PLoS ONE: Chrysin Угнетает Опухоль Promoter-индуцированный MMP-9 Expression путем блокирования АР-1 путем подавления ERK и JNK путей в рак желудка Cells

Абстрактный
<р> инвазии клеток является важным механизмом метастазирования рака и злокачественных новообразований , Матрица металлопротеиназы-9 (ММР-9) представляет собой важный протеолитический фермент участвует в процессе инвазии раковых клеток. Высокие уровни экспрессии ММР-9 при раке желудка положительно коррелирует с опухолевой агрессивностью и имеют значительную отрицательную корреляцию с временем выживания пациентов. В последнее время механизмы подавления ММР-9 по фитохимические становятся все более расследованы. Хризин, встречающийся в природе химические в растениях, сообщается подавить метастазирование опухоли. Тем не менее, влияние Chrysin на экспрессию ММР-9 при раке желудка не были хорошо изучены. В настоящем исследовании мы проверили эффекты Chrysin на экспрессию ММР-9 в клетках рака желудка, и определили его основной механизм. Мы исследовали влияние Chrysin на ММР-9 экспрессии и активности через RT-PCR, зимографии, промоутер исследования и вестерн-блоттинга в рак желудка AGS клеток человека. Хризин ингибируется форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) индуцированная экспрессия ММР-9 в зависимости от дозы образом. Использование AP-1 приманка олигодезоксинуклеотиды, мы подтвердили, что AP-1 был решающим фактором транскрипции для экспрессии ММР-9. Chrysin заблокирован АР-1 путем подавления фосфорилирования с-Jun и с-Fos через блокирование /2 и ERK1 /2 пути JNK1. Кроме того, AGS клетки, предварительно обработанных РМА показали заметно усиливается инвазивность, который был частично аннулирован Chrysin и ММР-9 антитела. Наши результаты свидетельствуют о том, что хризин могут оказывать по крайней мере часть его противораковой эффекта путем контроля экспрессии ММР-9 путем подавления АР-1 активности через блок сигнальных путей JNK1 /2 и ERK1 /2 в желудочном раковых клетках AGS.
<р> Цитирование: Ся Y, Lian S, хой PN, Yoon HJ, Joo YE, Чей KO и др. (2015) Chrysin Тормозит Опухоль Promoter-индуцированный MMP-9 Expression путем блокирования AP-1 путем подавления ERK и JNK путей в клетках рака желудка. PLoS ONE 10 (4): e0124007. DOI: 10.1371 /journal.pone.0124007
<р> Академический редактор: Pankaj К. Сингх, Университет штата Небраска медицинский центр, США
<р> Поступило: 5 октября 2014 года; Принято: 9 марта 2015 года; Опубликовано: 15 апреля 2015
<р> Copyright: © 2015 Ся и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе
<р> Финансирование:. работа выполнена при финансовой поддержке гранта исследований (0720570) из Национального онкологического центра (www.ncc.re.kr), гранта программы исследований Фундаментальные науки через Национальный научно-исследовательского фонда Корея (NRF) при финансовой поддержке Министерства образования, науки и технологии (2010-0009910, www.moe.go.kr), а также научно-исследовательский медицинский центр (2012-000-9442) грант от корейского научно-инженерного фонда ( www.nrf.re.kr). Все указанные выше спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка в настоящее время занимает второе место в глобальной смертности от рака, по оценкам 990000 новых случаев заболевания и 738,000 случаев смерти от рака в результате ежегодно во всем мире, хотя заболеваемость раком желудка в течение последних нескольких десятилетий [1,2] уменьшилось. Отдаленный орган или метастазирование ткани является признаком плохого прогноза у больных раком желудка. Метастазы является самым фатальным характеристика злокачественных опухолей, что составляет более 90% опухолей, связанных с смертности [2]. Было показано, что химиотерапия и лучевая терапия не может значительно продлить и улучшить качество жизни пациентов, в тех случаях, [3,4]. Опухолевые клетки метастаз представляет собой очень сложный процесс, состоящий из пролиферации, миграции, инвазии, и последующее адгезии и ангиогенеза в других органах и тканях [3].
<Р> Так как вторжение является одним из фундаментальных свойств злокачественных раковых клеток, контроль инвазии, является важным терапевтической мишенью. Cell-внеклеточный матрикс (ECM) взаимодействий, отключение межклеточной адгезии, деградация ECM, и вторжение в лимфатических и кровеносных сосудов являются важными шагами в инвазии и метастазирования рака [5]. Опухоль вторжение требует повышенную экспрессию металлопротеиназ матрикса (ММР) [6]. ММР, семейство цинковых-зависимых эндопептидаз, которые индуцируют вторжение раковых клеток и распространение, играют решающую роль в метастазировании через деградации ECM и базальной мембраны [7]. Матрица металлопротеиназы-9 (ММР-9), известный как 92 кДа типа IV коллагеназы или желатиназа В, является одним из наиболее важных ММР, и кодируется геном ММР-9 в организме человека [8]. Сообщалось, что избыточная экспрессия ММР может увеличить опухолевых клеток отсоединение и метастазирование, которые связаны с злокачественности и плохими клиническими результатами в различных видов рака, включая рак желудка [9,10].
<Р> В связи с функцией MMP- 9 в процессе злокачественной опухоли, подавление уровней ММР-9 является важной стратегией для борьбы с раком. В последние годы все большее внимание было сосредоточено на поиске ингибитор ММР-9, особенно из природных материалов. Ким и др. обнаружил, что силибинин ингибирует PMA-индуцированную экспрессию ММР-9 через подавление ERK фосфорилирования в MCF-7 клеток рака молочной железы человека [11]. Совсем недавно, хой и др. сообщили, что (-) - эпигаллокатехин-3-галлат блокирует никотин-индуцированную MMP-9 экспрессию и инвазивности через подавление NF-kB и АР-1 в эндотелиальных клетках ECV304 [12]. Хризин, 5,7-dihydroxyflavone, тип природного флавоноид, как известно, ингибирует ангиогенез и метастазирование [13,14]. Lin и др. показали, что хризин подавляет IL-6-индуцированный ангиогенез посредством понижающей регуляции растворимого IL-6 рецептора /gp130 /JAK1 /STAT3 /СЭФР сигнального пути [13]. Недавно сообщалось, что хризин может повысить активность каспазы-зависимом апоптозе регулируется TRAIL в клеточной линии НСТ 116 и клеток CNE1 [15]. Ян и др. обнаружили, что хризин подавлено вторжение клеток в зависимости от дозы образом в клетках TNBC. Кроме того, хризин уменьшает метастазирования родственные молекулы виментин, улитку и слизняка, и блокирует сигнальный путь Akt [16]. Тем не менее, ингибирующие эффекты Chrysin на ММР-9, а также механизма, не были хорошо изучены, особенно в раковых клетках желудка. В настоящем исследовании, мы исследовали эффекты Chrysin на PMA-индуцированной экспрессии ММР-9 при раке желудка, и показал свой основной механизм.

Материалы и методы

Культура клеток и условия культивирования
<р> AGS желудка человека линии клеток рака была получена из американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, США). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,6% пенициллина-стрептомицина, при 37 ° С в атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2. Для определения влияния Chrysin на РМА индуцированной экспрессии ММР-9, клетки предварительно обрабатывают различными концентрациями Chrysin, а затем обрабатывали ФМА. Уровень MMP-9 информационной РНК (мРНК), определяли с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) анализа. Роль специфических сигнальных путей в PMA-индуцированной экспрессии ММР-9 были исследованы путем предварительной обработки клетки AGS с ERK 1/2 ингибитора PD98059 (New England Biolabs, Беверли, штат Массачусетс), ингибитор JNK SP600125 (Calbiochem, La Jolla , CA), ингибитор p38 МАРК SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA) и хризин (Sigma Aldrich, США) за 1 час до стимуляции ФМА.

жизнеспособность клеток
<р> Клетки ( 5 × 10 ^{3) инкубировали в 96-луночный планшет в среде RPMI с 10% FBS, содержащей 0-100 мкм Chrysin в течение 24 часов, и клеточного дыхания определяли установленным 3- [4,5-диметилтиазол-2 -ил] -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ, Sigma-Aldrich) анализа. После инкубации 10 мкл 5 мг /мл МТТ добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов и инкубировали при 37 ° С в течение 2-х часов. Формазана Полученные гранулы растворяют в 100% диметилсульфоксиде и оптическую плотность при 570 нм, был обнаружен с 96-луночный ELISA-считывателем (Биотек Inc., Winooski, VT, США).}

Желатин зимографии
<р> Клетки, предварительно обработанные с или без Chrysin в течение 1 часа обрабатывали 100 нМ РМА в течение 20 часов. После инкубации мы собирали супернатант носителя и проводили желатин зимографии, чтобы проверить активность ММР-9. Впоследствии носитель смешивают с равным объемом 2Р-9 activityrazolium B [62,5 мМ Трис-HCl (pH6.8), 25% глицерина, 4% SDS, и 0,01% голубой бромфениловый] и загружали в 7,5% акриламида: бис-акриламид (29: 1; Bio-Rad, США) гель, содержащий 625 мкг /мл желатина (Sigma). После электрофореза гель промывали 2,5% Тритон Х-100 в три раза (20 минут в время), а затем инкубировали в течение 24 часов при 37 ° С, в инкубационном буфере [50 мМ Трис (рН 7,5), 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl <суб> 2, и 1 мкМ ZnCl <суб> 2]. Гели окрашивали кумасси бриллиантовым голубым R250 (Bio-Rad, США) в течение 3-х часов, а затем промывают. Протеолитические активность отразилась в виде прозрачных полос на голубом фоне окрашенного желатина. Загрузка управления для желатина зимографии: Кумасси бриллиантовый синий R-250 гель пятно на 10% додецилсульфата натрия в полиакриламидном без желатина, чтобы показать равное количество супернатанта наносили на каждую дорожку

с обратной транскрипцией PCR
<. р> Суммарную РНК экстрагировали из клеток AGS с использованием реагента TRIzol (Invitrogen). Один мкг общей РНК использовали для синтеза первой цепи комплементарной синтеза ДНК с использованием случайных праймеров и М-MLV транскриптазы (Promega). Комплементарную ДНК подвергали ПЦР-амплификации с наборами праймеров для GAPDH и ММР-9 с использованием раствора специальной смеси ПЦР (интроном, Корея). В специфических праймеров последовательности были следующими: GAPDH смысл, 5'-TTG TTG CCA ТСА ATG ACC CC-3 'и GAPDH-антисмысловой, 5'-TGA САА АГТ ГГТ ВКТ ТГА GG-3' (836 п.н.); и ММР-9 смысл, 5'- AAG TGG CAC CAC CAC AAC при -3 'и ММР-9 антисмысловой, 5'-ТТТ CCC ATC AGC АТТ НКУ GT-3' (497 п.н.); C-Jun смысл, 5'-GGA AAC GAC CTT СТА TGA CGA ТГК CCTCAA-3 ', и с-Jun-антисмыслового, 5'- GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT СТТ-3' (287bp); C-Фос смысл, 5'-CAG TCA GAT САА GGG AAG CCA CAG-АСА ТСТ-3 'и C-Фос антисмысловой, 5'-GAA ТАА GAT GGC ТГК AGC САА АТГ CCG СА-3' (246bp). Условия ПЦР были следующими:. Денатурация при 94 ° С в течение 30 секунд, отжиг при 52 ° С в течение 20 секунд и удлинение при 72 ° С в течение 30 секунд

Измерение ММР-9 активности промотора
<р> регуляции транскрипции ММР-9 была рассмотрена транзиторной трансфекции ММР-9 промотор репортера люциферазы конструкции (PGL4-MMP-9). Плазмиду PGL4-MMP-9 промотор (охватывающий нуклеотиды от -925 до +13) был любезно предоставлен доктором Ен Хан Ли (Конкук университет, Корея). AGS клетки высевают и выращивают, пока они не достигнут 70% слияния. Затем PGL4-MMP-9 промотора плазмиды были трансфицированы в клетки, используя Fugene 6 (Promega, США) в соответствии с протоколом производителя. ПРЛ-ТК трансфицировали в качестве внутреннего контроля. Клетки инкубировали в среде трансфекции в течение 12 ч, а затем обрабатывали ФМА в течение 4-х часов. Эффекты Chrysin на ММР-9 промоторной активности определяли путем предварительной обработки клеток с Chrysin в течение 1 часа перед добавлением ФМА. Исследования Котрансфекция проводились в присутствии или в отсутствие вектора экспрессии, кодирующего доминантный негативный мутант MEK-1 (PMCL-K97M), доминантный негативный мутант JNK (PMCL-TAM67), или доминантный негативный мутант р38 МАРК (PMCL-MP38 ), которые были любезно предоставлены доктором Н.Г. Ahn (Университет Колорадо-Боулдер, Колорадо), д-ром M.J. Birrer (NCI, Rockville, MD), и д-ром Дж Хан (Научно-исследовательский институт Скриппса, Калифорния), соответственно. Клетки собирали с клеточной культуры лизиса реагента (Promega, США), и люциферазные деятельность определяли с помощью фотометра (Centro XS lb960 микропланшет люминометра, Berthold Technologies, США) в соответствии с протоколом производителя.

Переходный трансфекция AP-1 репортер
<р> люциферазы репортер плазмиду AP-1 был приобретен у фирмы Clontech (Palo Alto, CA, USA). Когда AGS клетки достигали 60-70% сплошности, они промывались OPTI-MEM среде и трансфицированы PGL-3 вектором, содержащим АР-1 с использованием репортер Fugene 6 (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Reporter-трансфицированные клетки предварительно обрабатывают с Chrysin в течение 1 ч, а затем обрабатывали 100 нМ РМА в течение 4-х часов и люциферазы деятельности измеряли с помощью фотометра.

Трансфекция АР-1 манок олигодезоксинуклеотидами
<р> на основе связывания ATGAGTCAT сайта AP-1, мы разработали АР-1 приманкой phosphorothioated двухцепочечной олиго дезоксинуклеотид (ODN) следующим образом, 5'-CGST СТТ CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 'и 3 '-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5'. Когда клетки AGS выросли до 60-70% слияния, AP-1 ODNs и PGL4-MMP-9 промотор плазмиды котрансфицируют в клетки с использованием Липофектамина 2000 (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя. После инкубации в течение 20 часов, трансфицированные клетки обрабатывали ФМА в течение 4-х часов и люциферазы активность измеряли с помощью фотометра.

Вестерн-блот-анализ

AGS клетки, обработанные PMA были промыты в фосфатно солевого буферного раствора (PBS) отдельно с помощью трипсин-ЭДТА буфере, и хранили при -70 ° С до тех пор, пока это необходимо. Клеточный белок экстрагировали буфером RIPA [1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (ДСН)] и ингибиторы протеазы (апротинин, лейпептин, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), бензамидин, ингибитор трипсина, ортованадата натрия ). Пятьдесят микрограммов белков затем отделяли от 10% электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и переносили на Hybond-P мембраны (Amersham Pharmacia Biotech). Мембраны были блокированы в TBST растворе, содержащем 5% обезжиренное молоко, инкубировали с первичным антителом в блокирующем растворе в течение ночи при температуре 4 ° С, и промывают три раза с 0,1% твина-20 в Трис-солевом буферном растворе (TBST), с интервалом в 10 минут , Конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) использовали для обнаружения иммунореактивного белка с помощью хемилюминесценции. Были использованы следующие антитела: анти-фосфо-р44 /42 МАРК (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Дэнверз, Массачусетс, США), анти-фосфо-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), анти-MMP- 9 (Cell Signaling Technology), анти-фосфо-с-Фос (Cell Signaling Technology), и анти-фосфо-с-Jun (Cell Signaling Technology). Суммарные уровни белка анализировали путем промывания промокали мембраны с извлекающего раствора, состоящего из 100 мМ 2-меркаптоэтанола, 2% SDS, и 62,5 мМ Трис-HCl (рН 6,7) в течение 30 мин при 50 ° С, а мембрана была тогда повторно зондировали либо с анти-β-актина (Cell Signaling Technology), анти-общее ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), анти-общее JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), анти-с-Фос (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, США) или анти-с-Jun (Santa Cruz).

Матригель инвазия анализ
<р> анализ инвазии клеток проводили с использованием chemotasis камеру 10-луночного (нейро зонд, Gaithersburg, штат Мэриленд, США) с 8 мкМ пор мембраны (Neuro Probe) с добавлением 10% FBS, содержащей RPMI как хемоаттрактанту в нижней палате. AGS клетки (10 ^{5 в 280 мкл) добавляли в верхнюю камеру с РМА в присутствии Chrysin, MMP-9 антитела или неспецифическим IgG, и инкубировали для вторжения в Матригель в течение 24 часов. Для того чтобы определить влияние Chrysin и ингибиторы передачи сигналов по РМА-индуцированное инвазии клеток, AGS клетки предварительно инкубировали с Chrysin, куркумин, PD98059 или SP600125 в течение 1 часа, и инкубировали с РМА в течение 24-часового периода вторжения. Не-вторгшиеся клетки на верхней поверхности каждой мембраны были удалены из камеры, и вторгшиеся клетки на нижней поверхности каждой мембраны окрашивали Быстроразъединяющее Diff набор пятен (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, США) , После двух промывок водой, камеры позволили воздушно-сухой. Число вторгшихся клеток подсчитывали с использованием фазово-контрастного микроскопа.}

Статистика
<р> Данные представлены в виде среднего значения ± SD, и представляют собой среднее по меньшей мере трех отдельных экспериментов, выполненных в трех экземплярах. Различия между каждыми двумя наборами данных определялись т-тестами. Различия, описанные как значимые в тексте соответствуют P
&л;. 0,05

Результаты

Ингибирующий эффект Chrysin на PMA стимулированных ММР-9 Выражение
<р> Для исследования подавляющий эффект Chrysin против повышающей регуляции MMP-9, AGS клетки, предварительно обработанные с Chrysin инкубировали с ПМА, и были выполнены желатином зимографии и анализ оТ-ПЦР. Как показано на фиг.1А, PMA-стимулированный ММР-9 ингибируется Chrysin в зависимости от дозы, как это показано с помощью анализа желатин зимографией. До начала нашего эксперимента, является ли Chrysin непосредственно ингибируют активность ММР-9 или ингибирует экспрессию ММР-9 была до сих пор неизвестна. Чтобы ответить на этот вопрос, мы совместно инкубировали АГС-секретируется MMP-9 с Chrysin в течение 3-х часов, и желатин зимографии проводили для проверки конечного уровня MMP-9 деятельности. Как показывает рис 1B, хризин не может оказывать неблагоприятное воздействие на секретируется ММР-9 мероприятий. Таким образом, мы предположили, что ингибирование Chrysin против ММР-9, может быть путем подавления экспрессии ММР-9. Чтобы проверить эту гипотезу, обратный транскрипции ПЦР и ММР-9 промотора анализы проводили для проверки уровней транскрипции ММР-9. Как показано на рис 1C, после обработки Chrysin, то РМА-индуцированное ММР-9 мРНК уменьшилось в зависимости от дозы образом. Кроме того, ММР-9 активность люциферазы промотора ингибируется Chrysin в зависимости от дозы (рис 1D). И западные блоттинг также показали ингибирующий эффект Chrysin на ММР-9 выражении (рис 1E). Концентрации Chrysin, используемые в настоящем исследовании, не влияет на жизнеспособность клеток (рис 1F). Эти результаты указывают на то, что хризин ингибирует MMP-9 активность в клетках AGS через понижающую транскрипционного эффективности.

Роль AP-1 в РМА-индуцированной экспрессии ММР-9
<р> Как сообщает предыдущая литература, AP-1 является наиболее важным фактором транскрипции в ММР-9 выражением [17]. В этом исследовании, чтобы подтвердить, что AP-1 критически необходим в этом курсе, мы использовали АР-1 приманкой phosphorothioated двухцепочечной олигонуклеотида (ODN) и pGL3-AP-1 люциферазы плазмиды со-трансфекции в клетки AGS. В котрансфицируемым клетки обрабатывали ФМА и люциферазы деятельности определяли с помощью фотометра. Как показано на фиг.2А, РМА-индуцированные активность люциферазы ММР-9 промотора тормозились АР-1 приманку. Последовательно, АР-1 приманка также ингибирует РМА-индуцированную экспрессию ММР-9 мРНК (фиг.2В). Было показано, что сбивая AP-1 компонент с-Fos и С-июнь также снизился PMA-индуцированную ММР-9 выражение (рис 2С). Кроме того, куркумин, ингибитор AP-1, также был использован для проверки роли AP-1 в PMA-индуцированной экспрессии ММР-9. Как показывает данные ОТ-ПЦР, куркумин ингибирует РМА-индуцированную экспрессию ММР-9 в зависимости от дозы (рис 2D). Приведенные выше данные указывают на то, что АР-1 является существенным фактором в выражении ММР-9. После демонстрации решающую роль AP-1 в высоких уровней экспрессии ММР-9, мы выдвинули гипотезу о том, что механизм Chrysin ингибирования экспрессии ММР-9 путем подавления АР-1 активности. Впоследствии AGS клетки, трансфицированные АР-1 люциферазы плазмидами, предварительно обрабатывали с Chrysin, а затем стимулировали ФМА. Как показано на фигуре 2Е, хризин подавлено РМА-индуцированное АП-1lucifease активность в зависимости от дозы, что указывает, что хризин обладает способностью снижать АР-1 активность.

Хризин ингибирует РМА-индуцированное ММР-9 выражение путем ингибирования фактора транскрипции АР-1 с помощью подавления с-Jun и с-Fos фосфорилирования
<р> хорошо известно, что с-Цзюнь и с-Fos являются компонентами AP-1 пути [18]. Мы хотели, чтобы определить механизм за тормозящего действия Chrysin по АП-1, и исследовали, может ли на самом деле оказывали свое влияние на с-Jun и с-Fos хризин. Мы измерили количество суммарной мРНК как с-Jun и с-Fos с помощью RT-PCR. Как показано на рис 2F, хризин не ингибирует уровни экспрессии с-Jun и мРНК с-Fos. Затем, чтобы проверить, является ли хризин ингибирует активацию с-Jun и с-Fos, вестерн-блоттинг проводили для наблюдения за фосфорилированный с-июнь и с-FOS. Рис 2G и 2F показывает, что хризин сделал подавляют PMA-индуцированное с-июнь и с-Fos фосфорилирования в зависимости от дозы.

Chrysin ингибирует с-июнь и с-Fos фосфорилирования, блокируя JNK и ERK сигнализации путь
<р> Далее мы исследовали, как хризин подавлено с-июнь и с-Fos фосфорилирования. Из-за важной роли, которую играет в МАРК активации AP-1, мы исследовали роль МАРК пути экспрессии ММР-9. Как показано на фиг.3А, среди ингибиторов МАРК, PD98059 (ERK1 ингибитор /2), SP600125 (JNK1 ингибитор /2), и SB203580 (ингибитор МАРК р38), только PD98059 и SP600125 были способны подавлять РМА-индуцированную экспрессию ММР-9 , который показал, что ERK1 /2 и JNK1 /2 пути могут иметь решающее значение для РМА-индуцированной экспрессии ММР-9. Кроме того, с MEK-доминантной негативной плазмиды PMCL-K97M, JNK-доминантной отрицательной плазмиду PMCL-TAM67 и р38 МАРК-доминантной отрицательной плазмиду PMCL-MP38, мы подтвердили критические роли ERK и JNK в экспрессии ММР-9 при раке желудка AGS клетки (рис 3б). К тому же, как показано на фиг.3С, ERK1 /2 и JNK1 /2 критически необходим для активации АР-1 ФМА, продемонстрировали через нашего эксперимента с МЕК и JNK доминантных негативных плазмид. Далее мы проверили роли JNK1 /2 и ERK1 /2 в с-Jun и активация с-Fos. Как показано на рис 3D, SP600125 и PD98059 подавлено РМА-индуцированное C-июнь и с-Fos фосфорилирование, соответственно, что указывает на JNK1 /2 критически вверх по течению от с-Jun, в то время как ERK1 /2 критически вверх по течению от с-FOS. Так как мы обнаружили, что JNK1 /2 и ERK1 /2 сыграли существенную роль в экспрессии ММР-9 через AP-1, мы предположили, что хризин может работать через ингибирование JNK1 /2 или ERK1 /2 для подавления экспрессии ММР-9. Для того, чтобы проверить нашу гипотезу о том, Вестерн-блоттинг проводили для определения влияния Chrysin на JNK1 /2 или ERK1 /2 фосфорилирования. Как видно из рис 3Е и 3F показывают, лечение PMA привело к значительному увеличению JNK1 /2 и ЭРК P42 /44 фосфорилирования; Тем не менее, в присутствии Chrysin, РМА-индуцированное JNK1 /2 и ERK1 /2 фосфорилирование ингибируется в зависимости от дозы образом.

Влияние Chrysin на клеточной инвазии
<р> Это было известно что высокие уровни экспрессии ММР-9 имеют большое значение для инвазивного фенотипа раковых клеток. Для изучения влияния Chrysin на PMA-индуцированной инвазии клеток, мы исследовали вторжение клеток через модифицированную вторжения камеры Бойден. AGS клетки, инкубированные в РМА привело к увеличению числа вторгшихся клеток, которые прошли через искусственный Матригель. Тем не менее, в присутствии Chrysin или ММР-9 антителом, число инвазированных клеток уменьшается, что указывает Chrysin может подавлять РМА-индуцированное клеточную инвазивность путем ингибирования ММР-9 выражением (фиг.4А и 4В). Кроме того, фиг.4С показал хризин снизилась РМА-индуцированное AGS инвазии в зависимости от дозы образом. Далее, мы исследовали влияние ингибитора сигнального на PMA-индуцированного AGS инвазии клеток. Как показано на фиг 4D, хризин, куркумин, PD98059 и SP600125 ингибирует инвазию клеток, индуцированную РМА, указывая, что хризин вероятно ингибирует РМА-индуцированное ММР-9 с помощью АР-1 подавления, что является результатом блокирования пути JNK1 /2 и ERK1 /2 .

Обсуждение
<р> Природные соединения с деятельностью противораковых препятствуют развитию опухоли и прогрессии рака путем ингибирования различных механизмов, включая миграцию клеток, инвазию и метастазирование. Chrysin, природный флавоноид широко встречается во многих растительных экстрактов, меда и прополиса, имеет химиопрофилактическую свойства, такие как анти-пролиферативные и про-апоптотических деятельности, направленной против различных видов рака [19,20]. Тем не менее, против вторжения свойства Chrysin не были хорошо изучены в клетках рака желудка. Хорошо известно, что ММР являются силой разрушения внеклеточного матрикса, а также основные индукторами клеточной инвазии. Мы исследовали ингибирующие эффекты Chrysin на экспрессию ММР в желудочном раковых клеток. Хризин ингибирует MMP-9 выражение (рис.1) и других ММР, таких как ММР-2 и ММР-7 (данные не показаны). Механизм регулирования путем Chrysin может быть зависело от каждого ММР, и в этом исследовании мы обратили внимание на regualtion ММР-9
. <Р> РМА, форбол-12-миристат-13-ацетат, протеинкиназа активатор, обычно используется в качестве биомедицинского исследовательского инструмента в моделях канцерогенеза. В этом исследовании мы обнаружили PMA увеличили ММР-9 активности через повышающей регуляции его уровня экспрессии. При наличии Chrysin, то РМА-индуцированное ММР-9 снизилась в хризин-дозозависимым образом (Фиг.1А). Тем не менее, кажется, что хризин ингибирует MMP-9 не из-за ингибирования активности фермента ММР-9, но из-за его подавления экспрессии ММР-9. Для того, чтобы исследовать механизм, с помощью которого хризин ингибирует PMA-индуцированную экспрессию ММР-9, мы попытались обнаружить существенную транскрипционный фактор (ы) в PMA- индуцированной ММР-9 экспрессии пути. Было сообщено, что AP-1 является положительным регулятором ММР: элемент AP-1 расположен между -72 и -66 играет важную роль в регуляции транскрипции экспрессии генов ММР-1, а мутации этого элемента резко уменьшить базальная активность и отзывчивость промотора ММР-1 на внешние раздражители [21]. В промоторной последовательности регул ции выше по потоку MMP-9, есть два АР-1 сайты связывания (-533 и -79), которые играют существенную роль в экспрессии ММР-9 в клетках человека CaSki [22]. В нашем исследовании, AP-1 манок олигонуклеотидами, AP-1 ингибитор куркумина, C-Jun и с-Fos миРНК мешал PMA-индуцированной ММР-9 выражении (рис 2A-2D), который обеспечил прямые доказательства того, что AP-1 является критически требуется увеличить MMP-9 транскрипцию в клетках рака желудка. На основании приведенных выше результатов, мы сделать вывод, что хризин ингибирует экспрессию ММР-9 путем подавления АР-1 активностью. Рис 2E показывает подтверждение нашей спекуляции: хризин может значительно уменьшить АР-1 активность в зависимости от дозы образом. В соответствии с нашим настоящим открытием, что Chrysin ингибирует АР-1 гена-мишени посредством подавления АР-1 активность, оно также было сообщено ММР-9, что хризин ингибирует другие АР-1 генов-мишеней, таких как VEGF, СОХ-2 и ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. В соответствии с другими результатами, было обнаружено, что лютеолин, растение флавоноид с аналогичной структурой в Chrysin, значительно ингибирует ЛПС-индуцированную ДНК-связывающую активность АР-1 [26]. Тем не менее, ингибирующее способность и механизм Chrysin на АР-1 не была полностью исследована до этого исследования. Поэтому дальше изучили механизм, с помощью которого хризин ингибирует АР-1.
<Р> В дополнение к посреднической экспрессию ММР-9, AP-1 также и индуцирует экспрессию инвазии активаторов и репрессирует вторжения супрессоры. Таким образом, АР-1 является существенным фактором для транскрипционной регуляции инвазивных связанных генов [27]. AP-1 состоит либо из гомодимеров членов семьи или гетеродимеров Jun между членами с-Fos и с-Jun семей. И с-июнь и с-Fos фосфорилируются и активируются ERK, p38 и JNK-киназы систем [28-30]. Для того чтобы исследовать механизм Chrysin ингибирования AP-1, мы исследовали с-Jun и С-Fos, два основных компонента AP-1. Мы обнаружили, что хризин тормозится C-Jun и активация с-Fos путем блокирования их соответствующего фосфорилирования. В соответствии с нашими данными, некоторые предыдущие литературе также сообщил, что другие флавоны, например, кверцетин, снижение AP-1 активность путем подавления транслокации С-Джун в ядро ​​[31].
<р> Мы были заинтересованы в дальнейшем ингибиторной механизм Chrysin по с-Jun и с-Fos. JNK (C-Jun N-концевой киназы), член семейства МАРК (митоген-активируемой протеинкиназы), который регулирует широкий спектр биологических процессов, участвующих в онкогенеза, считается существенной киназы активации C-Jun [32] , ЭРК, внеклеточный сигнализации-регулируемой киназы, играет определенную роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как пролиферация, дифференцировка и развитие [33], и было сообщено, что важную киназа, регулирующий активацию с-Fos [34]. В настоящем исследовании мы находим прямое доказательство в рака желудка AGS клеток, которые JNK критически необходим для активации с-Jun, а ЭРК является критическим для активации киназы с-Fos (как показано на рис 3D).
<Р> Based на вышеуказанном заключении, в целях дальнейшего изучения механизма Chrysin по подавлению MMP-9, мы обнаружили, что хризин имели возможность блокировать JNK1 /2 и ERK1 /2 фосфорилирования (рис 3е и 3f). В соответствии с этим выводом, также сообщалось ингибирующие эффекты других флавоны на ERK1 /2.
<Р> Лю и др. Сообщается, что апигенин, A полифенольных флавоновые (4,5,7-trihydroxyflavone), найденный в различных трав и зеленых листовых овощах, ингибирует миграцию клеток через подавление ERK1 /2 фосфорилирования в мочевом пузыре клеток человека гладкой мускулатуры [35]. Кроме того, было обнаружено Ишикава и др. что Н <югу> 2О <югу> 2 увеличивает апоптоз, что приводит к быстрому фосфорилирования JNK, ERKs и р38 МАРК, в то время как кверцетин может отменить активацию этих трех МАРК в ответ на H <суб> 2О <суб> 2 [ ,,,0],36].
<р> В настоящем исследовании мы изучали угнетающее действие Chrysin на экспрессию ММР-9 и выявили основной механизм в рака желудка AGS клеток в первый раз. На основании наших выводов, мы опишем гипотетическую принципиальную модель, иллюстрирующая механизм Chrysin ингибирования экспрессии ММР-9, как показано на рисунке 5. Дальнейшие исследования должны быть проведены, чтобы исследовать, если есть жизненно важного фермента перед как JNK1 /2 и ERK1 /2, критически контролируя JNK1 /2 и ERK1 /2 фосфорилирования. Если да, то хризин может непосредственно взаимодействовать с существенным ферментом, который должен быть тщательно изучена в качестве потенциального противораковых терапевтических.
<Р> Различные адъювантной терапевтические стратегии для подавления метастазов опухоли и предотвращения рецидива опухоли были изучены и обеспечивают множество вариантов для восстановлений пациентов. В последнее время использование природных фитохимические получил обширное исследование по профилактике рака [37]. Кроме того, диетическое потребление фитохимические недавно получил внимание в профилактике рака желудка [38]. В этом исследовании мы обнаружили, что Chrysin обработанные клетки могут уменьшить инвазивность рака с помощью ингибирования экспрессии ММР-9 через подавление JNK /C-Jun и ERK /с-Fos сигнальных путей. Эти данные могут дать полезную доказательства для разработки будущих терапевтических средств против рака для рака желудка.

• PLoS ONE: Потеря экспрессии Reprimo, р53-индуцированного клеточного цикла гена, коррелируется с инвазионной стадии оп…
• PLoS ONE: Дерегуляция между микроРНК-29b /с и Dnmt3a связано с эпигенетической глушителей на CDH1 гена, влияющие миграци…