PLoS ONE: PKG II slopina "EGF /EGFR sukelta migracija skrandžio vėžys Cells

Anotacija

Fonas

Mūsų ankstesni tyrimo rezultatai parodė, kad II tipo GMP priklauso baltymų kinazės (PKG II) galėtų blokuoti epidermio augimo faktoriaus receptoriaus aktyvinimą (EGFR), todėl slopina proliferaciją ir susijusios MAPK /ERK tarpininkaujant perduoti signalo skrandžio vėžio ląstelių linijos BGC-823, o tai rodo, kad PKG II gali slopinti kitų EGFR sukėlė signalo perdavimo kelius ir susijusios biologiniai veikla skrandžio vėžio ląsteles. Šis dokumentas buvo skirtas ištirti galimą slopina Pkg Ii "EGF /EGFR sukeltos migracijos bei su jais susijusių impulsų perdavimą.

Metodologija /Principal išvados

skrandžio vėžio ląstelių linijos" AGS, išraiška ir veikla PKG II buvo padidintos užkrėsti ląsteles adenoviruso konstruktas kodavimas PKG II kDNR (Ad-Pkg II) ir gydant ląstelių GMP analoginio 8-pCPT-GMP. Fosforilinimo baltymų buvo aptikta Imunoblotingo ir aktyvių mažų g baltymų Ras ir Rac1 buvo matuojamas "išskleidžiamajame" metodu. Mobilusis migracijos aktyvumas buvo aptiktas su transeuropinio transporto tinklo bei įrangos. Įrišimas tarp Pkg II ir EGFR buvo aptiktas su Co-TL. Rezultatai parodė, EGF lėšos paskatino migraciją AGS ląstelių ir poveikis buvo susijęs su PLCγ1 ir ERK tarpininkaujant signalo perdavimo kelius. PKG II slopino EGF sukeltos migracijos aktyvumas ir blokavo EGF pradėtą ​​perduoti signalo iš PLCγ1 ir MAPK /ERK tarpininkaujant kelius per užkirsti kelią EGF sukeltas Tyr 992 ir Tyr 1068 fosforilinimo EGFR. PKG II jungiasi su EGFR ir sukėlė treoninas fosforilinimo jį.

Išvada /Reikšmė

Mūsų rezultatai sistemiškai patvirtina Pkg II slopinimas dėl EGF sukeltos migracijos ir susijusios signalo perdavime iš PLCγ1 ir MAPK /ERK tarpininkaujant kelius, nurodant, kad PKG II turi fargoing slopinimas dėl EGF /EGFR susiję signalo perdavime ir biologiniu aktyvumu, skrandžio vėžio ląstelių per fosforilinimo EGFR ir blokuoja jo aktyvavimo

nurodomoji dalis:. Jiang L Lan, T , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu, M, ir kt., (2013) PKG II slopina "EGF /EGFR sukelta migracija Skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 8 (4): e61674. Doi: 10,1371 /journal.pone.0061674

redaktorius: Vladislav V. Glinskii, Misūrio universitetas-Columbia, Jungtinės Amerikos Valstijos,

Įstojo rugsėjo 30, 2012 m Priėmė: Kovo 12, 2013 m Paskelbta: Balandžio 16, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Jiang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos, No.81272755, No.31040002, No.81001100 ir No.31100974; Inovacijų Grantas Dziangsi universitete. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

II tipo GMP priklausomo baltymų kinazės receptorius (PKG II) serino /treonino kinazės ir kaupimo tyrimų duomenys rodo, kad ši kinazės turėjo svarbų vaidmenį ląstelių biologinę veiklą, pavyzdžiui, platinimo ir apoptozės reguliavimo, ypač vėžinių ląstelių , 2004 Kuko ir kt
nustatė, kad PKG II gali sukelti apoptozę žmogaus išauginti prostatos stromos ląstelėse [1]. 2009 Swartling ir kt
pranešė, kad PKG II slopinamas platinimu žmogaus neuroglioma ląstelių ir slopinimas buvo susijęs su transkripcijos faktoriaus Sox9 raiškos sumažėjimo ir Akt [2] fosforilinimo. 2011 Fallahian ir kt
nustatė, kad GMP gali sukelti apoptozę krūties vėžio ląstelių ir šis poveikis buvo susijęs su PKG II [3]. Mūsų tyrimo metu, mes nustatėme, kad sąvoka ir Pkg II veikla žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų buvo gerokai mažesnis nei įprastų skrandžio gleivinės ląstelių [4]. Daugiau tyrimas mūsų laboratorijoje parodė, kad PKG II gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių linijų ir blokas EGF sukeltas signalo perdavime iš MAPK /ERK sąlygojamą keliu platinimu per užkirsti kelią EGFR aktyvacija EGF [5], [6]. Kadangi EGFR aktyvavimo gali inicijuoti keletą impulsų perdavimą, įskaitant MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT ir PLCγ1-tarpininkaujant takais [7], [8], blokavimo poveikis Pkg II aktyvavimas EGFR rodo, kad šio fermento gali turėti platus slopinančio poveikio signalo perdavime ir susijusius biologinius veiklą skrandžio vėžio ląsteles. Šis dokumentas buvo skirtas patvirtinti šį platus slopinamąjį poveikį PKG II per tiriant Pkg II slopinimas dėl EGF sukeltos migracijos bei su jais susijusių perduoti signalo skrandžio vėžio ląsteles.

Rezultatai

PKG II slopina EGF sukelta ląstelių migracija, kuri yra susijusi su signalo perdavime iš PLCγ1 ir MAPK /ERK tarpininkaujant kelius

Mobilusis migracija yra svarbus normaliai fiziologijos ir ligos. Įsigijimas migracijos gebėjimą vėžio ląstelių yra būdinga, kad prisideda prie plitimą metastazavusiu vėžinių ląstelių į tolimus organus. Naujausi duomenys parodė, kad EGF gali stimuliuoti vėžinių ląstelių migraciją. Mechanizmas, per kurį EGF stimuliuoja ląstelių migraciją nėra aišku, bet kai kurie duomenys rodo, kad EGF gali tai padaryti per pradėti perduoti signalo iš PLCγ1 ir MAPK /ERK tarpininkaujant kelius. Šio eksperimento metu, mes nustatėme, migracijos stimuliuojančio poveikį EGF AGS ląstelių ir naudojamas inhibitoriaus pagrindinių komponentų į signalo kelius ištirti galimą perduoti signalo, susijusio su poveikio. Rezultatai parodė, kad EGF lėšomis gydymo padidėjo migracijos aktyvumą AGS ląstelių ir tiek MEK (pagrindinis komponentas MAPK /ERK sąlygojamą keliu) inhibitorius U0126 ir PLCγ1 inhibitoriais U73122 slopinamas EGF sukelta migracija, nurodant, kad EGF lėšomis skatina ląstelių migraciją veiklą per aktyvuoti tiek MAPK /ERK ir PLCγ1 tarpininkaujant impulsų perdavimą (1 pav.).

PKG II blokų EGF sukeltas Tyr 992 ir Tyr 1068 fosforilinimas EGFR

"EGF jungiasi su EGFR, jis sukelia auto fosforilinimo receptoriaus. Yra keletas automatinis-fosforilinimo svetaines, kurios yra sujungtos su kitu signalo perdavimo keliu. Tirozinas 992 ir Tirozinas 1068 yra tarp automatinio fosforilinimo vietų EGFR ir yra susiję su PLCγ1 tarpininkaujant ir MAPK /ERK tarpininkaujant signalizacijos atitinkamai. Šio eksperimento metu, mes ištirti slopinantį poveikį PKG II dėl tirozino 992 ir tirozino 1068 fosforilinimo EGFR skirtingai, gydytų AGS ląstelių naudojant Imunoblotingo. Rezultatai parodė, kad EGF lėšomis gydymas sukėlė 14 raukšlės padidinti tirozino 992 ir 8 raukšlės padidėjo Tirozinas 1068 fosforilinimo EGFR. Infekuotų su Ad-Pkg II ir stimuliuotos cGMP ląstelių, fosforilinimo buvo žymiai sumažėjo (2 pav., 3). Tai rodo, kad PKG II galėtų užkirsti kelią EGF sukeltas Tirozinas 992 ir Tirozinas 1068 fosforilinimo EGFR ir todėl slopina PLCγ1 tarpininkaujant ir MAPK /ERK tarpininkaujant signalizacijos.

PKG II Apsaugo EGF sukėlė Pagrindiniai renginiai PLCγ1 tarpininkaujant signalo perdavimas kelią

(1) PLCγ1 aktyvacijos.

PLCγ yra tolesnis komponentas tirozino kinazės receptorius (RTKs). Jis turi dvi izoformų: PLCγ1 yra pasiskirsto visur ir PLCγ2 iš esmės išreiškiamas kraujodaros ląsteles. Aktyvinimas PLCγ1 reikalauja savo Priėmimas į membranos ir kartu per savo SH2 domeną, aktyvintomis RTKs pavyzdžiui, EGFR. Ši asociacija bus sukelti PLCγ1 fosforilinimo apie tirozino liekanos, ypač dėl tirozino 783, ir jos fermentų aktyvumo padidėjimas. Mes taikomas IP metodą izoliuoti PLCγ1 ir tada naudojamas Vakarų dėmė būdą aptikti PLCγ1 fosforilinimas. Rezultatai parodė, kad EGF lėšomis gydymas sukelia akivaizdų padidėjo Tyr783 fosforilinimo PLCγ1 ir PKG II veiklos padidėjimas per užkrėsti ląsteles su Ad-PKG II ir stimuliuoja ląsteles GMP efektyviai užkirto kelią EGF sukeltas fosforilinimo PLCγ1 (pav. 4 ).

(2) DAG formavimas.

Kai ji įjungta, PLCγ1 gali katalizuoja fosfatidil 4,5-bisphos-phate hidrolizę (PI 4,5P _{2) į inozitolio 1,4,5-trisphosphate (IP 3) ir diacilglicerolio (DAG), du molekulių, kurios reguliuoja intraceliulinės Ca mobilizacijos ^{2 + ir baltymų kinazės C aktyvumą, atitinkamai. Norėdami laikytis EGF ir Pkg II poveikį DAG formavimas, IFA metodas buvo naudojamas siekiant aptikti DAG koncentraciją AGS ląsteles. Rezultatai parodė, kad EGF lėšos paskatino AGS ląsteles, iš DAG lygis akivaizdžiai padidėjo ir iš anksto infekcija Ad-Pkg II ir gydymo 8p-CPT-GMP slopino DAG formavimąsi sukelia stimuliaciją su EGF (pav. 5).}}

(3) "Ca ^{2 + atleidžiantis.}

IP3 ir DAG yra antra angelai PLCγ1 sąlygojamą signalo perdavimo keliu. IP3 yra žinoma, kad skatinti kalcio išsiskyrimą iš vidaus parduotuvių. Mes naudojome kalcio indikatoriaus Fluo-3 /AM aptikti kalcio citoplazmoje. Rezultatai parodė, kad EGF lėšomis gydymo padidėjo Ca išsiskyrimą ^{2 + iš Endoplazminis tinklas (ER) į citoplazmą ir aukštos raiškos ir veiklos Pkg II smarkiai slopino spaudai, atbulinės eigos, kad EGF gydymo poveikį (Pav. 6).}

(4) aktyvinimas PKCα.

PKCα, kurio baltymų kinazės C izoformos, yra pagrindinis komponentas PLCγ1 sąlygojamą signalo keliu ir gali būti aktyvuota Ca ^{2 + ir DAG , Aktyvuojama, PKCα translocates iš citozolyje į membranos ląsteles. Taigi, PKCα suma membranos atstovauja PKCα aktyvacijos. Šio eksperimento metu, mes ištirti slopinantį poveikį Pkg II dėl PKCα aktyvacijos skirtingai, gydytų AGS ląstelių naudojant Imunoblotingo. Rezultatai parodė, kad per penkias minutes įpylus EGF mitybinės terpės, į PKCα perkėlimui iš citozolyje membraną smarkiai išaugo ir translokacijos buvo slopinamas anksto užkrėsti ląsteles Ad-Pkg II ir gydymą 8-pCPT-GMP ( 7 pav.).}

(5) aktyvavimas CaMKIIα.

studijos dėl Ca ​​reglamento ^{2 + /kalmodulino (CAM) -dependent kinazės II alfa (CaMKIIα), kuris yra pagrindinis izoformos CaMKII, parodė, kad, kai Ca 2 + /Vaizdo jungiasi su CaMKIIα, viduje molekulinės autofosforilinimą atsiranda ir fosforilinimo palaiko nuolatinį aktyvavimo fermento. Antikūnų prieš fosfo-CaMKIIα (Thr286) buvo taikomas imunoblotingo aptikti CaMKIIα fosforilinimas. Rezultatai parodė, kad AGS ląstelių gydomi EGF Thr286 fosforilinimas CaMKIIα padidėjo beveik 2,5 raukšlės ir infekcijos su Ad-Pkg II ir gydymo 8-pCPT-GMP slopino fosforilinimo sukeltos EGF (8 pav.) Padidėjimas.}

PKG II slopina EGF sukeltas aktyvavimas pagrindinės sudedamosios dalys MAPK /ERK sąlygojamą signalo perdavimo kelią

(1) aktyvinimas iš MAPK /ERK.

MAPK /ERK yra pagrindinis komponentas MAPK /ERK sąlygojamą keliu. Fosforilinimo tiek treonino 202 ir tirozino 204 likučių ERK1 ir treonino 185 ir tirozino 187 likučių ERK2 reikalingas pilnam fermentinio aktyvacijos. Antikūnų prieš p ERK1 /2 (Kt 202 /Tyr 204) buvo taikomas imunoblotingo aptikti dvigubą fosforilinimo ERK. Rezultatai parodė, kad per penkias minutes įpylus EGF ląstelių kultūros terpėje, fosforilinimas ERK1 /2 AGS ląstelių dramatiškai (10 raukšlės) padidėjo ir fosforilinimo buvo slopinamas anksto užkrėsti ląsteles Ad Pkg II ir aktyvinti fermentą su 8-pCPT-GMP (9 pav.).

(2) aktyvavimas anksčiau.

Mažas G baltymo Rasa yra dar vienas svarbus komponentas MAPK /ERK tarpininkaujant signalo kelyje. Jis turi dvi formas ląstelių: GTP-privalo aktyviai formą ir BVP jungiasi neaktyvios formos. Kai Rasa yra GTP-jungiasi forma, ji gali įpareigoti ir aktyvuoti Raf-1 ir pradėti su tuo susijusią suaktyvintas serino /treonino kinazės į signalo kelyje. Mes taikomas "pull-down" metodu nustatant aktyvuotą Ras. Rezultatas parodė, kad po to, kai pridedant EGF mitybinės terpės, aktyvus Ras į AGS ląstelių akivaizdžiai padidėjo per penkias minutes. Užkrėsti ląsteles su Ad-Pkg II ir skatinti juos su 8-pCPT-GMP prieš pridedant EGF lėšos gerokai sutrukdė EGF sukeltas Ras aktyvinimas (10 pav.).

PKG II slopina EGF sukeltas aktyvavimas RAC1

Mažas G baltymo RAC1 yra pagrindinis narys Rho šeimos, kuri vaidina svarbų vaidmenį migracijos vėžinių ląstelių reguliuoti. Tiek PLCγ1 ir MAPK /ERK tarpininkaujant signalo perdavimas gali aktyvuoti RAC1 o vėliau skatina ląstelių migraciją. Siekiant dar labiau patvirtina, slopinantį poveikį Pkg Ii EGF /EGFR sukeltos signalizacijos kuri yra susijusi su migracija, buvo taikomas aptikti Pkg II slopinimas aktyvacijos RAC1 "išskleidžiamajame" metodas. Rezultatas parodė, kad EGF gydymas sukelia akivaizdus padidėjimas aktyvaus RAC1 ir didelio aktyvumo iš Pkg II efektyviai slopino RAC1 aktyvinimas (11 pav.). Tai suteikė dar vienas įrodymas, kad Pkg II slopinimo apie EGF sukeltos migracijos skrandžio vėžio ląsteles.

PKGII sąveikauja su EGFR ir sukelia Thr-phoshporylation receptoriaus

mechanizmas, per kurį PKGII blokų EGF sukeltas aktyvavimo EGFR preliminariai buvo tiriamas šio eksperimento. Co-imunoprecipitaciją buvo taikomas, siekiant nustatyti tarp PKGII ir EGFR sąveiką. Imunoblotingu su visos anti fosforilinimo treonino antikūno buvo naudojamas aptikti treonino fosforilinimą EGFR, kurį sukelia PKGII. CO-Imunoprecipitacijos rezultatai parodė, kad AGS ląstelių užsikrėtusių Ad-Pkg II ir skatino su 8-CPT-GMP, tiesioginis privalomas tarp Pkg II ir EGFR buvo aptiktas (12 pav., Blokinis A). Rezultatai Vakarų blotingo metodu parodė, kad aktyvavimo Pkg II sukelia treoninas fosforilinimą EGFR (12 pav., Blokinis B). Tai rodo, kad PKG II blokavo aktyvacijos EGFR per privalomas su receptoriumi ir sukelia fosforilinimo jį.

Diskusijos

Šiuo metu du GMP priklausomo baltymų kinazės (Pkgs), PKG I ir PKG II buvo nustatytos žinduolių ląstelėse [10], [11]. PKG Aš plačiai pasiskirsto organizme ir dėl jos slopina naviko augimui ir invaziškumo ir sukelia poveikį apoptozės naviko ląstelių, jis buvo identifikuotas kaip naviko slopintuvas [12]. Iš Pkg II išraiška yra daugiau audinių ribojama [13]. Ilgą laiką, priešingai nei gerai pasirodė priešnavikinis poveikis Pkg I, jokių tyrimų duomenys aiškiai nurodyta priešvėžiniai vaidmenį PKG II ir tai kinazės buvo susijęs tik keletą fiziologinių funkcijų, įskaitant žarnyno sekreciją, kaulų augimui, ir mokymosi atminties [14]. Tačiau tyrimai susidomėjimas Pkg II didėja, ir buvo nustatyta keletas naujų funkcijų Pkg II neseniai, įskaitant Pkg II vaidmuo reguliuojant epitelio natrio kanalų ir Mechanoterapijos signalo perdavime [15] - [17]. Dar svarbiau, akumuliavimo Tyrimo duomenys rodo, kad PAKAV II buvo susijęs su proliferaciją ir apoptozės kai kuriose ląstelių, o ypač auglio ląstelėse, o tai rodo, kad šioje srityje svarbų vaidmenį šio fermento į biologiniam aktyvumui vėžinių ląstelių reguliavimo [1] - [6].

EGFR egzistuoja dėl visų ląstelių paviršiuje. Su kurio molekulinė masė yra 170KD, EGFR turi ekstraląstelinę dalį, kryžminio membranos domeną ir viduląstelinis domeną. Ląstelėse sritis EGFR turi 542 amino rūgščių likučių ir gali būti suskirstyti į apytikslis membranos sub-domeną, tirozino kinazės subdomeno ir C-galo subdomeno [18]. Aktyvacijos proceso metu iš EGFR apima tirozino fosforilinimo jo viduląstelinė domeno ir įvairių fosforilinimo svetainių domeno yra susiję su skirtingų signalizavimo būdus. Kai EGFR aktyvuota, ji gali įdarbinti efektorių baltymus jos fosforilinto C-terminalo sub-domeno ir inicijuoja efektoriaus baltymų-tarpininkaujant kelius [19], [20]. Tarp fosforilinimo vietų, tirozino 1068 ir 1086 yra susiję su MAPK /ERK medijuojamo kelio ir tirozino 992 ir 1173 yra susiję su PLCγ medijuojamo signalo keliu [7], [8]. Mūsų ankstesni rezultatai parodė, kad PKG II gali slopinti EGF sukeltas tirozino 1068 fosforilinimo EGFR skrandžio vėžio ląstelių linijos BGC-823 [6], keliant klausimą, ar PKG II gali slopinti kitų tirozino svetainių fosforilinimo apie EGF /EGFR ir po to turi plataus diapazono slopinimas nuo EGF /EGFR sukeltas signalas transductions ir susijusių biologinių veiklos skrandžio vėžio ląsteles.

šiame straipsnyje mes tyrė Pkg II veiksmų EGF sukeltos migracijos aktyvumo skrandžio vėžio ląstelių linijos MAA. Rezultatai parodė, kad PKG II turėjo reikšmingai neslopina apie ląstelių migraciją sukelia EGF. Tai suteikia papildomų įrodymų dėl atskleidžiant naviko slopina poveikį PKG II. Tyrimo duomenys parodė, kad tarp EGF /EGFR inicijavo signalo perdavimo kelius, PLCγ1 ir MAPK /ERK tarpininkaujant signalo perdavimo kelių yra susiję su migracijos veiklos [21], [22]. Norėdami patvirtinti šią skrandžio vėžio ląsteles, mes panaudojome inhibitoriaus signalo perdavimas komponento identifikuoti MAPK /ERK ir PLCγ1-tarpininkaujant darbinio proceso dalyvavimą. Rezultatai parodė, kad MEK inhibitorius U0126 ir PLCγ1 inhibitorius U73122 dalinai užblokavo "EGF /EGFR sukeltos migracijos aktyvumą AGS ląstelių, nurodant, kad abu signalo perdavimo kelių dalyvavo reguliavimo procese. Išsiaiškinti galimą slopina veiksmą Pkg II dėl šių signalo perdavimo kelius, pirmiausia ištirti slopinantį poveikį Pkg II nuo EGF inicijavo PLCγ1 tarpininkaujant signalo perdavimo kelias. Rezultatai parodė, kad PKG II išvengti visų pagrindinių įvykių šiame signalo perdavimo kelias, įskaitant Tyr 992 fosforilinimo /aktyvinimo EGFR, kad fosforilinimo /aktyvinimo PLCγ1, antrosios kurjerių DAG formavimas, kalcio išleidimo į Cytoplasma ir iš PKC ir CAMK IIα aktyvacijos. Dėl Pkg II slopinimo apie EGF /EGFR sukeltas MAPK /ERK tarpininkaujant signalo perdavimo kelias, mūsų Darbo parodė, kad PKG II slopina visų pagrindinių komponentų aktyvacija keliu sukeltos EGF skrandžio vėžio ląstelių linijos BGC-823 [ ,,,0],6]. Šiame straipsnyje mes ištirti slopinantį poveikį Pkg Ii "EGF /EGFR sukeltos aktyvavimo pagrindinių komponentų šiame kelyje. Rezultatai patvirtino, kad PKG II slopinamas EGF sukeltas aktyvavimo Ras baltymų ir MAPK /ERK į AGS ląstelių, o tai rodo, kad PKG II taip pat slopinamas EGF /EGFR sukeltos perduoti signalo iš MAPK /ERK tarpininkaujant keliu šiame vėžio ląstelių linija. Šie rezultatai parodė, kad sistemingai PKG II slopinamas EGF sukeltas migracijos skrandžio vėžio ląsteles per blokavimo EGF /EGFR inicijavo signalo perdavime iš PLCγ1 ir žemėlapis /ERK-tarpininkaujant kelius.

signalo perdavimas tiek PLCγ1 ir žemėlapis /ERK sąlygojamą keliai gali aktyvuoti mažas g baltymų Rac1, kuris yra pagrindinis komponentas reguliuojant ląstelių migraciją [23], [24]. Norėdami patvirtinti Pkg II slopinimas dėl šio svarbaus įvykio EGF sukeltos migracijos dujų ląstelių, mes taikomas "išskleidžiamajame" metodą, kad patikrintų Rac1 veiklą kitaip apdorotų AGS ląsteles. Rezultatai parodė, kad per EGF sukeltos migracijos Rac1 buvo aktyvuota ir aktyvacijos buvo susijęs tiek PLCγ1 ir žemėlapis /ERK sąlygojamą signalizacijos. Be to, PKG II slopino EGF sukeltas aktyvavimo RAC 1. Tai dar labiau patvirtina slopinantį poveikį Pkg II nuo EGF /EGFR inicijavo ląstelių migraciją.

EGFR glaudžiai susijęs su tumorigenensis. Per saviraiškos ir mutacijos EGFR dažnai būna daugeliu vėžio. Tyrimo duomenys parodė, kad daugiau kaip 50% -70% nuo plaučių vėžio, storosios žarnos vėžio ir krūties vėžio turi aukštą raišką EGFR [25]. Be to, pacientai, sergantys per saviraiškos EGFR paprastai turi nedaug galimybių išgyventi. Pavyzdžiui, EGFR per-išraiškos buvo aptikta 60% nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžys (NSLPV) pacientams ir pacientų prognozė buvo prastos, su tik 4-5 mėnesius išlikimo [26]. vitro
eksperimentai patvirtino, kad per išraiškos EGFR sukėlė transformaciją NIH-3T3, RAT-1 ir NRK ląstelių ir blokuoti EGFR aktyvacijos slopina proliferaciją kai kurių vėžinių ląstelių [27]. Todėl, EGFR yra pirmasis augimo faktoriaus receptoriaus laikoma vėžys terapijos tikslą. Keli būdai slopinančiu EGFR veiklai, susijusiai signalo perdavime, įskaitant specifinių antikūnų prieš EGFR ir inhibitoriais EGFR, gavo intensyvių mokslinių tyrimų [28] - [30]. Nauji ir efektyvesnių metodų blokuoja EGFR tarpininkaujant perduoti signalo bus naudinga vėžio gydymo. Todėl išvada, kad PKG II gali slopinti EGFR aktyvinimą ir reglamentuoti perduoti signalo turi svarbią reikšmę. Tai aiškiai rodo, kad PKG II yra potencialus endogeninė EGFR inhibitorius ir suteiks naują užuominą apie strategiją vėžio gydymo.

Tyrimo duomenys parodė, kad kai kurie baltymai kinazės gali sukelti fosforilinimo EGFR ir paveikti savo aktyvacijos ir /ar vietą. Pavyzdžiui, baltymų kinazės C (PKC) gali sukelti treonino 654 EGFR fosforilinimo ir reguliuoja receptorių ir internalizacijos [31]. Serino 1046/1047 (Ser1046 /1047) fosforilinimo svetainė yra reikalingas EGFR budrumą į EGF gydytų ląstelių [32] .Be mūsų eksperimentų, mes nustatėme, kad Thr654 fosforilinimas ir EGFR Ser1046 /1047 ir nustatė, kad PKG II nebuvo sukelti fosforilinimo šių fosforilinimo svetainėse. Tačiau, mūsų rezultatai parodė, kad buvo tiesioginė sąveika tarp Pkg II ir EGFR ir Pkg II sukėlė treoninas fosforilinimo EGFR. Tai rodo, kad PKG II blokavo EGFR aktyvavimo per kirptas ir fosforilinimo receptorių. Tikslus fosforilinimo svetainė bus mūsų kitas tyrimų tikslas.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linija ir reagentai

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija "AGS buvo teikiama iš ląstelių biologijos instituto (Šanchajus, Kinija). Adenoviral vektoriai kodavimo ß galaktosidazei (PAD-lacZ) ir PKG II (PAD-PKG ii) buvo natūra dovanos nuo dr Gerry Boss ir dr Renate Pilz universitete Kalifornijoje, San Diege, JAV Dulbecco modifikuota Eagle Media (DMEM) ir vaisiaus jaučio serumo (FBS) buvo iš GIBCO (Grand Island, NY). Antikūnų prieš Pkg II buvo iš ABGENT biotechnologijos (San Diego, CA). Ožkos kovos su β-Aktinis, pelės anti-PAN-Ras ir pelės anti-PLCγ1 antikūnai buvo iš Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Triušis Anti-P-EGFR (Tyr1068), triušių anti-P-EGFR (Tyr992), triušių anti-EGFR, pelės anti-P-ERK (Kt 202 /Tyr 204), triušių anti-ERK ir triušio prieš p PLCγ1 (Tyr783) antikūnai buvo iš mobiliųjų Signalizacijos technologijos (Danvers, MA). Triušis prieš PKCα ir triušio prieš p CaMK IIα (Thr286) buvo iš Bioworld technologijos (St Louis Park, MN). Triušis Anti-P-Kt antikūnų buvo iš Abcam (MA, JAV) .Horseradish peroksidazės (HRP) konjuguoto antriniai antikūnai buvo iš Jackson imuninės tyrimų laboratorijose (Vakarų Grove, PA). Korinis pralaidi GMP analoginis 8-pCPT-GMP buvo iš CalBiochem (San Diego, CA). EGF U73122 ir U0126 buvo iš Sigma (St Louis, MO). Electrochemiluminescence (ECL) reagentai buvo iš Millipore (BILLERICA, MA). Ca ^{2 + rodiklis Fluo-3 /PM ir membranos ir citozolyje Baltymai gavyba rinkinys buvo iš Beyotime (Jiangsu, Kinija). Žmogaus diacilo glicerolis (DAG /GD) IFA rinkinys buvo iš Cusabio Biotech Co., Ltd (Newark, DE). Visi kiti naudojami reagentai buvo analiziškai gryni.}

paruošimas Adenoviral Vektoriai

293A ląstelės buvo pernešta su adenoviruso vektorius kodavimo lacZ ir Pkg II atitinkamai ir kultūringas iki dešimties dienų, kol buvo pastebėtas EP. Ląstelės ir kultūrinė terpė buvo surinktos ir patyrė tris įšaldymas-atšildymo ciklų. Virš nuosėdų buvusį skystį, kuriame yra adenovirusų (Ad-lacZ ir Ad-PKG II) naudojo užkrėsti naujų 293A ląsteles, siekiant papildyti adenovirusų. Amlifikuoti adenovirusiniai preparatai buvo didinama ir PFU /ml, buvo nustatyta, ir laikomi -80 ° C iki naudojimo.

Mobilusis Kultūra ir infekcija Adenoviral vektoriai

AGS ląstelės buvo auginamos DMEM tiekiamas su 10% FBS ir palaikoma 37 ° C temperatūroje drėgnoje inkubatoriuje 95% oro ir 5% CO _{2. Vidutinės buvo keičiama kas dvi dienas ir ląstelės buvo subrangos kultivuojamos santakoje. Dieną prieš infekciją, ląstelės buvo šviežiai pasodinti 70-80% santakoje, buvo atliktas infekcija Ad-lacZ ir Ad-Pkg II.}

Imunoblotingo

Baltymų mėginiai buvo atliekami ant SDS-PAGE (8-12%) gelio pagal molekulinę dydžio taikinio baltymo, ir elektroforezės ir membranos perdavimu, buvo atliktas pagal gamintojo protokolą (Bio-Rad, Hercules, CA). Pirminiai antikūnai buvo inkubuojami per naktį esant 4 ° C temperatūroje, TBS-T (2% Tween-20), ir atitinkami antriniai antikūnai buvo inkubuojami 1 h kambario temperatūroje į TBS-T (2% Tween-20), su trimis plauna po kiekvieno inkubacijos. ECL reagentai buvo naudojamas norint parodyti teigiamus juostomis ant membranos. Norėdami atlikti Densitometry analizę, skaitmeninį vaizdų teigiamų juostų buvo gauti Chemidoc XRS ir analizuojami naudojant vaizdo analizės programos Kiekis vieną (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV). Rezultatai parodė, kaip taikinio baltymo /pakrovimo kontrolės santykis.

"išskleidžiamajame" analizė Aktyvus Mažoji g baltymų Ras ir Rac1

Ras veikla buvo aptiktas su išskleidžiamajame metodu, kaip aprašyta anksčiau [9]. Trumpai tariant, tokių ląstelių augimą ant 100 mm lėkštelę su kultūra tris kartus buvo plaunamos šaltu PBS ir lizuojamos pridedant 400 pL lizės buferyje (25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10% glicerolio, 25 mM, NBS , 10 mM MgCl _{2, 0,25% natrio deoksicholatas, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3VO 4, 10 mikrogramai /ml aprotinino, ir 10 mikrogramai /ml leupeptiną). Mėginio paėmimo ir centrifuguojamas (14000 g, 4 ° C, 10 min), atsikratyti šiukšlių. Supernatantas buvo inkubuojami su gliutationo-Sepharose karoliukų ir glutationo S
-transferase-Ras-UBR (GST-UBR), esant 4 ° C temperatūroje 1 val. Granulės buvo plaunamos 3 kartus su lizės buferiniame tirpale, ir kaitinamas virintu vandeniu atpalaiduoja baltymus. Baltymų pavyzdžiai (kurių sudėtyje yra veikliųjų RAS) buvo analizuojami Imunoblotingo su antikūnais prieš visos-RAS. Veiklioji Rac1 buvo aptiktas su panašiu būdu, bet su GST-Pak1 baltymo surišimo domeną (PVM-PBD) ir antikūnų prieš Rac1.}

Imunoprecipitacijos

augantys 100 mm kultūros plokštės ląstelės buvo plaunami du kartus su šaltu PBS ir lizuojamos pridedant 1 ml Ripa buferio (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptiną, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido, 10 mM NaF, 1 mM Na _{3VO 4) už plokštės. Antikūnai prieš PLCγ1 ir p-PLCγ1 buvo naudojami Imunoprecipitacijos. Nuosėdos tyrinėjo su antikūnų tikslinių baltymų.}

Analizė kalcio Cytoplasma

Jei stebėti EGF ir Pkg II poveikį EGF sukeltas kalcio išsiskyrimą, AGS ląstelės buvo pakrautas su 5 pm iš membraną, pralaidžią kalcio rodiklis Fluo-3-acetoksimetil (AM) esterio 30 min 37 ° C temperatūroje DMEM. Nuo pakrovimo, ląstelės buvo išplauti su PBS ir suspenduotos DMEM. Fluorescencijos matavimai buvo atliekami naudojant Olympus "Fluoview-500 confocal sistemą. Fluo-3 džiaugiamės argono lazerio šviesos esant 488 nm bangos ilgiui ir fluorescencija buvo matuojamas bangos ilgiai nuo 515 nm.

IFA nuo DAG

DAG koncentracija buvo matuojamas ELISA, pagal gamintojo nurodymus , Šiam testui dirba kiekybinį sumuštinis imunofermentinį techniką. Su konkrečia DAG antikūnas buvo iš anksto dengtos ant mikro-plokštės. Standartai ir mėginiai įpilami į šulinius ir bet DAG metu yra saistomas imobilizuota antikūnų. Po to, kai pašalina bet kurias nesusietų medžiagų, biotino-konjuguoto antikūnas, specifiškas DAG pridedama į šulinėlius. Po plovimo, avidino konjuguoto krienų peroksidazės (HRP) pridedama į šulinėlius. Po plovimo pašalinti bet kokį nesusiję avidino-fermento reagentas, substratas sprendimas pridedamas prie šulinių ir spalva vystosi proporcingai DAG suma sujungti su pirmojo žingsnio. Spalvų kaita sustabdoma ir spalvos intensyvumas matuojamas.

pavienių ląstelių tyri- mas Frakcijonuojant

pavienių ląstelių tyri- mas kolonos į citozolyje ir membranos frakcijų buvo atlikta naudojant membranos ir citozolyje Baltymai ekstrakcijos rinkinio, pagal gamintojo instrukcija. Monosluoksnio kultūros tris kartus buvo plaunamos su ledinio PBS tirpalo ir mėšlą išmeta į šalto homogenizacijos buferiniu tirpalu (HB), kuriame yra 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4 mm EDTA, 2 mM EGTA, 10% glicerolio, 10 g /ml leupeptiną, 1 mm PMSF. Ląstelės buvo lizuoti per ultragarsu su 4-15 s intervalais ir išsamūs lizės buvo stebimas mikroskopu. Homogenatas ultracentrifuguojami, ne 86.000 g 45 min, esant 4 ° C, ir viršutinis sluoksnis buvo paskirta citozoliniame frakciją. Granulių buvo resuspenduotos HB, kurių sudėtyje yra 1% Triton X-100 ir inkubuojami ant ledo 30 min. tada mėginiai buvo centrifuguojamas 14,000 g 20 min, esant 4 ° C, ir viršutinis sluoksnis buvo paskirta membranos frakciją. Visi mėginiai buvo virti ir išvalytas centrifuguojant.

Mobilusis Migracijos Analizės

Migracija veikla AGS ląstelių buvo aptikta transwell sistemos (BD BioCoatTM kontrolės 8,0 mm, PET membrana 24-gerai Ląstelių kultūrų įdėklai BD biomokslai). Po trypsinization, 5 * 10 ^{4cells buvo pasėjamos į aukštutinį kambarį, kuriame kultūros terpė be FBS. Ląstelių migracija į apatinės pusės membranos buvo sukeliama terpėje, turinčioje 10% FBS į apatinę kamerą 12 valandų, esant 37 ° C temperatūroje, audinių kultūra inkubatoriuje. Perkeltų ląstelės ant dugno pusėje membranos buvo fiksuoti 40% paraformaldehidus tirpalo 30 min, nudažomi į Giemsa tirpalo 10 min, o po to išplautas vandeniu. Tamsintas ląstelės buvo tikrinamas mikroskopiškai pagal šviesos mikroskopu. Migravo ląstelės buvo skaičiuojami 5 atsitiktinai pasirinktose srityse per įdėklu, ir vertės buvo vidutiniškai. Visi eksperimentai buvo atliekami su trimis pakartojimais po kiekvienu migracijos būklę.}

Statistinė analizė

buvo išreikštas duomenys, kaip tai ± standartinis nuokrypis (SD). Statistinė analizė atlikta naudojant dviejų ledinėmis ANOVA su SPSS statistinės programinės įrangos. P
-Pridėtinės mažesnis kaip 0,05 buvo laikomas reikšmingu.

Padėka

Mes dėkojame dr Gerry Boss ir dr Renate PILZ, University of California, San Diego, JAV už natūra dovanomis Adenoviral konstruktų.

• PLoS One: Socialiniai-demografiniai ir geografiniai veiksniai Stemplės ir skrandžio vėžio mirtingumo Švedijoje
• PLoS ONE: Padidėjusi CD151 prognozuoja prognozę pacientams, sergantiems rezekcijos skrandžio vėžio