PLoS One: Chrysin gátolja a tumor promoter által kiváltott MMP-9 expressziója blokkolásával AP-1 via elnyomása ERK és JNK utak gyomorrákban Cells

absztrakt katalógusa

Cell invázió döntő eszköze a rák metasztázis és rosszindulatú. A mátrix metalloproteináz-9 (MMP-9) fontos proteolitikus enzim részt vesz a ráksejtek terjedését folyamatot. Magas szintű expresszióját MMP-9 gyomorrákban pozitívan korrelál a tumor agresszivitását, és szignifikáns negatív korrelációt a betegek túlélési idő. Nemrégiben mechanizmusok elnyomja MMP-9 phytochemicals egyre vizsgálták. Chrysin, egy természetesen előforduló vegyi üzemek, leírták, hogy elnyomja a tumor metasztázis. Ugyanakkor a hatások a Chrysin MMP-9-expresszió gyomorrák nem tanulmányozták. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk hatását chrysin az MMP-9 expresszió gyomorrák sejtek, és megállapította, az annak alapjául szolgáló mechanizmus. Megvizsgáltuk a hatását chrysin az MMP-9 expressziója és aktivitása révén RT-PCR, zimográfia, promoter tanulmány és Western blot humán gyomorrák AGS sejteket. Chrysin gátolta forbol-12-mirisztát-13-acetát (PMA) indukált MMP-9-expresszió dózisfüggő módon. Használata AP-1 csali oligodezoxinukleotidok, azt megerősítette, hogy az AP-1 volt a döntő transzkripciós faktor MMP-9 expresszió. Chrysin blokkolt AP-1 keresztül elnyomása a foszforiláció a c-Jun és a c-Fos keresztül blokkolja a JNK1 /2 és ERK1 /2 útvonalakat. Továbbá, AGS sejteket előkezeltük PMA mutatott jelentősen fokozódik invazivitását, amelyet részben megszünteti Chrysin és MMP-9 antitest. Eredményeink azt sugallják, hogy Chrysin fejthet legalább részben annak rákellenes hatását szabályozásával MMP-9 expressziója révén elnyomása AP-1 aktivitás keresztül egy blokk a JNK1 /2 és ERK1 /2 jelátviteli útvonalak a gyomorrák AGS sejteket.

Citation: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin gátolja a tumor promoter által kiváltott MMP-9 expressziója blokkolásával AP-1 via elnyomása ERK és JNK utak a gyomor rákos sejteket. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10,1371 /journal.pone.0124007 katalógusa

Akadémiai Kiadó: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: október 5, 2014; Elfogadva: március 9, 2015; Megjelent: április 15, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Xia et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír. katalógusa

Forrás: Ezt a munkát támogatott a kutatási támogatás (0720570) a National Cancer Center (www.ncc.re.kr), Basic Science Research Program támogatási át a Nemzeti Kutatási Alapítvány Korea (NRF) finanszírozza az Oktatási Minisztérium, Tudományos és Technológiai (2010-0009910, www.moe.go.kr) és a Medical Research Center (2012-000-9442) támogatás a koreai Tudományos és Műszaki Alapítvány ( www.nrf.re.kr). Az összes fent finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezetés katalógusa

a gyomorrák jelenleg a második helyen áll a globális rák okozta halálozás, a körülbelüli 990.000 új esetet és 738.000 rákos halálesetek világszerte évente, bár az előfordulási gyomor carcinoma csökkent az elmúlt évtizedekben [1,2]. Távoli szerv vagy szövet áttét jele a rossz prognózisú betegeknél gyomorrák. Metastasis a leginkább halálos jellemző a rosszindulatú daganatok, számviteli több mint 90% -a tumor kapcsolatos haláleset [2]. Bebizonyosodott, hogy a kemoterápia és sugárkezelés nem tudja jelentősen meghosszabbítja, és javítja az életminőséget a betegek Azokban az esetekben, [3,4]. Tumor sejtek metasztázis egy nagyon összetett folyamat, amely a proliferáció, migráció, invázió, és az azt követő tapadást és az angiogenezis, más szervek vagy szövetek [3].

Mivel invázió egyik alapvető tulajdonságait rosszindulatú rákos sejtek, ellenőrző invázió, fontos terápiás célpont. Cell-extracelluláris mátrix (ECM) kölcsönhatások lekapcsolása intercelluláris adhéziós degradációja az ECM és az invázió nyirok és véredények fontos lépést jelent a rák terjedését és áttét [5]. A tumor invázió igényel fokozott expressziója a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) [6]. Az MMP-k, egy család cink-függő endopeptidáz, amely indukálja a rákos sejtek invázióját és elterjedése, döntő szerepet játszanak metasztázis keresztül lebomlását az ECM és a bazális membrán [7]. A mátrix metalloproteináz-9 (MMP-9), ismert, mint a 92 kDa típus-IV kollagenáz vagy zselatináz B, az egyik legfontosabb MMP-k, és kódolja a MMP-9 gén emberben [8]. Leírták, hogy a túlzott mértékű expressziója az MMP-k növelhetik a tumorsejtek leválás és metasztázis, amely összefüggésbe hozható a rosszindulatúság és rossz klinikai eredmények különböző rákokban, beleértve a gyomorrák [9,10].

Mivel a funkció a MMP 9 során rosszindulatú daganat, az elnyomás az MMP-9 szint egy fontos stratégia vezérlésére rák. Az utóbbi években egyre nagyobb figyelem középpontjában megállapító MMP-9 inhibitor, különösen a természetben előforduló anyagok. Kim és mtsai. Felismertük, hogy szilibinin gátolja PMA-val indukált MMP-9 expressziója révén elnyomása ERK foszforiláció MCF-7 humán emlőrák-sejtek [11]. Újabban Khoi et al. számolt be, hogy (-) - Epigallocatechin-3-gallát blokkok nikotin által indukált MMP-9 expresszió és invazivitását keresztül elnyomása az NF-kB és az AP-1 endoteliális ECV304 sejtekben [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, olyan típusú természetben előforduló flavonoid, már ismert, hogy gátolják az angiogenezist és a metasztázist [13,14]. Lin et al. kimutatták, hogy Chrysin elnyomja az IL-6 által indukált angiogenezist keresztül, leszabályozza az oldható IL-6 receptor /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF jelátviteli útvonal [13]. Mostanában úgy tűnik, hogy chrysin növelheti a kaszpáz-függő apoptózis szabályozza TRAIL HCT 116 sejtvonal és CNE1 sejtek [15]. Yang és mtsai. Felismertük, hogy Chrysin elfojtott sejtek invázióját dózis-függő módon TNBC sejtekben. Sőt, Chrysin csökken metasztázis-rokon molekulák vimentin, csiga és meztelen csiga, és blokkolja az Akt jelátviteli útvonal [16]. Azonban a gátló hatását Chrysin MMP-9, valamint a mechanizmus, nem alaposan tanulmányozták, különösen a gyomor rákos sejtekben. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk chrysin hatását a PMA-indukált MMP-9 expresszió gyomorrák, és kiderült, az alapjául szolgáló mechanizmus. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Sejttenyésztés és tenyésztési körülmények katalógusa

a AGS humán gyomorrák sejtvonalat az American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). A sejteket RPMI-1640 kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS) és 0,6% penicillin-sztreptomicin 37 ° C hőmérsékleten olyan atmoszférában, amely 5% CO _{2. Annak meghatározására, hatásainak Chrysin a PMA által indukált MMP-9 expresszióját, a sejteket előkezeltük különböző koncentrációjú Chrysin, majd hozzáadunk PMA. A szint MMP-9 messenger RNS (mRNS) úgy határoztuk meg, reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció (RT-PCR) elemzéssel. A szerepe a specifikus jelátviteli utak a PMA-val indukált MMP-9 expresszióját vizsgáltuk előkezelésével AGS sejteket a ERK 1/2 inhibitor PD98059 (New England Biolabs, Beverly, MA) a JNK inhibitor SP600125 (Calbiochem, La Jolla , CA), a p38 MAPK-inhibitor SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA), és Chrysin (Sigma Aldrich, USA) 1 óra stimulálás előtt a PMA-val.}

a sejtek életképességét

a sejteket ( 5 × 10 ^{3) inkubáltuk egy 96 lyukú lemez RPMI, 10% FBS-t tartalmazó 0-100 jiM Chrysin 24 órán át, és a sejtlégzés határoztuk meg egy megállapított 3- [4,5-dimetil-tiazol-2 -il] -2,5-difenil-bromid (MTT; Sigma-Aldrich) vizsgálatban. Az inkubálás után 10 ul 5 mg /ml MTT-t adtunk minden egyes lyukba a 96 lyukú lemezeken, és inkubáljuk 37 ° C-on 2 órán át keverjük. A formazán kapott granulátumokat feloldottuk 100% -os dimetil-szulfoxidban, és az abszorbanciát 570 nm-en detektáltuk egy 96-lyukú ELISA-leolvasóval (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).}

Zselatin zimográfia katalógusa

a sejteket előkezeltük vagy anélkül Chrysin 1 órán kezeltünk 100 nM PMA 20 órán át. Az inkubáció után összegyűjtöttük a média felülúszót és végre zselatin zimográfiával, hogy ellenőrizze a MMP-9 aktivitás. Ezt követően, a tápközeget összekeverünk azonos térfogatú 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM Tris-HCl-t (pH = 6,8 értéken), 25% glicerin, 4% SDS, és 0,01% brómfenolkék], és felvittük egy 7,5% -os akrilamid: biszakrilamid (29: 1; Bio-Rad, USA) tartalmazó gélt 625 ug /ml zselatin (Sigma). Az elektroforézis után a gélt mossuk, 2,5% Triton X-100-három alkalommal (20 perc idő), majd 24 órán keresztül inkubáltuk 37 ° C hőmérsékleten, az inkubációs pufferben [50 mM Tris (pH = 7,5), 100 mM nátrium-klorid, 5 mM CaCI _{2, és 1 jiM ZnCI 2]. A géleket megfestettük Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) 3 órán át, majd leöblítjük. Fehérjebontó aktivitást tükrözi világos sávok a kék alapon a megfestett zselatin. A terhelés ellenőrzése zselatin zimográfiával: Coomassie Brilliant Blue R-250 festékkel 10% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél nélkül a zselatin, a megjeleníthető azonos mennyiségű felülúszót felvittük mindegyik sávban.}

reverz transzkripciós PCR

Teljes RNS-t kivontuk a AGS sejtekből TRIzol reagenssel (Invitrogen). Egy ug teljes RNS-t használják első szál komplementer DNS-szintézis alkalmazásával random primerek és M-MLV-transzkriptáz (Promega). A komplementer DNS-t vetjük alá PCR-amplifikációs primer készleteket a GAPDH és MMP-9 alkalmazásával PCR Master Mix-oldatot (Intron, Korea). A specifikus primerek szekvenciáit a következők voltak: GAPDH értelemben, 5'-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 'és GAPDH antiszensz, 5'-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 bp); és MMP-9 értelemben, 5'-AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT -3 'és MMP-9 antisense, 5'-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3' (497 bp); c-Jun értelemben, 5'-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ', és a c-Jun antiszensz, 5'-GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3' (287bp); c-Fos értelemben, 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 'és C-Fos antiszensz, 5'-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3' (246bp). A PCR-körülmények a következők voltak: denaturálás 94 ° C-on 30 másodpercig, lánckapcsolódás 52 ° C-on 20 másodpercig, és kiterjesztés 72 ° C-on 30 másodpercig.

mérése MMP-9 promoter aktivitását katalógusa

a transzkripciós szabályozása az MMP-9-t vizsgáltuk a tranziens transzfekciója egy MMP-9 promóter-luciferáz riporter konstrukcióval (pGL4-MMP-9). A plazmid pGL4-MMP-9-promóter (átívelő nukleotid távolságra -925 a 13) volt szíves rendelkezésünkre Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Korea). AGS sejteket oltottunk, és növesztjük, amíg elérték a 70% -os összefolyásig. Ezután a pGL4-MMP-9-promoter plazmidokat transzfektáltunk a sejtekbe, FuGENE 6 (Promega, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja. PRL-TK-t transzfektáltunk, mint belső kontroll. A sejteket a transzfekciós közegben 12 órán át, majd hozzáadunk PMA 4 órán át. A hatások a Chrysin MMP-9 promoter aktivitást úgy határoztuk meg, előkezeljük sejteket Chrysin 1 óra hozzáadása előtt PMA. A ko-transzfekcióval vizsgálatokat végeztek jelenlétében vagy távollétében kódoló expressziós vektor a domináns negatív mutáns MEK-1 (PMCL-K97M), domináns negatív mutáns JNK (PMCL-TAM67), vagy domináns negatív mutáns p38 MAPK (PMCL-mP38 ), amelyek kedves melyet Dr. NG Ahn (University of Colorado-Boulder, CO), Dr. M. J. Birrer (NCI, Rockville, MD), és Dr. J. Han (Scripps Research Institute, CA) volt. A sejteket egy sejttenyészet lízis reagenst (Promega, USA), és a luciferáz aktivitásokat alkalmazásával határoztuk meg luminométer (centro XS lb960 microplate luminométer, Berthold Technologies, USA), a gyártó utasításai szerint.

Tranziens transzfekciója AP-1 riporter

az AP-1 luciferáz riporter plazmidot forgalmazza a Clontech (Palo Alto, CA, USA). Amikor AGS sejtek elérték a 60-70% összefolyás, akkor mostuk Opti-MEM-tápközegben, és transzfektált pGL-3 vektor, amely az AP-1 riporter FuGENE 6 (Promega), a gyártó protokollja szerint. Reporter-transzfektált sejteket előkezeljük Chrysin 1 óra, majd hozzáadunk 100 nM PMA 4 órán át, és a luciferáz-aktivitás mértük luminométer.

transzfekciója az AP-1 csalétek oligodezoxinukleotidok

Ennek alapján az AP-1-kötő hely ATGAGTCAT, megterveztük az AP-1 csalétek phosphorothioated kettős szálú oligo dezoxi-nukleotid (ODN), a következő, 5'-CGsT CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 'és 3 "-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5 '. Amikor az AGS sejtek nőtt 60-70% összefolyás, AP-1 ODN és pGL4-MMP-9-promoter plazmidokat együtt transzfektáltuk a sejtekbe Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja. Inkubálás után 20 órán át, a transzfektált sejteket PMA-val 4 órán át, és a luciferáz-aktivitás mértük luminométer.

Western-blot-analízis

AGS kezelt sejtek PMA mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), kihelyezett tripszin-EDTA pufferben, és -70 ° C-on, amíg szükséges. A celluláris fehérjét extraháljuk RIPA pufferrel [1% NP-40, 0,5% nátrium-dezoxikolát, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS)] és a proteáz-inhibitorok (aprotinin, leupeptin, fenilmetánszulfonil (PMSF), benzamidin, tripszin inhibitor, a nátrium-ortovanadát ). Ötven mikrogramm fehérjék ezután elválasztottuk 10% SDS-poliakrilamid gél elektroforézis és Hybond-P membránokra (Amersham Pharmacia Biotech). A membránokat blokkoltuk egy TBST oldatban, amely 5% sovány tej, inkubáltuk elsődleges antitestet blokkoló oldatban egy éjszakán át 4 ° C-on, és háromszor mostuk 0,1% Tween-20-trisz-pufferrel pufferelt sóoldatban (TBST) 10 perces időközökben . Tormaperoxidázzal konjugált másodlagos antitestet (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) használtunk, hogy észleli a immunreaktív fehérjéket kemilumineszcenciás. A következő ellenanyagokat alkalmaztuk: anti-foszfo-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), az anti-foszfo-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), az anti-MMP 9 (Cell Signaling Technology), anti-foszfo-c-Fos (Cell Signaling Technology), és anti-foszfo-c-Jun (Cell Signaling Technology). A teljes protein szinteket vizsgáltuk mosás a blotoljuk membrán egy sztrippelő oldatban, amelynek összetétele 100 mM 2-merkapto-etanol, 2% SDS-t, és 62,5 mM Tris-HCl-t (pH = 6,7) 30 percig 50 ° C hőmérsékleten, és a membránt ezután újra szondáztuk vagy az anti-β-aktin (Cell Signaling Technology), anti-összes ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-teljes JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA), vagy anti-c-Jun (santa Cruz).

Matrigel inváziós vizsgálat

a sejt inváziós vizsgálati eljárás alkalmazásával hajtottuk végre a 10-lyukú chemotasis kamra (Neuro Probe, Gaithersburg, Maryland, USA), 8 um pórusméretű membránon (Neuro Probe), 10% FBS-t tartalmazó RPMI mint a kemoattraktáns az alsó kamrában. AGS sejteket (10 ^{5 280 ul) adunk felső kamrába PMA jelenlétében Chrysin, MMP-9 ellenanyag vagy nem specifikus IgG-t, és inkubáltuk, hogy megszállják a Matrigel 24 órán keresztül. Annak érdekében, hogy meghatározzuk a hatását Chrysin és jelző inhibitorok PMA-val indukált sejtek invázióját, AGS sejteket előinkubáljuk Chrysin, kurkumin, PD98059, vagy SP600125 1 óra, és inkubáltuk PMA meg a 24 órás invázió időszakban. A nem-behatoló sejtek a felső felület egyes membrán kivettük a kamrából, és a betörő sejtek az alsó felületén mindegyik membrán megfestettük A Quick-Diff folt kitet (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Miután két vizes mosás, a kamarák hagytuk levegőn megszáradni. A számát sejtek megtámadása megszámoltuk egy fáziskontraszt-mikroszkóp alatt.}

Statisztika

Adat mutatjuk átlag ± SD, és átlagát jelentik, legalább három független kísérletet három párhuzamosban végeztük. Közötti különbségek minden két adathalmaz határoztuk t-próba. Különbségeknek jelentősnek a szövegben megfelelnek az P katalógusa < 0,05. Katalógusa

Eredmények katalógusa

gátló hatásának chrysin a PMA-val stimulált MMP-9 expresszió katalógusa

Annak vizsgálatára, szuppresszív hatását Chrysin ellen túlszabályzását MMP-9, AGS sejteket előkezeltük Chrysin inkubáltuk PMA és zselatin zimográfiával és RT-PCR analízist végeztünk. Amint az 1A ábra, PMA-stimulált MMP-9-t gátolta Chrysin dózis-függő módon az ábrán keresztül a zselatin zimográfiás vizsgálati eljárásban. Mielőtt a kísérlet, hogy Chrysin közvetlenül gátolta a tevékenység az MMP-9 vagy gátolta az MMP-9 még nem volt ismert. A választ erre a kérdésre, mi együtt inkubáljuk a AGS kiválasztódó MMP-9 chrysin 3 óra, és a zselatin zimográfiával végeztünk, hogy ellenőrizze a végső szint a MMP-9 aktivitás. Ahogy 1B ábra mutatja, chrysin nem befolyásolja kiválasztódik az MMP-9 aktivitásokat. Tehát feltételeztük, hogy a gátlása Chrysin ellen MMP-9 lehet keresztül elnyomása MMP-9 expresszióját. Annak ellenőrzésére, ezt a hipotézist, fordított transzkripciós PCR és MMP-9-promoter vizsgálatokat végeztünk, hogy ellenőrizze a MMP-9 transzkripciós szinteket. Ábrán látható 1C, miután kezelt Chrysin, a PMA-val indukált MMP-9 mRNS csökkent dózis-függő módon. Továbbá, az MMP-9-promoter a luciferáz aktivitást gátolja Chrysin dózis-függő módon (ábra 1D). És Western-blot azt is kimutatta, a gátló hatását Chrysin MMP-9 expresszióját (ábra 1E). A koncentrációk Chrysin használható a jelen tanulmány nem befolyásolja a sejtek életképességét (ábra 1F). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy Chrysin gátolja az MMP-9-aktivitás AGS sejtekben keresztül csökkenti a transzkripciós hatékonyság.

szerepe az AP-1 in PMA-val indukált MMP-9 expressziós

Amint arról a korábbi irodalom, AP-1 a legfontosabb transzkripciós faktor az MMP-9 expresszióját [17]. Ebben a vizsgálatban, hogy erősítse meg, hogy az AP-1 kritikusan szükség ebben persze alkalmazott egy AP-1 csalétek phosphorothioated kettős szálú oligonukleotid (ODN), és pGL3-AP-1 luciferáz-plazmid, hogy együtt transzfektálására a AGS sejteket. A ko-transzfektált sejteket kezeltük PMA és a luciferáz aktivitásokat alkalmazásával határoztuk meg egy luminométer. Amint azt a 2A ábra, a PMA-val indukált MMP-9 promoter luciferáz aktivitásokat gátolta az AP-1 csalétek. Ezzel összhangban az AP-1 csalétek is gátolta a PMA által indukált MMP-9 mRNS-expresszió (2B ábra). Kimutatták, hogy bontani az AP-1 komponens c-Fos és a c-Jun is csökkent PMA-val indukált MMP-9 expresszió (2C ábra). Sőt, kurkumin, egy AP-1-inhibitor, is alkalmaztunk, hogy ellenőrizze a szerepét az AP-1 in PMA-val indukált MMP-9 expresszióját. Mivel az RT-PCR-adatok szemlélteti, a kurkumin gátolta PMA-val indukált MMP-9-expresszió dózisfüggő módon (ábra 2D). A fenti adatok azt mutatják, hogy az AP-1 a lényeges tényező az MMP-9-expresszió. Miután bizonyítva a döntő szerepet az AP-1, a magas szintű MMP-9 expresszióját, feltételeztük, hogy a mechanizmus a Chrysin gátlása Az MMP-9-expresszió volt keresztül a szuppresszió az AP-1 aktivitását. Ezt követően, AGS transzfektált sejtek az AP-1 luciferáz riporter plazmidok előkezeltük Chrysin, majd által stimulált PMA. Ábrán látható 2E, Chrysin elnyomott PMA-val indukált AP-1lucifease aktivitás dózis-függő módon, ami azt jelezte, hogy Chrysin van egy képessége, hogy csökkentse az AP-1 aktivitását.

Chrysin gátolja PMA-val indukált MMP-9 expresszió gátlása transzkripciós faktor AP-1 keresztül elnyomása a c-Jun és a c-Fos foszforiláció

jól ismert, hogy a c-Jun és a c-Fos komponensei az AP-1 útvonal [18]. Azt akartuk, hogy meghatározzák a mechanizmus mögött Chrysin a gátló hatást az AP-1, és vizsgáltuk, hogy Chrysin ténylegesen gyakorolt ​​hatása a c-Jun és a c-Fos. Mértük az összeg a teljes mRNS mindkét c-jun és c-Fos RT-PCR-rel. Ábrán látható 2F, Chrysin nem gátolta az expressziós szintek a c-Jun és a c-Fos-mRNS. Ezután a teszt, ha Chrysin gátolja az aktiválás a c-Jun és a c-Fos, Western-blot vizsgálatot végeztünk, hogy figyelemmel kíséri a foszforilált c-jun és c-Fos. Ábra 2G és 2F azt mutatja, hogy Chrysin tette elnyomják a PMA-val indukált c-jun és c-Fos foszforiláció dózis-függő módon.

Chrysin gátolja a c-Jun és a c-Fos foszforiláció blokkolásával JNK és ERK jelátviteli útvonal katalógusa

A következőkben megvizsgáltuk, hogyan chrysin elnyomott c-Jun és a c-Fos foszforiláció. Mivel a fontos szerepet MAPK játszik az aktiválási az AP-1, megvizsgáltuk a szerepe a MAPK útvonal MMP-9 expresszióját. Ábrán látható a 3A, többek között a MAPK inhibitorok, PD98059 (ERK1 /2-inhibitor), SP600125 (JNK1 /2-inhibitor), és az SB203580 (p38 MAPK-inhibitor), csak PD98059 és SP600125 képesek voltak gátolni a PMA-indukált MMP-9 expressziós , ami azt jelezte, hogy az ERK1 /2 és a JNK1 /2 útvonalakat, kritikus lehet a PMA-indukált MMP-9 expresszióját. Ezen túlmenően, a MEK-domináns negatív plazmid PMCL-K97M, JNK-domináns negatív plazmid PMCL-TAM67 és a p38 MAPK-domináns negatív plazmid PMCL-mP38, azt megerősítette a kritikus szerepét ERK és JNK az MMP-9-expresszió gyomorrák AGS sejtek (3B ábra). Továbbá, amint azt a 3C, ERK1 /2 és a JNK1 /2 kritikusan szükséges AP-1 aktiválás PMA, keresztül bizonyította a kísérlet MEK és JNK domináns negatív plazmidok. Mi a következő ellenőrzött szerepeinek JNK1 /2 és ERK1 /2 c-Jun és a c-Fos aktiváció. Ábrán látható a 3D, SP600125 és PD98059 elnyomott PMA-val indukált c-jun és c-Fos foszforiláció, jelezve, hogy a JNK1 /2 kritikusan upstream a c-Jun, míg az ERK1 /2 kritikusan upstream a c-Fos. Mivel felfedeztük, hogy a JNK1 /2 és ERK1 /2 játszott lényeges szerepet az MMP-9-expresszió keresztül az AP-1, feltételeztük, hogy Chrysin működhet keresztül gátlása JNK1 /2 vagy ERK1 /2, hogy elnyomja az MMP-9-expresszió. Annak ellenőrzésére, Hipotézisünkkel Western-blot vizsgálatot végeztünk annak meghatározására, hogy a Chrysin a JNK1 /2 vagy az ERK1 /2 foszforiláció. Ahogy ábra 3E és 3F show, a PMA kezelés eredményeként jelentős növekedést JNK1 /2 és ERK p42 /44 foszforiláció; Azonban jelenlétében Chrysin, PMA-val indukált JNK1 /2 és ERK1 /2 foszforiláció gátolja dózis-függő módon.

hatása Chrysin on sejt behatolásra

Már ismert, hogy a magas MMP-9 expresszió fontos a invazív fenotípusának rákos sejteket. Annak vizsgálata hatását chrysin a PMA-indukált sejtek invázióját, megvizsgáltuk a sejtek invázióját egy módosított Boyden invázió kamrában. AGS inkubált sejtekhez PMA eredményezett megnövekedett számú megszállták sejtek áthaladt a mesterséges Matrigel. Azonban jelenlétében Chrysin vagy MMP-9 antitest, a szám a inváziót sejtek csökkent, jelezve, Chrysin elnyomhatja a PMA-val indukált sejt behatolásra gátlásával MMP-9 expresszióját (ábra 4A és 4B). Ezen túlmenően, ábrán 4C kimutatta Chrysin csökkent PMA-val indukált AGS invázió dózis-függő módon. Ezután megvizsgáltuk a hatását a jelátviteli inhibitor PMA-indukált AGS sejt inváziót. Ábrán látható a 4D, Chrysin, kurkumin, PD98059 és SP600125 gátolta sejtek invázióját által indukált PMA, jelezve, hogy Chrysin valószínűleg gátolja a PMA-val indukált MMP-9 keresztül az AP-1-szuppresszió, ami blokkolja a JNK1 /2 és ERK1 /2 útvonalakat .

Discussion

a természetben előforduló vegyületek rákellenes tevékenységet rontja a tumor fejlődése és progressziója rák gátlásával különböző mechanizmusok, beleértve a sejtek migrációját, invázió, és a metasztázist. Chrysin, egy természetes flavonoid széles körben megtalálható számos növényi kivonatok, méz, és a propolisz, MTA kemopreventív tulajdonságok, mint például az anti-proliferatív és a pro-apoptózis elleni tevékenységet különféle rákok [19,20]. Azonban az anti-invázió tulajdonságait Chrysin nem alaposan tanulmányozták gyomor rákos sejtekben. Köztudott, hogy az MMP-k az erő mögött a megsemmisítése az extracelluláris mátrix, valamint a fő induktorai sejt behatolásra. Vizsgáltuk a gátló hatásait Chrysin az MMP-k expresszióját gyomor rákos sejtekben. Chrysin gátolta az MMP-9-expresszió (1. ábra) és más MMP-k, mint például az MMP-2 és MMP-7 (az adatokat nem mutatjuk be). A szabályozás mechanizmusa chrysin lehet függött minden MMP, és ebben a tanulmányban arra összpontosítunk MMP-9 alól. Katalógusa

A PMA forbol-12-mirisztát-13-acetát, a protein kináz aktivátor, ami általánosan használt mint orvosbiológiai kutatási eszközként modellek kialakulásában. Ebben a vizsgálatban, felfedeztük, PMA növelte az MMP-9 aktivitását keresztül fokozza a saját expressziós szintet. Jelenlétében Chrysin, a PMA-val indukált MMP-9 csökkent egy Chrysin-dózis-függő módon (1A ábra). Úgy tűnik azonban, hogy Chrysin gátolja az MMP-9 nem azért, mert az MMP-9 enzim aktivitása, de köszönhetően a elnyomása az MMP-9-expresszió. Annak vizsgálatára, a mechanizmus, amellyel Chrysin gátolja PMA-val indukált MMP-9 expresszióját, megpróbáltuk feltárni az alapvető transzkripciós faktor (ok) a PMA- indukált MMP-9 expressziós útvonal. Leírták, hogy az AP-1 a pozitív szabályozója MMP-k: az AP-1 elem között helyezkedik el -72 és -66 jelentős szerepet játszik a transzkripciós szabályozása MMP-1 gén expresszió, és a mutációk ezen elem jelentősen csökkenti a alapaktivitását és fogékonyság a MMP-1 promoter a külső ingerekre [21]. Az MMP-9-promoter upstream szabályozás szekvenciát, két AP-1-kötő helyek (-533 és -79), amelyek szerepet játszanak az MMP-9-expresszió emberi CaSki-sejtek [22]. Tanulmányunkban az AP-1 csali oligodezoxinukleotidok, AP-1 inhibitor kurkumin, a c-Jun és a c-Fos siRNS beavatkoztak PMA-indukált MMP-9 expresszió (2A-2D), amely során a közvetlen bizonyíték arra, hogy az AP-1 kritikusan szükség, hogy növeljék az MMP-9-transzkripciót gyomor rákos sejtekben. A fentiek alapján eredményeket, azt következtetni, hogy Chrysin gátolja az MMP-9-expresszió visszaszorítása az AP-1 aktivitását. Ábra 2E mutatja az ellenőrző mi spekuláció: Chrysin jelentősen csökkentheti az AP-1 aktivitás dózis-függő módon. Összhangban a jelen felfedezés, hogy Chrysin gátolja az AP-1 célzott gén MMP-9 keresztül elnyomja az AP-1 aktivitás, ez is leírták, hogy az Chrysin gátolta más AP-1 célgének, mint a VEGF, a COX-2 és az ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. Összhangban más megállapítások, azt fedezték fel, hogy a luteolin, egy növény flavonoid egy hasonló szerkezetű Chrysin, jelentősen gátolja az LPS-sel indukált DNS-kötő aktivitást AP-1 [26]. Azonban a gátló képessége és mechanizmusa chrysin az AP-1 még nem vizsgálták meg alaposan, mielőtt ebben a vizsgálatban. Ezért következő vizsgáltuk a mechanizmus, amely által Chrysin gátolja az AP-1.

Amellett, hogy közvetítő MMP-9 expresszióját, az AP-1 szintén mindkét expresszióját indukálja invázió aktivátorok és elnyomja invázió szupresszorok. Mint ilyen, az AP-1 nélkülözhetetlen transzkripciós faktor szabályozásának invazív kapcsolatos gének [27]. AP-1 a következők egyikéből áll homodimerek június családtagok vagy heterodimerek tagjai között a c-fos és c-Jun családok. Mindkét c-Jun és a c-Fos foszforilezzük, és aktiválja az ERK, p38, és JNK kináz rendszerek [28-30]. Annak érdekében, hogy vizsgálja meg a mechanizmus a Chrysin gátlás az AP-1, megvizsgáltuk a c-Jun és a c-Fos, a két fő komponens az AP-1. Felfedeztük, hogy chrysin gátolja a c-Jun és a c-Fos aktiváció gátlásával saját foszforiláció. Összhangban a megállapítások, néhány korábbi irodalmi is beszámolt, hogy más isoflavonok például kvercetin, csökkent AP-1 aktivitás révén elnyomja a c-Jun transzlokáció a sejtmagba. [31] katalógusa

Mi volt a további érdekelt chrysin a gátló mechanizmus c-Jun és a c-Fos. JNK (c-Jun N-terminális kináz), tagja a MAPK (mitogén-aktivált protein-kináz) család, amely szabályozza egy sor biológiai folyamatok játszik a tumorigenezis, kell tekinteni az alapvető kináz c-Jun aktiválását [32] . ERK, extracelluláris jelátviteli szabályozott kináz, szerepet játszik a szabályozás a különböző sejtes folyamatokat, mint a proliferáció, a differenciálódás és a fejlődés [33], és leírták, hogy a fontos kináz szabályozó c-Fos aktiváció [34]. A jelen vizsgálatban azt találjuk, közvetlen bizonyíték a gyomorrák AGS sejtek JNK kritikusan szükséges a c-Jun aktiválását, míg ERK a kritikus kináz c-Fos aktiváció (ábrán látható 3D).

Based a fenti következtetést, annak érdekében, hogy tovább vizsgáljuk Chrysin mechanizmusának szuppresszáló MMP-9, felfedeztük, hogy Chrysin volt képes blokkolni a JNK1 /2 és ERK1 /2 foszforiláció (ábra 3E és 3F). Ennek megfelelően a megállapítást, a gátló hatását más flavonok a ERK1 /2 is számoltak be.

Liu et al. számolt be, hogy az apigenin, egy polifenolos flavon (4,5,7-trihydroxyflavone), talált a különböző gyógynövények és a zöld leveles zöldségek, gátolja a sejtek migrációját keresztül elnyomása az ERK1 /2 foszforiláció az emberi húgyhólyag simaizom-sejtek [35]. Azt is felfedezték, Ishikawa és társai. hogy a H _{2 O 2 növeli az apoptózis, ami a gyors foszforilezését a JNK, ERK-kat, és a p38 MAPK, míg kvercetin megszüntetheti az aktivációs e három MAPK válaszul H 2 O 2 [ ,,,0],36]. katalógusa}

a jelen tanulmányban azt vizsgáltuk gátló hatását chrysin MMP-9 expresszió és kiderült, a mechanizmus a gyomorrák AGS sejteket először. Eredményeink alapján leírjuk, egy hipotetikus sematikus modell szemlélteti a mechanizmus chrysin gátolják az MMP-9 expresszió, amint az 5. ábra további vizsgálatokat kell végezni, hogy vizsgálja meg, hogy van egy esszenciális enzim upstream mind a JNK1 /2 és ERK1 /2, kritikusan ellenőrző JNK1 /2 és ERK1 /2 foszforiláció. Ha igen, chrysin közvetlenül befolyásolja a létfontosságú enzim, amelyet alaposan ki kell vizsgálni, mint lehetséges rákellenes terápiás. Katalógusa

Különböző adjuváns terápiás stratégiák elnyomni metasztázis és megakadályozza a tumor kiújulásának kimerítettek, és sok lehetőség a betegek behajtás. A közelmúltban, a természeti phytochemicals kapott széleskörű tanulmányt a daganatos betegségek megelőzésében [37]. Sőt, étrendi bevitelének phytochemicals közelmúltban kapott figyelmet a gyomorrák megelőzésében [38]. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy Chrysin-kezelt sejtek csökkentheti a rák invazív keresztül gátolják az MMP-9 expressziója révén elnyomása a JNK /c-Jun és az ERK /c-Fos jelátviteli. Ezek az eredmények hasznos bizonyítékokat a fejlődő jövő rákellenes terápiák gyomorrák. Katalógusa

• PLoS One: elvesztése kifejezése Reprimo, a p53-indukálta sejtciklusmegállás Gene korrelál az invazív Stage tumor progressziójának és p73-expresszió Gyomor Cancer
• PLoS One: A dereguláció között miR-29b /c és DNMT3A társul epigenetikai némító a Cdh1 Gene befolyásoló Cell migrációs és behatolás a gyomor Cancer