PLoS ONE: analizė nereguliuojamoje mikro RNR ir savo tikslinę genų skrandžio vėžio

Anotacija

Fonas

mikro RNR (miRNAs) yra plačiai tiriamas ne kodavimo RNR kad moduliuoja genų ekspresiją. MiRNAs yra nereguliuojama įvairių navikų, įskaitant skrandžio vėžiu (GC) ir turi potencialias diagnostikos ir prognozavimo pasekmių. Mūsų tyrimo tikslas buvo nustatyti Mirna profilį GC audinių, po to vertinant nereguliuojamose miRNAs plazmoje GC pacientams. Naudojant laisvų bazių ir bioinformatikos metodus mes taip pat siekiama įvertinti galimą tikslines genus patvirtino skirtingai išreikšta Mirna ir patvirtinti šias išvadas GC audiniuose.

Metodai

Tyrime dalyvavo 51 GC pacientų ir 51 valdiklius. Iš pradžių, mes tikrinami Mirna išraiška profilį 13 audinių mėginių GC ir 12 normalių skrandžio audinių su TaqMan mažo tankio matrica (TLDA). Antrajame etape, skirtingai išreikšti miRNAs buvo patvirtintas replikacijos kohortos naudojant KRL PGR, audinių ir plazmos mėginių. Vėliau mes išanalizavo galimas tikslines genus nereguliuojamose miRNAs naudojant bioinformatikos požiūrį, nustatomas jų raiška GC audinių ir atliko koreliacinę analizę su orientacija miRNAs.

Rezultatai

profiliavimo su TLDA atskleidė 15 nereguliuojamos miRNAs GC audiniai, palyginti su normalaus skrandžio gleivinės. Replikacijos analizė patvirtino, kad Pasaulis-148A-3P, PPN-204-5p, PPN-223-3p ir Pasaulis-375 buvo nuosekliai nereguliuojama GC audiniuose. Analizė GC pacientų plazmos mėginių parodė reikšmingą žemyn reguliavimą PPN-148A-3P, PPN-375 ir up-reguliavimo PPN-223-3p palyginti su sveikų asmenų. Be to, naudojant bioinformatikos priemonių mes nustatyti tikslus pakartotas miRNAs ir atliko liga susijusio geno sodrinimo analizę. Galų gale, mes įvertino galimą tikslinio geno BCL2 parsisiųsti ir DNMT3B
išraiška atliekant KRL-PGR GC audinio, kuris koreliuoja su orientacija Mirna išraiška.

Išvados

Mūsų tyrimas atskleidė Mirna profilį GC audinių ir parodė, kad Pasaulis-148A-3P, PPN-223-3p ir Pasaulis-375 yra nereguliuojama GC plazmos mėginių, tačiau šie cirkuliuojančių miRNAs parodė gana silpna diagnostikos rezultatus kaip vienintelis biologinius žymenis. Tikslinė genų analizė parodė, kad BCL2 parsisiųsti ir DNMT3B
išraiška GC audinio koreliuoja su jų taikymą Mirna išraiškos

nurodomoji dalis:. Juzėnas S Šaltenienė V Kupčinskas J susieti , Kiudelis G, Jonaitis L, ir kt., (2015) analizė nereguliuojamoje mikro RNR ir savo tikslinę genų skrandžio vėžio. PLoS ONE 10 (7): e0132327. Doi: 10,1371 /journal.pone.0132327

redaktorius: Lin Zhang Pensilvanijos universiteto medicinos mokyklos, JAV

Įstojo: balandžio 22, 2015; Priimtas birželio 13?, 2015 m Paskelbta: Lie 14, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Juzėnas ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis JK, LJ, SiJu, LK darbas, JS parėmė Europos socialinis fondas Nr VP1-3.1-ŠMM-07-K-01 -156. MM darbą remia Vokietijos federalinė ministerija Švietimo ir mokslo į ERA-NET PathoGenoMics rėmo. Suteik Ne: BMBF-0315905D. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

apie mikro RNR (miRNAs) ir Nustatant jų vaidmenį molekulinės kelius atradimas atnešė didžiulę pažangą molekulinės biologijos [1] [2]. Šie maži nekoduojanti RNR, sudarytomis iš ~ 22bp dalyvauja po transkripcijos reguliavimo genų ekspresiją. MiRNAs pasižymi dideliu stabilumo biologinių mėginių priėmimo šių molekulių patraukli tikslą biologinis mokslinių tyrimų srityje [3] [4]. Daugėja įrodymų matyti, kad miRNAs dalyvauja didžiuosiuose karcinogenezę takais [5]. Ankstesni tyrimai parodė, kad dereguliavimas miRNAs įvyksta beveik visuose didžiuosiuose rūšių vėžio [5] [6]. Be to, miRNAs buvo įrodyta, kad turėti diagnostinę ar prognostinę vaidmenį ir netgi galimą klinikinę reikšmę tikslingai genų terapija vėžiu sergantiems pacientams [7] [8].

skrandžio vėžiu (GC) dažnis Vakarų šalyse yra sumažėjo per pastaruosius dešimtmečius; Tačiau ši vėžio rūšis vis dar sudaro beveik vienas milijonas naujų ligos atvejų visame pasaulyje ir vykdo labai didelis mirtingumas [9]. Naujausi tyrimai GC parodė daug naujų įžvalgų į šio piktybinių navikų patogenezės. Nepaisant to, tikslios mechanizmai piktybinę transformaciją iš Helicobacter pylori
( O
. pylori
) infekcija lėtinio atrofinį gastritu, žarnyno metaplazijos ir GC vis dar menkai suprantama [10 ]. Dabartinis hipotezė GC raidoje bendrą poveikį bakterijų, priimančiosios ir mitybos veiksnių; Tačiau iki šiol ši teorija teigia labai mažai kliniškai garso transliacijos poveikį [11]. GC atvejų yra diagnozuojama vėlyvos stadijos ligos, kuri yra susijusi su prasta pacientų rezultatus. Todėl vienas iš pagrindinių akcentų GC tyrimų yra potencialių molekulinių biologinių žymenų vertinimą, kad galėtų būti naudojamas pradžioje neinvazinių diagnostikos šio piktybinių navikų.

esminį miRNAs GC buvo parodyta įvairių tyrimų [12]. Volinia ir kt. pateikė vienas pirmųjų Mirna ekspresijos profilius GC audinio, rodančių specifinį reguliavimo mažinimo modelį [13]. Tolesni tyrimai taip pat pranešė didelį reguliavimą priklausančių miR-17 miRNAs, PPN-21, PPN-223, PPN-135 ir daug kitų šeimų. Tarp pranešta studijų GC audinių, MIR-21, MIR-25, MIR-92, MIR-223 buvo labiausiai nuosekliai iki reguliuojama miRNAs, o Pasaulis-375 ir miR-148 buvo labiausiai nuosekliai žemyn reguliuojama [14] [ ,,,0],15] [16]. Dauguma šių tyrimų pažvelgė Mirna profilio pacientams, sergantiems GC ir suporuotas gretimuose normaliuose skrandžio gleivinės [14]. Svarbūs tyrimai parodė, kad miRNAs jau liberalizuotas ankstyvosiose stadijose skrandžio kancerogenezėje įskaitant H
. pylori
gastritas ir ikivėžinių etapai skrandžio atrofijos ir žarninės metaplazijos [17] [18]. Įdomu tai, kad kai kurie iš miRNAs turi priešingas dereguliavimo kryptimis GC akivaizdoje, kaip atskiri profiliavimas tyrimai rodo didelį neatitikimą tarp nereguliuojamų miRNAs [14]. MIR-9 buvo nustatyta, kad iki reguliuojama dviejuose tyrimuose [15] [19], o kiti du dokumentai parodė reikšmingą žemyn reguliavimą šio Mirna GC audiniuose [13] [20]. Šie neatitikimai dėl priešingas dereguliavimo rezultatus Mir-9 ir daug kitų miRNAs greičiausiai susijęs su skirtumais anatominę vietą GC, histologinio potipio, ligos stadijos, profiliavimo platformų, statistinės analizės ir daugelis kitų galimų prieštaringų veiksnių. Be to, iš šiuo metu paskelbtų tyrimų Mirna profilyje dauguma GC audinių apimti dalykus iš Azijos šalyse; Tuo tarpu duomenų apie Europos GC pacientų vis dar menki [21].

Mūsų Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti Mirna profilį GC audinių ir palyginkite jį su įprastu sveiko skrandžio gleivinės naudojant platų aprėpties Mirna TaqMan mažo tankio masyvai. Be tolesnei analizei, mes siekiama patvirtinti mūsų apibūdinimo rezultatų audinių ir plazmos didesnės grupės GC pacientų ir sveikų Europos kilmės. Galų gale, mes įvertintas galimas tikslines genus patvirtintų skirtingai išreiškiama Mirna ir atliko ligos asociacijos genas sodrinimo analizę tikslinių genų.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

tyrimas buvo patvirtintas Kauno apygardos Biomedicininių tyrimų etikos komiteto (protokolas Nr BE-2-10). Visi pacientai pasirašė informuoto sutikimo formą dalyvauti tyrime.

Studijų gyventojų

Audinių mėginiai buvo perspektyviai renkami tarp 2011 ir 2014 m departamentų Gastroenterologijos ir chirurgijos ligoninės Lietuvos sveikatos mokslų universitetas (Kaunas, Lietuva). Tyrime dalyvavo apie 51 kontrolinės grupės tiriamųjų ir 51 GC pacientai, kurie buvo suskirstyti į profiliavimą (GC, n = 13; kontrolę, n = 12) ir patvirtinimo Grupės (GC, n = 38; kontrolę, n = 39). Visi dalykai buvo Europos kilmės. Skrandžio biopsijos mėginiai buvo imami iš antralinių pilvo dalyje nuo kontrolinės grupės tiriamųjų, kuriems buvo nurodyta už viršutinės virškinimo endoskopijos dėl dispepsijos simptomų ir neturėjo ankstesnę istoriją piktybinių navikų. GC audinio mėginiai buvo gauti iš chirurginio egzempliorių iš karto po rezekcijos nuo pacientams, kuriems atliekama pirminė chirurgija GC su jokiu Priešoperacinės švitinimo ir chemoterapijos. Skrandžio adenokarcinoma GC pacientų buvo patikrintas histologijos ir klasifikuojami pagal Lauren į difuzinės ir žarnyno tipus [22]. O
. pylori
statusas buvo įvertintas GC ir kontrolinės grupės tiriamųjų naudojant netiesioginė IFA aptikti serumo specifinis IgG antigenus (virionams /Serion GmbH, Wünrzburg, Vokietija). Klinikiniai požymiai ir patologiniai charakteristikos Pacientų grupės, įskaitant amžių, lytį ir ligos stadijos apibendrinti 1 lentelėje

Audinių Mėginio paruošimas ir RNR gavybos

Skrandžio audinio mėginiai buvo laikomi RNAlater (Ambion, Austin , TX, JAV), esant + 4 ° C temperatūroje ir 24 valandas vėliau prie -80 ° C temperatūroje. 30 mg audinio buvo homogenizuoti sterilius prieš RNR išskyrimo su mirVana Mirna izoliacija Kit (Ambion, Ostinas, TX, JAV) profiliavimo studijų ir miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, JAV) tinkamumo patvirtinimo tyrimą pagal gamintojų instrukcija. RNR kokybė buvo vertinama naudojant Nanodrop 2000 spektrofotometru (Thermo Scientific, JAV). Kokybinis tyrimas RNR vientisumo atliko elektroforezės agarozės gelyje (5%).

Plazminiai Mėginio paruošimas ir RNR gavybos

Plazmos mėginiai buvo imami iš sveikatos pacientams ir pacientams, sergantiems GC. Mirna išraiška plazmos kohortos sudarė plazmos mėginių iš 38 skrandžio vėžiu sergančių pacientų ir 39 sveikų savanorių. Veninio kraujo buvo surinkti EDTA antikoaguliacinės sistemos vakuuminių vamzdžių ir buvo centrifuguojamas 3500 apsisukimų per minutę 15 min kambario temperatūroje; atskirti plazmos buvo perkeltas į 1,5 ml mėgintuvėlius ir įdedamas į -80 ° C šaldiklyje trumpalaikiam saugojimui. Mažos RNR buvo paimti iš 200 įxL plazmos naudojant miRNeasy Serumas /plazminiu komplektas (Qiagen, Valensija, Kalifornija, JAV), pagal gamintojo instrukcijas.

Mirna profiliavimo naudojant TaqMan mažo tankio Array

Mirna profiliavimas buvo atliktas su TaqMan Array žmogaus Mirna kortele, jeigu v2.1 kuris leido įvertinti 377 žmogaus miRNAs katalogus į miRBase V20 [23]. Trumpai tariant, 350 ng visos RNR iš pradžių buvo realizuojamas transkripcija naudojant Megaplex RT nustatyti baseinas versija 2.1 (taikoma BIOSYSTEMS, Karlovi Varai, Kalifornija, JAV) ir 800 įxL kDNR produkte buvo pakrautas ant TaqMan Array Žmogaus Mirna kortelę ir paleisti VIIa 7 Realaus laiko PGR sistema (Applied Biosystems). Pirminė analizė buvo atlikta naudojant VIIa 7 programinė įranga (taikomoji BIOSYSTEMS) gauti išraišką pagal Ct. Duomenų analizė atlikta naudojant Bioconductor HTqPCR paketą [24]. MiRNAs su Ct reikšmė > 37 buvo laikomi unamplified. buvo laikomi miRNAs, kurie nebuvo išplinta daugiau nei 25% mėginių turi būti nuolankios išreikštas ir, todėl jie neįtraukiami tolesnei analizei. Mirna išraiška duomenys normalizavosi naudojant rango invariantinį normalizuoti. NormFinder ir geNorm algoritmai buvo naudojami siekiant nustatyti referencinę geną iš TLDA duomenų tinkamumo patvirtinimo tyrimą [25]. Pagal algoritmų Pasaulis-127-3p parodė mažiausią Ct dispersiją ir buvo pasirinkta kaip atskaitos geno už tinkamumo patvirtinimo tyrimą. Naujausi tyrimai rodo, kad sąvoka lygiai RNU6A ir kai kurių kitų nedidelių branduolinių RNR gali būti nestabilus tam tikrų audinių ir sąlygų negali tarnauti kaip geriausia rekomendacija genus [26] [27] [28] [29]. Vienas iš naujausių Leidinyje taip pat nustatė Pasaulis-127-3p kaip geras kandidatas nuoroda genų atrankos [30].

Kiekybiniai atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos (KRL-PGR)

atvirkštinės transkripcijos (RT ) reakcijos buvo atliekama naudojant TaqMan Mirna atvirkštinės transkripcijos rinkinys (taikoma BIOSYSTEMS, Carlsbad, Kalifornija, JAV) ir Mirna konkrečius RT kamieninių kilpa pradmenis (taikoma BIOSYSTEMS, Carlsbad, Kalifornija, JAV). Singleplex reakcijos buvo atliekamas 7,5 pL tūrio. Kiekvienas reakcija sudarė 2,08 iL nukleazinis nemokamą vanduo, 0,74 iL 10 × RT buferis, 0,08 pL dNTP (100 mm), 1,5 pL 5 × Mirna būdingos RT gruntai, 0,1 pL RNazės inhibitorius, 0,5 pL Multiscribe atvirkštinės transkriptazės ir fiksuota apimtis Mirna šablonas (2,5 pl). VK buvo atliktas termocikleryje pagal šias sąlygas: 16 ° C temperatūroje 30 min, 42 ° C temperatūroje 45 min ir 85 ° C temperatūroje 5 min, o po to sulaikyti, esant 4 ° C

TaqMan reali. Game PGR reakcijos buvo atlikti pasikartojančių reakcijų sudaro 6,25 pL TaqMan 2 × Universal PGR Master sumaišykite su Nr AmpErase ung (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, JAV), lygūs 0,625 įxL 20 × Mirna konkrečių gruntas ir zondas mišinys iš TaqMan Mirna prabavimo Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, JAV), 3 pL iš atvirkštinės transkripcijos produkto ir 2.625 pL nukleazes laisvas vandens. AT-PGR buvo atliekama naudojant 7500 Greitas realiojo laiko PGR sistema (taikoma BIOSYSTEMS, Carlsbad, Kalifornija, JAV) pagal šių sąlygų: 95 ° C 10 min, tada 40 ciklai 95 ° C temperatūroje 15 s, 60 ° C iki 60 s, o dar po 4 ° C temperatūroje laikyti. Kiekvienas mėginys buvo paleisti du kartus. Duomenys buvo analizuojami su automatiniais nustatymais priskyrimo atskaitos tašku, ir vidutinis Ct ir SD vertės apskaičiuotos. Sąvoka lygis Mirna audinyje buvo standartizuoti Pasaulis-127-3p ir išraiška lygis kraujo plazmoje buvo normalizuotas HSA-miR-16-5p. Rezultatai buvo skaičiuojami naudojant ΔΔCT metodą [31]. Duomenys buvo analizuojami su automatiniais nustatymais priskyrimo atskaitos tašku, ir vidutinis Ct ir SD vertės apskaičiuotos.

kDNR už BCL2 parsisiųsti ir DNMT3B
genų ekspresijos analizė buvo sintetinamas iš 500 ng RNR naudojant didelės talpos kDNR atvirkštinės transkripcijos Kit (Applied BIOSYSTEMS, Karlovi Varai, Kalifornija, JAV). Singleplex reakcijos buvo atlikti ir 7,5 pL tūrio. Kiekvienas reakcija sudarė 2,1 iL nukleazinis nemokamą Vanduo, 1 iL 10 × RT buferis, 0,4 pL dNTP (100 mm), 1 pL 10 × RT Atsitiktinės gruntai, 0,5 pL Multiscribe atvirkštinės transkriptazės ir fiksuoto tūris Mirna šabloną (2,5 pL). RT-PGR buvo atliktas termocikleryje pagal šias sąlygas: 25 ° C temperatūroje 10 min, 37 ° C temperatūroje 120 min ir 85 ° C temperatūroje 5 min, po to, esant 4 ° C temperatūroje, naudojant laikantis išlaikymo. Prieš qPCR kDNR mėginiai buvo skiedžiamas 1: 1 su nukleaziniu laisvojo vandens ir 2 mikrol naudojamas 10,5 iL RT-qPCR reakcijų kartu su 6,25 iL 2x TaqMan Fast Universal Master mišinio (Life Technologies ", Carlsbad, Kalifornija, JAV), lygūs 0,625 mikrol 20x TaqMan genų ekspresijos tyrimas (Life Technologies ", Karlovi Varai, Kalifornija, JAV) ir 3.625 mikrol sterilus vanduo. AT-qPCR tyrimai buvo paleisti tris kartus ant 7900HT Greitas Realaus laiko PGR sistema (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, JAV) pagal šių sąlygų: 95 ° C temperatūroje 10 min, tada 40 ciklai 95 ° C temperatūroje 15 s, 60 ° C temperatūroje 60 s, o dar po 4 ° C temperatūroje laikyti. Sąvoka lygiai BCL2
ir DNMT3B
audinyje buvo normalizuotas ACTB
.

taikinio geno tinklo analizė

sąrašus patvirtintų tikslinių genų kandidačių miRNAs buvo gauti iš miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) ir miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) duomenų bazes. Genų ligos asociacijos duomenys buvo gauti iš DisGeNET duomenų bazę (http://www.disgenet.org/~~HEAD=pobj). Tam, kad nustatyti GC-susijusias genus, terminas "skrandžio adenokarcinoma" (umls: C0278701) buvo naudojamas kaip paieškos užklausa duomenų bazėje. Biologiniai tinklai buvo sukurtas naudojant Cytoscape V3.2 atviro kodo programinės įrangos su CyTargetLinker taikymo [32].

Statistinė analizė

klinikiniai ypatumai tarp grupių buvo palyginti naudojant χ
2 testus ir tikslus Fišerio testas kokybinius duomenis, ir T-testas kiekybiniais duomenimis. TLDA duomenys buvo analizuojami naudojant t-testą ir Benjamini Hochberg korekciją už melagingą atradimas norma tokia, kad skirtumas išraiška buvo laikoma reikšminga su P < 0,01. Duomenys normalizavosi naudojant rango invariantinį normalizuoti [33] ir analizuojami naudojant HTqPCR paketą. Patvirtinimo ir plazmos qPCR išraiška duomenys buvo analizuojami naudojant neparametrinį Mann-Whitney U testą. Benjamini Hochberg pakoreguota P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas. Dėl KRL-PGR duomenimis, santykinė išraiška lygių kiekvienai tikslinei Mirna (log2 santykinis lygis) buvo apskaičiuojamas pagal CT vertybių skirtumas tarp tikslinių miRNAs ir miR-127-3p audinių pavyzdžius ir miR-16-5p plazmos mėginiuose (ΔCT) [34]. Hypergeometric testas buvo naudojamas GC susijęs tikslas sodrinimo analizė. ROC kreivė (ROC) kreivė buvo sukurtas kiekvienam Mirna naudojant ΔCT duomenis. Pagal kreive (AUC) vertės ir 95% pasikliautinasis intervalas (PI) plotas buvo apskaičiuotas siekiant nustatyti specifiškumą ir jautrumą. Analizuoti diagnostinę vertę kartu pokyčių plazmoje Mirna lygius, buvo naudojamas vienmatės genų ekspresijos vidutiniškai algoritmas [35]. ROC kreivės buvo sukurta naudojant ROCR paketą [36]. Visi duomenų analiz buvo atliekama naudojant į mokslinių tyrimų versija 3.1.1 programinę įrangą.

Rezultatai

Mirna išraiška profiliavimas GC ir sveiko skrandžio gleivinės audinio TLDA

TaqMan Žmogaus Mirna mažo tankio masyvo analizė buvo atliekama siekiant nustatyti kandidates miRNAs matomos pakeista išraišką skrandžio vėžio audinyje. Audinių Mirna profiliai iš GC pacientų lyginant su profiliais skrandžio gleivinės nuo sveikų asmenų. Po filtravimo žemos gausiai miRNAs (CT vertės > 37 ir ne aptinkama daugiau kaip 25% mėginių), iš 193 miRNAs (iš viso 377) Nustatykite liko tolesnei analizei. Iš vėžiniai palyginimas, lyginant su normalaus audinio nustatė 15 diferencijuotai išreikšti miRNAs, iš kurių 7 buvo iki reglamentuotas ir 8 buvo žemyn reguliuojama FDR pakoreguotas p-reikšmė < 0,01 ir kartų kaita > 2 (2 lentelė). Rezultatai parodė ugnikalnio sklypas (1 pav). Tarp jų, 6 miRNAs (MIR-135a-5p, PPN-148A-3P, PPN-204-5p, PPN-375, PPN-223-3p ir Pasaulis-155-5p), rodo aukščiausią reikšmę ir kartų kaitos vertybes, buvo atrinkti patvirtinimo tyrimą. Hierarchinis grupavimas pagal Euklido atstumas pasirinktų Mirna normalizuotas raiškos duomenis atskleidė du pogrupius: vieną atitinkančius su kontroline grupe, o antrasis iš esmės atitinkančius pacientų grupėje. (2 pav).

Mirna patvirtinimas GC ir sveika skrandžio gleivinės audinys su KRL-PGR

šešių kandidačių miRNAs atrinktų patikrinimo buvo įvertinami naudojant KRL PGR. Pamatinių genų Pasirinkus TLDA duomenys buvo analizuojami naudojant du skirtingus algoritmus (NormFinder ir geNorm) nustatyti atskaitos genus. MIR-127-3p parodė aukščiausią išraišką stabilumą visoje viskas iš TLDA duomenų pavyzdžių ir dėl šios funkcijos miR-127-3p buvo pasirinkta kaip atskaitos geno normalizuoti qPCR duomenis. Sąvoka lygiai PPN-148A-3P, PPN-204-5p, PPN-223-3p ir miR-375 parodė reikšmingą diferencialinę išraišką ta pačia kryptimi kaip ir atradimas tyrimo (FDR pakoreguotas p < 0,05), o reikšmingai skirtumai buvo aptikti ekspresijos lygį PPN-135a-5P ir miR-155-5p (FDR reguliuojamas p > 0,05; 3 pav)

Plazminiai miRNAs kaip potencialūs biologiniai žymenys skrandžio vėžio
GC audinių patvirtintu miR-148A-3P, PPN-204-5p, PPN-223-3p ir Pasaulis-375 buvo atrinkta tolesniam tyrimui kraujo plazmos mėginiuose. Santykinis lygis kandidato mRNR atskiruose mėginiuose buvo nustatyti naudojant KRL PGR (3 pav). Mir-16-5p buvo naudojamas kaip endogeninio kontrolės normalizuoti raiškos lygius kandidačių miRNAs. Iki šiol, per atrankos tinkamiausias atskaitos genų Mirna profiliavimo tyrimai diskusija vyksta. Tradiciškai naudojami maži branduoliniai RNR (RNU6A, RNU44, RNU48 ir kiti) gali būti nestabilus kraujo plazmoje ir gali pristatyti šališkumo eksperimente. Mes atlikti išsamų literatūros analizė, prieš pasirenkant MIR-16-5p kaip atskaitos geno. Ankstesni tyrimai nustatė Pasaulis-16-5p kaip endogeninio kontrolės Mirna, kuris gali tarnauti kaip tiksliai atskaitos geno dėl savo santykinio stabilios ekspresijos lygio serume [37] [21]. Sąvoka lygiai PPN-148A-3P ir miR-375 parodė reikšmingą žemyn reguliavimą GC plazmoje; o Pasaulis-223-3p gerokai buvo reguliuojama (FDR reguliuojamas p < 0,05). Jokių didelių skirtumų nepastebėta ekspresijos lygių miR-204-5p (3 pav). Ištirti skirtingai išreikštas miRNAs kaip potencialių biologinių žymenų GC savybių, ROC kreivė analizė buvo atlikta. ROC kreivės PPN-148A-3P, PPN-375 ir miR-223-3p parodė AUC vertė 0,349 (95% PI, 0.289-0.408), 0,32 (95% CI, 0,261-0,377) ir 0.671 (95% PI , 0,614-0,731), atitinkamai (4 pav). Į vieną požymį genų ekspresijos vidutinis analizės žemyn reguliuojama miR-148A-3P ir miR-375, gautas ROC kreivė turėjo AUC vertė 0.711 (95% PI 0.657-0.769), o tai atitinka vidutinio sunkumo atskyrimą GC kontroliniai mėginiai (4 pav). Ypatumus ir jautrumas kandidačių miRNAs yra parodyta pav 4.

taikinio geno prognozavimas

Jei toliau tirti galimus tikslus PPN-148A-3P, PPN-204-5p, MIR-223- 3p ir Pasaulis-375, visi jų eksperimentiškai patvirtintomis Mirna netikslinių sąveikų buvo gauti iš dviejų skirtingų duomenų bazių (miRTarbase ir miRecords). Duomenys buvo vizualizuojami Cytoscape kaip biologinis tinklo, turinčios visas minėtų miRNAs ir jų tikslinių sąveiką (5 pav). Kiekvienas tinklo sąveika susidėjo iš dviejų mazgų, reguliavimo Mirna mazgas (raudonas) ir tikslinės iRNR mazgas (PINK), prijungtas per vieną nukreiptas krašto. Apskritai, tinklas įtrauktas 593 patvirtintus tikslus, 419 iš jų skiriamas miR-375, 88 priskirtą miR-204-5p, 83 priskirtą miR-148A-3P ir 21 priskirtą miR-223-3p. Tinklo analizė parodė, kad Pasaulis-148A-3p ir Pasaulis-375 buvo šeši bendri tikslai (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 ir RAB10), PPN-204-5p ir Pasaulis-375 taip pat turėjo šešis bendri tikslai (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 ir IL1RAP), PPN-148A-3p ir Pasaulis-204-5p turėjo du bendri tikslai (AURKB ir CDC25B), PPN-223-3p ir Pasaulis-148A-3p taip pat turėjo du bendrus tikslus (HSP90B1 ir IRS1), PPN-223-3p ir Pasaulis-375 turėjo vieną bendrą tikslą (PARP1) ir mir-148A-3P, PPN-204-5p ir Pasaulis-375 taip pat turėjo vieną bendrą tikslą (BCL2). Tikslinės genai, kurie buvo reguliuojami vienu metu du ar tris miRNAs atstovaujama oranžinės ir žalios spalvos, atitinkamai (5 pav).

Ligos susijęs genas sodrinimo analizė

Siekiant nustatyti, ar liga -associated genai buvo žymiai praturtino mūsų rinkinį Mirna tikslus, sodrinimas analizė buvo atlikta. Pirma, genų sąrašas buvo gaunami iš DisGeNet duomenų bazę. Kaip užklausą dėl duomenų bazę mes naudojamas terminas "skrandžio adenokarcinoma" (umls: C0149826). Po atfiltruodami Mirna, lncRNA ir genai, kurie nebuvo miRTarbase ir miRecords buvo nustatyta, kad būti susijęs su GC 115 genų. Tinklo analizė 20 GC susijusių genų buvo sutapo, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 ir JAG1) iš jų skiriamas miR-375, 6 (IL8, MMP9, IL1B, CDX2, SERPINE1 ir SPARC) priskirtas Pasaulis-204 -5p, 4 (CDKN1B APC, NR1I2 ir CCKBR) priskirtas Pasaulis-148A-3p ir 2 (STMN1 ir IGF1R) priskirtas miR-223-3p. Tikslinės genai, kurie buvo susiję su GC yra atstovaujama mėlyna (5 pav). Pagaliau, liga susijusių genų sodrinimo analizė buvo atlikta naudojant irstiniai-testas kurių buvo įvertinti, ar GC-susijęs genų skaičius yra didesnis nei tikimasi tikslinių genų pasirinktų miRNAs rinkinį. Sodrinimas analizė parodė, kad GC susijęs genai buvo gerokai per mažai atstovaujama (p < 0,05) miR-148A-3P, PPN-204-5p ir miR-223-3p, o ne didelis praturtinimas buvo pastebėtas MIR-375 tikslinių genų (p > 0,05) (3 lentelė)

BCL2 parsisiųsti ir DNMT3B
per saviraiškos ir atvirkštinė koreliacija su orientacija miRNAs skrandžio vėžio audiniuose
apie bioinformatical atrankos potencialių Mirna tikslų nustatytų BCL2
kaip spėjamą tikslą mir-148A-3P, PPN-204-5p ir miR-375 ir DNMT3B
mir-148A-3P ir miR-375. Visi šie miRNAs mūsų tyrime buvo nustatyta, kad žemyn reguliuojama skrandžio vėžio audinio. Toliau remti šiuos rezultatus, pirmąją sąvoką analizę BCL2
ir , buvo atliktas DNMT3B
genai. Į KRL-PGR duomenys parodė žymiai padidinti raiškos lygiais tiek BCL2 parsisiųsti ir DNMT3B
genų skrandžio vėžio audinyje. BCL2
parodė 2,7 kartus daugiau, o DNMT3B
turėjo 16,7 kartus padidinti mRNR lygių (pav 6). Pearsono koreliacijos analizė buvo atlikta siekiant atskleisti ryšį tarp BCL2
santykius ir DNMT3B
mRNR ir jų skirtos Mirna lygiai normaliomis ir vėžinių skrandžio audinių (pav 6). Atvirkštinė koreliacija abiem prognozuojama, DNMT3B
-targeting miRNAs: Pasaulis-375 (r = -0,49; p = 0,00001) ir Pasaulis-148A-3P (r = -0,26; p = 0,0328) , Neigiama koreliacija tarp BCL2 parsisiųsti ir Pasaulis-375 (r = -0.32; p = 0,0116), o ne santykiai buvo rastas tarp BCL2 parsisiųsti ir Pasaulis-148A-3P (r = -0,06; p = 0,6631) arba BCL2 parsisiųsti ir Pasaulis-204-5p (r = -0,02; p = 0,8546)

Diskusijos

Altered Mirna ekspresijos profilius turėti. buvo pranešta apie GC audinių ir kraujo mėginių [13] [20] [14] [38]. Kai kurie iš šių nereguliuojamų miRNAs buvo susijęs su išlikimu, metastazavusiu elgesį naviko ir kitų klinikos funkcijų GC [39] [40]. Be to, buvo įrodyta, miRNAs reguliuoti naviko augimą įtakos platinimu, sukibimą, invazija ir migracija GC ląstelių linijų [41]. Dar svarbiau, kad tikslinės genai nereguliuojamose miRNAs GC dalyvauja apoptozės, ląstelės ciklo ir kitų svarbiausių karcinogenezę takais [12]. Todėl tyrimas miRNAs ir jų potencialių tikslinių genų GC gali tarnauti toliau plėtoti svarbius diagnostikos ir gydymo alternatyvų. Akivaizdu, kad miRNAs yra pagrindiniai veikėjai skrandžio kancerogenezėje, bet mes vis dar trūksta tikslių duomenų apie mechanizmus ir potencialių klinikinėje praktikoje šių molekulių GC.

Mūsų dabartis Tyrimo tikslas nustatyti nereguliuojamose miRNAs GC profilį audiniai, įvertinti juos plazmos mėginių ir įvertinti galimas tikslines genus nereguliuojamų miRNAs. Naudojant TaqMan Mirna TLDA korteles, apimanti 377 miRNAs pradmenis, mes nustatėme, 15 skirtingai išreikštas miRNAs tarp vėžinių GC ir sveikų skrandžio audinius. Aštuoni miRNAs buvo žemyn reguliuojama (tegul-7a-5p, tegul-7G-5P, MIR-26b-5P, PPN-30b-5P, PPN-135a-5p, PPN-148A-3P, PPN-204-5p, PPN -375), o septynių miRNAs buvo iki reguliuojama (mIR-146B-5p, PPN-155-5p, PPN-214-3p, PPN-223-3p, PPN-224-5p, PPN-331-3p ir miR- 484). Mūsų profiliavimo rezultatais neatskleidė kai kurie dažniausiai nereguliuojamų miRNAs, kurie buvo pranešta anksčiau, kad būtų liberalizuotas kituose tyrimuose, įskaitant miR-21-5p, PPN-25-3p, PPN-92A-3P, PPN-29C-3P, ir kai kurie kiti [15] [19] [14]. Vienas iš galimų paaiškinimų šių trūkstamų miRNAs gali būti susijęs su labai griežtomis statistinius kriterijus, kurie buvo įregistruoti TLDA analize mūsų duomenų (FDR pakoreguotą p-reikšmė < 0,01 ir kartų kaita > 2). Be to, kai neatitikimą lygis Mirna profiliavimo rezultatais tarp tyrimų, gali atsirasti skirtumų anatominę vietą skrandyje, histologinio potipio, statistinės analizės ir ypač profiliavimo metodai [18]. Atliktas tyrimas Mestdagh et al. rodo, kad skirtingų platformų Mirna profiliavimo turėti skirtingas aptikimo tarifus, specifiškumą ir atkuriamumas ir kad labiausiai tinka platforma turėtų būti parenkami atsižvelgiant į eksperimentinės nustatymo pagrindą ir konkrečias mokslinių tyrimų klausimus (Mestdagh et al., 2014).

antrajame etape mūsų tyrime mes naudojome KRL PGR replikacijos kohortos įskaitant šešių dauguma nereguliuojamose miRNAs iš profiliavimas etapą (mIR-135a-5p, PPN-148A-3P, PPN-155-5p, PPN-204-5p , PPN-223-3p ir Pasaulis-375). Mes parodėme, kad Pasaulis-148A-3P, PPN-204-5p, PPN-223-3p ir Pasaulis-375 buvo nuosekliai nereguliuojama tarp normalių ir vėžinių GC audiniuose. Mūsų replikacijos kohortos rezultatai yra palaikomi ankstesnėse ataskaitose. Keletas tyrimų parodė, kad Pasaulis-148A-3p buvo gerokai žemyn reguliuojama GC ląstelių linijų ir audinių mėginių, palyginti su gretimų sveikų audinių [42] [43]. Ekspresija maža lygiai miR-375 taip pat buvo pranešė tyrimų, hipotezė, kad miR-375 buvo susijęs su skrandžio kancerogenezėje [44] [16]. Mes nustatyta, kad Pasaulis-223-3p buvo gerokai iki-reguliuojami GC audinio, palyginti su normalaus audinio, kaip siūlė keletą ankstesnėse ataskaitose [15] [19]. MIR-204-5p buvo rečiau pranešė GC Mirna profiliavimo tyrimai; Nepaisant to, mūsų rezultatai atitinka ankstesnių tyrimo, kuris parodė reikšmingą žemyn reguliavimą šio Mirna GC audinių ir ląstelių linijų GC [45]. MIR-135a-5p išraiška buvo mažesnė GC audinių negu kontrolinės grupės tiriamųjų; Tačiau pastebėta žemyn reguliavimas tendencija buvo panaši į ankstesnes ataskaitas [15], ir gali pasiekė reikalingas reikšmę su didesniu skaičiumi asmenų per grupių. Verta pažymėti, kad neradome skirtumus Mir-155-5p mūsų replikacijos kohortos lyginant kontrolinės grupės tiriamųjų ir GC pacientus. Greičiausiai šis faktas yra susijęs su tuo, kad, atsižvelgiant į pirminį kohortos, kontrolinės grupės tiriamųjų buvo O
. pylori wapdam nemokama, o replikacijos rinkinys, kai kontrolinės grupės tiriamųjų turėjo teigiami serologinių šios bakterijos. Jis yra gerai žinoma, kad Pasaulis-155-5p dalyvauja uždegimo būdais, įskaitant H
. pylori
gastritas [46]; Todėl, tai gali suteikti tam tikrą šališkumo mūsų rezultatus. Mūsų rezultatai atitinka ankstesniame tyrime LINK et al. (2015), kur į PPN-155 raiškos skirtumas biopsijų iš GC, palyginti su kontrolės nepasiekė statistinio reikšmingumo [18]. Be replikacijos etape mūsų Mirna profiliavimas tyrimo mes pasirinkti tik šešių miRNAs, kurie parodė aukščiausią biologinę reikšmę ir statistinį reikšmingumą. Mes sutinkame, kad ji būtų naudinga pažvelgti į viską žymiai nereguliuojamos miRNAs ir kad galėtų būti potencialus užduotis tolesnėms studijoms.

Jei ištirti galimą vaidmenį skirtingai išreikštas miRNAs kaip biologinių žymenų GC, Tyrėme nereguliuojama miRNAs į plazmos mėginiai. Cirkuliacinis miRNAs, ypač kelių miRNAs derinys, gali kelti daug žadančių biologinius žymenis dėl virškinamojo trakto vėžio [21] diagnozę. Tyrimas Zhu et al. parodė, kad iš penkių miRNAs kolegija gali tarnauti kaip potencialus biologinis į aptikti ankstyvojoje stadijoje GC [47]. Iki šiol, pranešė Mirna profiliai GC serume ar plazmoje gerokai skiriasi tarp atskirų tyrimų [21].

• PLoS ONE: prognozavimas modelis skrandžio vėžio dažnis Korėjos Population
• PLoS ONE: vaidmenys DPY30 į platinimu ir judrumas skrandžio vėžio ląsteles