo z enakim volumnom 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM Tris-HCI (pH6.8), 25% glicerola, 4% SDS in 0,01% bromofenola modro] in naložen v 7,5% akrilamida: bisakrilamida (29: 1, Bio-Rad, ZDA) gel, ki vsebuje 625 ug /ml želatino (Sigma). Po elektroforezi smo gel speremo z 2,5% Triton X-100 trikrat (20 minut na čas), nato inkubiramo 24 ur pri 37 ° C, v inkubacijskem pufru [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl _{2 in 1 uM ZnC 2]. Gele smo obarvali s Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, ZDA) 3 ure in nato splaknemo. Proteolytic aktivnost se je odrazilo jasna pasovih proti modrem ozadju obarvanih želatine. Nadzor obremenitve pri želatine cimografijo: Coomassie Brilliant Blue R-250 madež za 10% NaDS Poliakrilamidni gel brez želatine, pokazati enako količino supernatanta smo nanesli na vsaki stezi}

Reverse prepis-PCR
<. p> Celotna RNA je bila ekstrahirana iz celic AGS uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen). Eden ug celotne RNA je bila uporabljena za prvo sklopa komplementarno sinteze DNA s pomočjo primerjev naključno in M-MLV transkriptazo (Promega). Komplementarna DNA smo podvrgli pomnoževanje z primerskega sklopov za GAPDH in MMP-9 s pomočjo PCR master miks raztopino (intron, Koreja). Specifične primerji sekvence so bile: GAPDH občutek, 5'-TTG TTG CCA STS ATG ACC CC-3 'in GAPDH protismiselno, 5'-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 bp); in MMP-9 občutek, 5'-AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT -3 'in MMP-9 protismiselno, 5'-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3' (497 bp); c-Jun občutek, 5'-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ", in c-Jun protismiselna, 5'GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3" (287bp); c-Fos občutek, 5'-CAG STS GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 'in c-Fos protismiselno, 5'-GAA HA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3' (246bp). Pogoji PCR so bili naslednji:. Denaturacija pri 94 ° C 30 sekund, žarjenje pri temperaturi 52 ° C 20 sekund in podaljšanje pri 72 ° C za 30 sekund

merjenje MMP-9 promotorsko aktivnostjo

transkripcijski ureditev MMP-9 je pregledal prehodno transfekciji na MMP-9 promotorja-luciferaza reporter konstrukt (pGL4-MMP-9). Plazmid pGL4-MMP-9 promotor (segajo nukleotidov od -925 do +13) je prijazno, ki jih dr Young-Han Lee (Konkuk University, Koreja). AGS celice smo posejali in goji, dokler ne doseže 70% sotočje. Nato so pGL4-MMP-9 promotorja plazmida transfektirali v celice, ki uporabljajo FuGENE 6 (Promega, ZDA) po protokolu proizvajalca. PRL-TK smo transfektirali kot notranje kontrole. Celice inkubiramo v transfekcijski medij za 12 ur in nato obdelamo s PMA 4 ure. Učinki chrysin na MMP-9 promotorsko aktivnost smo določili s predhodno obdelavo celic z chrysin 1 uro pred dodajanjem PMA. Študije so sočasno transfekcijo smo izvedli v prisotnosti ali odsotnosti ekspresijskega vektorja, ki kodira dominantno negativno mutant MEK-1 (PMCL-K97M), dominantno negativno mutant JNK (PMCL-TAM67), ali dominantno negativno mutant p38 MAPK (PMCL-mP38 ), ki so sami pripravili dr NG Ahn (University of Colorado, Boulder, CO), dr M.J. BIRRER (NIS, Rockville, MD), in dr J. Han (Scripps Research Institute, CA), oz. Celice so bile pridelane s celične kulture lizo reagenta (Promega, ZDA), in luciferazne aktivnosti so bile določene z uporabo luminometer (Centro XS lb960 mikroplošča luminometer, Berthold Technologies, ZDA) po protokolu proizvajalca.

Prehodni transfekcija AP-1 reporter

AP-1 luciferaze reporter plazmida smo kupili pri Clontech (Palo Alto, CA, ZDA). Ko AGS celice dosegla 60-70% sotočje, so sprali z Opti-MEM medijem in transfektirali z PGL-3 vektorja, ki vsebuje reporter na AP-1 z uporabo FuGENE 6 (Promega) v skladu s protokolom proizvajalca. -Reporter transficirane celice smo obdelali z chrysin 1 uro in nato obdelamo s 100 nM PMA 4 ure in luciferazni aktivnosti smo izmerili ob uporabi luminometer.

Transfekcija AP-1 umetnih oligodeoksinukleotidi

ki temelji na AP-1 vezavnega mestu ATGAGTCAT s smo zasnovali AP-1 vaba phosphorothioated dvojno vijačnico oligo deoksinukleotid (ODN), kot sledi, 5'-CGsT CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 'in 3 "-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5". Ko se AGS celice povečal na 60-70% sotočja, AP-1 ODN in pGL4-MMP-9 promotorja plazmida so co-transfektirali v celice, ki uporabljajo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, ZDA) po protokolu proizvajalca. Po inkubaciji 20 ur, so bile transficirane celice obdelamo s PMA 4 ure in luciferazne aktivnosti smo izmerili ob uporabi luminometer.

Western blot analizo

AGS celice, obdelane s PMA speremo fosfata pufer s soljo (PBS), samostojna uporabo tripsin-EDTA in shranili pri -70 ° C, dokler jih ne potrebujemo. Celični protein smo ekstrahirali z RIPA pufrom [1% NP-40, 0,5% natrijev deoksiholat, 0,1% natrijevega dodecil sulfata (SDS)] in inhibitorji proteaz (aprotinin, leupeptin, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidin, inhibitor tripsina, natrijevega ortovanadata ). Petdeset mikrogramov proteinov smo nato ločimo z 10% SDS-poliakrilamidnem gelu in preneseni na Haybond-P membrane (Amersham Pharmacia Biotech). Membrane so bile v raztopini TBST vsebuje 5% posneto mleko, inkubirani s primarnim protitelesom v raztopini zapornega blokiran preko noči pri 4 ° C, in izperemo trikrat z 0,1% Tween-20 v Tris pufrom (TBST) v 10 min presledkih . Hrenovo peroksidazo konjugirano sekundarna protitelesa (Amersham, Arlington Heights, IL, ZDA) je bila uporabljena za odkrivanje imunološko proteine, ki jih kemiluminescence. Uporabljene so bile naslednje protitelesa: anti-fosfo-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ZDA), anti-fosfo-JNK /SAPK (Cell signalizacija Technology), anti-MMP- 9 (Cell signalizacija Technology), anti-fosfo-c-Fos (Cell signalizacija Technology), in anti-fosfo-c-Jun (Cell signalizacija Technology). Skupne vsebnosti beljakovin smo testirali z izpiranjem osušili membrano z plinsko raztopino, sestavljeno iz 100 mM 2-merkaptoetanol, 2% SDS in 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) 30 minut pri 50 ° C, in membrana je bila nato ponovno zaznati bodisi z anti-β-aktina (celična signalizacija tehnologijo), anti-skupno ERK1 /2 (Cell signalizacija Technology), anti-skupno JNK /SAPK (Cell signalizacija Technology), anti-c-Fos (santa Cruz Biotechnology Inc., CA, ZDA) ali anti-c-Jun (santa Cruz).

poskus vdora v Matrigel

celično invazijo preizkus je bilo opravljeno s pomočjo chemotasis komoro 10, ter (Neuro sonda, Gaithersburg, Maryland, ZDA) z 8 uM por membrane (Neuro Probe) z 10% FBS, ki vsebuje RPMI kot chemoattractant v spodnjem prostoru. AGS celice (10 ^{5 v 280 ul) dodamo k zgornji komori s PMA v prisotnosti chrysin, MMP-9 protitelesa ali nespecifične IgG in inkubiranih napadel Matrigel za 24 ur. Da bi določili učinek chrysin in signalizacijo zaviralcev na PMA-inducirane celične invazije so AGS celice predhodno inkubirali z chrysin, kurkumin, PD98059, ali SP600125 1 uro, ter inkubirali s PMA v 24-urnem obdobju invazijo. Ne-vdrla celic na zgornji površini vsakega membrane so bile odstranjene iz komore in je vdrla celic na spodnjo površino vsakega membrane, smo obarvali z Quick-razlikovanje madežev kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Po dveh vodnih opere so bile komore dovoljeno posuši na zraku. Število preplavljajo celic je bilo preštetih uporabo fazno kontrastnim mikroskopom.}

Statistika

Podatki so prikazani kot povprečje ± SD, in predstavljajo povprečje vsaj treh ločenih poskusih, opravljenih v treh izvodih. Razlike med vsaka dva podatkovnih zbirk so bile določene s t-testov. Razlike so opisane kot pomembni v besedilu ustrezajo P
. ≪ 0,05

Rezultati

zaviralni učinek chrysin na PMA stimulira MMP-9 izraz

da bi raziskali omejevalno učinek chrysin proti uravnavanjem MMP-9, je bilo AGS celice predhodno obdelane z chrysin inkubirali s PMA, in so bile izvedene želatina cimografijo in analizo RT-PCR. Kot je prikazano na sliki 1A, PMA-stimulirane MMP-9 je inhibira chrysin na način, ki je odvisen od odmerka, kot je prikazano z želatino cimografijo testom. Pred našim poskusom bodisi chrysin neposredno inhibira aktivnost MMP-9 ali inhibira ekspresijo MMP-9 je še vedno neznano. Da bi odgovorili na to vprašanje, smo sodelovali inkubirali v AGS-izloča MMP-9 z chrysin 3 ure in želatina cimografijo je bila izvedena za preverjanje končno raven MMP-9 aktivnosti. Kot kaže slika 1B, chrysin ne bi mogla vplivati ​​izloča MMP-9 aktivnosti. Torej, smo predpostavili, da lahko zaviranje chrysin proti MMP-9 preko zatiranje MMP-9 izražanja. Da bi preverili to hipotezo, povratne prepisovanja PCR in MMP-9 promoter analize so bile izvedene za preverjanje ravni prepisovanju MMP-9. Kot je prikazano na sliki 1C, potem ko je bil obdelan z chrysin, PMA-inducirane MMP-9 mRNA zmanjšal na način, odvisen od doze. Poleg tega je bil MMP-9 promotor Luciferazna aktivnost inhibira chrysin na način, odvisen od doze (Slika 1D). In western blot pokazala inhibitornega učinka chrysin na MMP-9 izražanja (slika 1E) prav. Koncentracije chrysin uporabljeni v tej študiji ni vplivala preživetje celic (slika 1F). Ti rezultati kažejo, da chrysin zavira MMP-9 aktivnosti v AGS celicah z znižanjem transkripcijsko učinkovitosti.

Vloga AP-1 v PMA-inducirane MMP-9 izražanja

Kot prejšnja poročali literatura, AP-1 je najpomembnejši transkripcijski dejavnik MMP-9 izražanja [17]. V tej študiji je potrditi, da se AP-1 kritično zahteva ta seveda, zaposluje dovolj AP-1 vaba phosphorothioated dvojno vijačnico oligodeoksinukleotid (ODN) in pGL3-AP-1 luciferazno plazmid za sofinanciranje transfekcijo v AGS celice. Za sočasno transfektiramo celice obdelamo s PMA, in luciferazne aktivnosti so bile določene z uporabo luminometer. Kot je prikazano na sliki 2A so PMA-induciranih aktivnosti luciferazne MMP-9 promotor inhibira vabo AP-1. Dosledno AP-1 vaba inhibira tudi PMA-inducirane MMP-9 mRNA ekspresije (Slika 2B). Pokazalo se je, da podreti AP-1 komponento c-fos in c-Jun zmanjšala tudi PMA-inducirane MMP-9 izražanja (slika 2C). Poleg tega, kurkumin, inhibitor AP-1, prav tako je bila uporabljena za preverjanje vlogo AP-1 v PMA-inducirane MMP-9 izražanja. Kot prikazuje podatke RT-PCR, kurkumin zaviral PMA-inducirane MMP-9 ekspresijo v način odvisen od doze (slika 2D). Zgornji podatki so pokazali, da se AP-1 bistveni faktor v MMP-9 izražanja. Po dokazuje ključno vlogo AP-1 pri visokih ravni MMP-9 izražanja smo predpostavili, da je mehanizem inhibicije chrysin MMP-9 izražanja skozi zatiranje AP-1 aktivnostjo. Pozneje smo AGS celice transficirane z AP-1 luciferaza reporterskih plazmidov obdelamo z chrysin, nato spodbujena z PMA. Kot je prikazano na sliki 2E, chrysin zatreti PMA-inducirano AP-1lucifease aktivnost na način, odvisen od odmerka, ki je pokazala, da ima chrysin sposobnost za zmanjšanje AP-1 aktivnost.

Chrysin inhibira PMA-inducirane MMP-9 izraz z inhibicijo transkripcijski faktor AP-1 preko zatiranje c-jun in c-Fos fosfatnem

znano je, da so c-Jun in c-Fos komponente poti AP-1 [18]. Želeli smo, da se določi mehanizem, ki je zaviralnega učinka chrysin o AP-1, in raziskati, ali chrysin dejansko izvajala svoj vpliv na c-jun in c-Fos. Izmerili smo količino celotnega mRNA tako c-jun in c-Fos z RT-PCR. Kot je prikazano na sliki 2F, chrysin ni zaviral ravni ekspresije c-jun in c-Fos mRNA. Dalje, da preizkusite če chrysin zavira aktivacijo c-jun in c-Fos, je western-blot izvedli za spremljanje fosforilirano c-jun in c-fos. Slika 2G in 2F kaže, da chrysin storil zatreti PMA-inducirane c-jun in c-fos fosforilacijo na način, ki je odvisen od odmerka.

Chrysin zavira c-jun in c-fos fosforilacijo z blokado JNK in ERK signalizacija pot

Naslednja raziskovali, kako chrysin zatreti c-jun in c-fos fosforilacije. Zaradi pomembnih predstav vlogo MAPK pri aktiviranju AP-1, smo raziskovali vlogo MAPK poti v MMP-9 izražanja. Kot je prikazano na sliki 3A, med inhibitorji MAPKs, so PD98059 (ERK1 /2 inhibitor), SP600125 (JNK1 /inhibitor 2), in SB203580 (p38 inhibitor MAPK) le PD98059 in SP600125 lahko inhibira PMA-inducirane MMP-9 izražanja , ki je pokazala, da so lahko ERK1 /2 in JNK1 /2 poti ključnega pomena za PMA-inducirane MMP-9 izražanja. Nadalje, z MEK-prevladujočega negativnega plazmida PMCL-K97M, JNK prevladujoča negativna plazmida PMCL-TAM67 in p38 MAPK prevladujoča negativna plazmida PMCL-mP38, smo potrdili kritične vloge ERK in JNK v MMP-9 izražanja na raka želodca AGS celice (slika 3B). Poleg tega, kot je prikazano na sliki 3C, ERK1 /2 in JNK1 /2 so nujno potrebni za AP-1 sproži PMA, dokazane z eksperimenta z MEK in JNK dominantnih negativnih plazmidov. Naslednjič preverili vlogo JNK1 /2 in ERK1 /2 v c-jun in aktivacijo c-Fos. Kot je prikazano na sliki 3D SP600125 in PD98059 zatreti PMA-inducirano c-jun in c-fos fosforilacija, kar kaže, da je JNK1 /2 kritično gorvodno od c-jun, medtem ERK1 /2 je kritično gorvodno od c-Fos. Ker smo ugotovili, da JNK1 /2 in ERK1 /2 igra bistveno vlogo pri MMP-9 izražanja preko AP-1, smo predpostavili, da chrysin lahko delujejo preko inhibicije JNK1 /2 ali ERK1 /2 za zatiranje MMP-9 izražanja. Da bi preverili našo hipotezo, je western-blot, izvedenih za določitev učinka chrysin na JNK1 /2 ali ERK1 /2 fosforilacije. Kot Slika 3E in 3F kažejo, zdravljenje PMA privedlo do izjemnega povečanja JNK1 /2 in ERK P42 /44 fosforilacijo; Vendar pa, v prisotnosti chrysin, PMA-inducirane JNK1 /2 in ERK1 /2 fosforilacija je zaviral način odvisen od doze.

Vpliv chrysin na celični invazivnosti

To je bilo znano, ki so pomembne za invazivnega fenotipa rakave celice visoko raven MMP-9 izražanja. Da bi preučili vpliv chrysin na PMA-inducirane celične invazije, smo pregledali celično invazijo skozi spremenjene Boyden invazijo komori. AGS celic inkubiranih v PMA povzročilo povečano število napadel celic, ki je potoval skozi umetno Matrigel. Vendar pa v prisotnosti chrysin ali MMP-9 protitelesa, število invadiranih celic zmanjšala, kar kaže chrysin lahko zavirajo PMA-inducirano celično invazivnosti z inhibicijo MMP-9 izražanja (slika 4A in 4B). Poleg tega, slika 4C pokazala chrysin zmanjšala PMA-inducirano AGS invazijo na način, ki je odvisen od odmerka. Dostavo, smo raziskali vpliv inhibitorja signalne na PMA-inducirane AGS celične invazije. Kot je prikazano na sliki 4D, chrysin, kurkumin, PD98059 in SP600125 inhibira celično invazijo s PMA povzročeno, kar kaže, da chrysin verjetno inhibira PMA-inducirane MMP-9 preko AP-1 zatiranje, ki izhaja iz blokiranjem JNK1 /2 in ERK1 /2 poti .

Pogovor

Naravne spojine z ukrepi za boj proti raku motijo ​​razvoj tumorjev in napredovanje raka, tako da inhibira različne mehanizme, vključno s celično migracijo, invazijo, in metastaz. Chrysin, naravni flavonoid pogosto najdemo v številnih rastlinskih izvlečkov, medu in propolisa, ima kemopreventivno lastnosti, kot so antiproliferativne in pro-apoptoze pred različnimi vrstami raka [19,20]. Vendar, anti-invasion lastnosti chrysin niso dobro raziskano v želodčnih rakavih celic. Znano je, da so MMP gonilna sila uničenja zunajceličnega matriksa, kot tudi glavni spodbujevalci celične invazivnosti. Preučevali smo tudi zaviralne učinke chrysin na MMP izražanja v želodcu rakavih celic. Chrysin inhibiran MMP-9 izražanja (slika 1) in druge MMP, kot so MMP-2 in MMP-7 (podatki niso prikazani). Mehanizem regulacije z chrysin lahko odvisna od vsake MMP, in v tej študiji smo se osredotočili na MMP-9 končne uredbe.

PMA, forbol-12-miristat 13-acetata, protein kinaza aktivator, ki se običajno uporablja kot biomedicinske raziskovalno orodje v modelih rakotvornosti. V tej študiji smo ugotovili, PMA povečali MMP-9 aktivnosti z uravnavanjem njene nivo ekspresije. V prisotnosti chrysin, PMA-inducirane MMP-9 zmanjšal na način, ki chrysin-odvisnosti od odmerka (slika 1A). Vendar pa se zdi, da chrysin zavira MMP-9 ne zaradi inhibicije MMP-9 encimske aktivnosti, temveč zaradi zatiranje MMP-9 izražanja. Da bi raziskali mehanizem, s katerim chrysin zavira PMA-inducirane MMP-9 izražanja, smo poskušali odkriti bistveno transkripcijski faktor (e) v PMA- inducirane MMP-9 izražanja poti. Ugotovljeno je bilo, da se AP-1 pozitivni regulator MMP: AP-1 element, ki se nahaja med -72 in -66 igra pomembno vlogo v transkripcijsko urejanja MMP-1 genskega izražanja ter mutacije tega elementa dramatično zmanjša bazalno aktivnost in odzivnost MMP-1 promotor na zunanje dražljaje [21]. V promotorja toku sekvenci regulacijskega MMP-9, obstajata dve AP-1 vezave mest (-533 in -79), ki igrajo bistveno vlogo pri MMP-9 ekspresijo v humanih celicah CaSki [22]. V naši raziskavi, AP-1 umetnih oligodeoksinukleotidi, AP-1 zaviralcem kurkumin, c-jun in c-Fos siRNA moti PMA-inducirane MMP-9 izražanja (slika 2A-2D), ki določa neposredne dokaze, da je AP-1 kritično potrebna za povečanje MMP-9 transkripcijo v želodcu rakavih celic. Osnovi zgornjih rezultatov smo sklepali, da chrysin zavira MMP-9 izražanje zatiranje AP-1 aktivnostjo. Slika 2E prikazuje preverjanje naše špekulacije: chrysin lahko bistveno zmanjša AP-1 aktivnost na način, ki je odvisen od odmerka. V skladu z našim predloženega odkritju, da chrysin zavira AP-1 ciljni gen MMP-9 prek zatirati AP-1 aktivnosti, prav tako so poročali, da chrysin zaviral druge AP-1 ciljnih genov, kot so VEGF, COX-2 in ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. Skladne z drugimi ugotovitvami, da je odkril, da luteolin, obrat flavonoid s podobno strukturo chrysin bistveno zavira LPS inducirane DNA vezavno aktivnost AP-1 [26]. Vendar je inhibitorna sposobnost in mehanizem chrysin na AP-1 ni bila v celoti raziskana pred to študijo. Zato bomo naslednjič raziskovali mehanizem, s katerim chrysin zavira AP-1.

Poleg posredovanje MMP-9 izražanja, AP-1 prav tako izzove ekspresijo invazijo aktivatorjev in zatira invazijo valov. Kot taka, AP-1 je bistvena prepisovalni dejavnik za ureditev, povezanih z invazivnimi genov [27]. AP-1 sestavljajo bodisi homodimers jun družinskih članov ali heterodimerov med člani c-Fos in c-Jun družin. Oba c-Jun in c-Fos sta fosforilirani in aktivira ERK, p38 in JNK kinaznih sistemi [28-30]. Da bi raziskali mehanizem inhibicije chrysin AP-1, smo raziskovali c-jun in c-fos, dveh glavnih komponent AP-1. Ugotovili smo, da chrysin inhibira c-jun in aktivacijo c-fos z blokado njihovega posameznega fosforilacije. V skladu z našimi ugotovitvami, nekatere prejšnje literature tudi poročali, da drugi flavonov npr kvercetin, zmanjšal AP-1 aktivnost s preprečevanjem C-Jun je translokacijo v jedro [31].

Zanimalo nas je, v zaviralnega mehanizma chrysin o c-jun in c-Fos. JNK (c-Jun N-terminalne kinaze), član MAPK (-mitogen aktivira protein kinazo) družino, ki uravnava različne biološke procese, ki so vpletene v tumorigeneze, se šteje, da je bistvena kinaza aktivacije c-Jun [32] . ERK, zunajcelični signalizacija urejena kinaze, igra pomembno vlogo pri uravnavanju različnih celičnih procesov, kot so orožja, diferenciacijo in razvoj [33], in so poročali, da je pomembno kinaze ureja aktiviranje c-fos [34]. V tej študiji smo ugotovili neposredne dokaze v želodcu rakavih celic AGS da JNK kritično potrebnih za aktivacijo c-Jun, medtem ERK je kritična kinaza za aktivacijo c-Fos (prikazano na sl 3D).

Based na zgornje ugotovitve, da bi nadalje raziskali mehanizem chrysin je za zaviranje MMP-9, smo ugotovili, da chrysin imeli sposobnost, da blokira JNK1 /2 in ERK1 /2 fosforilacije (Fig 3E in 3F). V skladu s to ugotovitvijo, so poročali tudi zaviralni učinki drugih flavonov na ERK1 /2.

Liu et al. poročali, da apigenin, A polifenolni flavone (4,5,7-trihydroxyflavone), ki se nahajajo v različnih zelišč in zeleni listnati zelenjavi, zavira migracijo celic preko zatiranje ERK1 /2 fosforilacije v mehurju gladkih mišičnih celic človeških [35]. Prav tako je bila odkrita tudi Ishikawa et al. da H _{2O 2 poveča apoptozo, ki vodi do hitrega fosforilacijo JNK, ERKs in p38 MAPK, kvercetin pa se lahko odpravi aktiviranje teh treh MAPKs v odgovor H 2O 2 [ ,,,0],36].}

v tej študiji smo raziskovali zaviralni učinek chrysin na MMP-9 izražanja in pokazala osnovni mehanizem želodčnega raka AGS celic prvič. Na podlagi naših ugotovitev, bomo opisali hipotetično shematski model, ki ponazarja mehanizem chrysin zaviralno MMP-9 izraz, kot je prikazano na sliki 5. nadaljnje študije je treba opraviti, da razišče, če je nujno encim gorvodno od obeh JNK1 /2 in ERK1 /2, kritično nadzor JNK1 /2 in ERK1 /2 fosforilacije. Če je tako, lahko chrysin neposredno interakcijo z bistveno encima, ki ga je treba temeljito preiskati kot potencialni proti raku terapevtsko.

Različne kemoterapije terapevtskih strategij za zatiranje tumorskih metastaz in prepreči ponovni pojav tumorja so raziskali in zagotavljajo veliko možnosti za izterjave pacientov. V zadnjem času se je uporaba naravnih fitokemikalije prejela obsežno študijo za preprečevanje raka [37]. Poleg tega je vnos s hrano za fitokemikalije pred kratkim prejel pozornost preprečevanju želodčnega raka [38]. V tej študiji smo ugotovili, da lahko, chrysin obdelamo celice zmanjša raka invazivnosti z inhibicijo MMP-9 izražanje skozi zatiranje JNK /c-jun in ERK /c-fos signalnih poteh. Te ugotovitve so lahko koristne dokaze za razvoj prihodnjih terapije proti raku za raka želodca.

• Plos ONE: Izguba izražanju Reprimo, a-p53 povzroča Cell Cycle naloga Gene, povezana z invazivno odru napredovanje tumorjev in P73 izražanja v želodca Cancer
• Plos ONE: Deregulacija med miR-29b /c in DNMT3A je povezana z epigenetsko utišanje CDH1 gena, ki vplivajo mobilni migracije in invazijo v želodcu Cancer