PLoS ONE: Identificatie en karakterisering van CXCR4-positieve maagkanker Stem Cells

Abstract

Diffuse-type vaste tumoren zijn vaak samengesteld uit een groot deel van de zelden prolifererende (dwz slapende) kankercellen, sterk met vermelding van de betrokkenheid van kanker stamcellen (CSC) Hoewel diffuse type maagkanker (GC) patiënten hebben een slechte prognose door hoogfrequent ontwikkeling van peritoneale verspreiding (PD), het beperkte kennis dat de PD-geassocieerde CSCs en werkzaamheid van CSC- targeting therapie bij diffuse type GC. In deze studie hebben we vastgesteld zeer metastatische GC cellijnen door In vivo
selectie ontworpen voor de verrijking van PD-geassocieerde GC cellen. Door middel van microarray-analyse, vonden we CXC chemokine receptor type 4 (CXCR4) kan een nieuwe marker voor zeer metastatische CSCs, omdat CXCR4-positieve cellen verankering-onafhankelijk kunnen groeien, initiëren tumoren bij muizen, zijn resistent tegen cytotoxische drugs, en de productie van gedifferentieerde dochter cellen. In klinische monsters werden deze CXCR4-positieve cellen gevonden van niet alleen late metastase stadium (geaccumuleerde ascites), maar ook eerder stadium (peritoneale wasbeurten). Bovendien behandeling met transformerende groeifactor-β versterkte anti-kanker effect van docetaxel via inductie van celdifferentiatie /asymmetrische celdeling van de CXCR4-positieve maag CSCs zelfs in een slapende toestand. Daarom differentiatie inductoren houden belofte voor van thans beschikbare anti-kanker medicijnen verkrijgen van de maximale therapeutische resultaat door middel van re-cycling van CSCs

Visum:. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) Identificatie en karakterisering van CXCR4-positieve maagkanker stamcellen. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10.1371 /journal.pone.0130808

Editor: Masaharu Seno, Okayama University, JAPAN

Ontvangen: 18 februari 2015; Geaccepteerd: 25 mei 2015; Gepubliceerd: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden. Alle microarray data zijn gedeponeerd in een MIAME compliant database GEO; toegangsnummer GSE53276

Financiering:. Dit werk werd mede ondersteund door het Nationaal Instituut voor Biomedische Innovatie (voor de Advanced Research for Medical Products Mining Programme ID10-41), het ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn van Japan (voor de Derde Comprehensive 10-Year-strategie voor Kankerbestrijding H22-007), National Cancer Center Research en Development Fund (25-A-6, 26-A-3). Drs T Fujita, M Tamaoki en T Nishimura zijn de ontvangers van een Research Resident Fellowship van de Stichting Bevordering van Kankeronderzoek in Japan

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is één van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd. Histopathologisch, kan GC worden ingedeeld in twee grote categorieën: intestinaal-type en diffuse-type. Intestinale-type GC overheerst in een hoog risico geografische gebieden en ontwikkelt zich door een aantal opeenvolgende stadia inclusief Helicobacter pylori
( H
. pylori
) geassocieerde atrofische gastritis, intestinale metaplasie (IM), en dysplasie. Daarentegen diffuse-type GC, die goed is voor de helft van alle GC-patiënten, heeft een brede geografische spreiding en ontwikkelt zelfs van H
. pylori
-vrij, morfologisch normale maagslijmvlies zonder atrofische gastritis of IM, en diffuse-type GC kan afwijken van de intestinale-type zowel genetisch en fenotypisch [1-5]. In tegenstelling tot de dalende incidentie van het intestinale type, is de prevalentie van het diffuse type verluidt wereldwijd toe [6]. De prognose voor geavanceerde diffuse type GC patiënten is slecht in het afgelopen decennium gebleven als gevolg van een hoge mate van peritoneale verspreiding (PD) (78%) vergeleken met die van intestinale-type (45%) [7]. Vooral patiënten met type IV Bormann GC hebben een zeer slechte prognose, zelfs als zij ontvingen multidisciplinariteit [8]. Daarom is het aanpakken van PD is een dringende kwestie voor verbetering van de prognose van de diffuse-type GC patiënten.

Diffuse-type GC worden doorgaans gekenmerkt door een uitgebreid stromale fibrose met een slechte doorbloeding en zeldzame proliferatie ( i
. e
. slapende) kanker cellen, wat leidt tot een aanzienlijke therapeutische weerstand. Vanuit het oogpunt van chemotherapie, transformerende groeifactor β (TGF-β) is gedacht bij te dragen aan de agressieve progressie via epitheliale-mesenchymale overgang en doordat fibrose [9]. Echter, TGF-β remt ook celproliferatie, apoptose en differentiatie bemiddelt in epitheliale cellen, wat suggereert dat onderdelen van de TGF-β signaalwegen hebben tumor-onderdrukkende activiteit epitheliale tumoren [10, 11]. Hoewel accumuleren bewijs de kritische rol van TGF-β bij kanker stamcellen (CSC) biologie bewezen, beperkte informatie over zijn rol in diffuse type GC.

Vermeld is dat elke populatie van tumorcellen tonen functionele heterogeniteit gekenmerkt door verschillende proliferatie en differentiatie capaciteit in diverse typen tumoren [12]. Ter compensatie van dergelijke tumor heterogeniteit, zijn twee modellen voorgesteld: de klonale evolutie model [13] en de CSC model [14]. Het laatste model heeft brede aandacht gekregen, aangezien het voorziet in een redelijke verklaring voor de weerstand tegen conventionele chemo- en radiotherapie, waarin rustende of langzaam fietsen CSCs overleven, en resulteert in een eventuele tumor recidief [15-17]. Daarom therapeutische strategieën te richten CSCs zijn noodzakelijk om de resterende ziekte uit te roeien en om herhaling in niet alleen GC, maar ook andere vormen van kanker te voorkomen. Bovendien huidige inzichten in de cellulaire mechanismen van carcinogenese, het metastatisch potentieel van tumorcellen wordt toegeschreven aan CSCs, die klonaal kan initiëren tumorvorming op afgelegen plaatsen [18 19]. Hoewel een aantal celoppervlak moleculen als markers CSC voorgesteld in een grote verscheidenheid van menselijke maligniteiten, is er geen merker identificatie van PD-geassocieerde CSCs geweest GCs [20-23]. Om dergelijke markers hebben wij het idee dat functioneel en genetisch heterogene tumoren gemeenschappelijk en intrinsieke mechanismen van tumor onderhoud volgens de context van een bepaald micro-omgeving. Daarom hebben we de hypothese dat CSCs functioneel door goed gevalideerde tests moeten worden gedefinieerd zoals In vivo
transplantatie. In diffuse-type GC, richtten we ons in eerste instantie op het buikvlies-specifieke kolonisatie van cellen en verrijkt de PD-geassocieerde CSCs door repeterende In vivo
selecties [24, 25]. Hier hebben wij CXC chemokine receptor type 4 (CXCR4) een marker voor PD geassocieerde maag- CSCs en aangetoond dat TGF-β verhoogt de effectiviteit van anti-tumor geneesmiddelen via inductie van celdifferentiatie /asymmetrische celdeling in de CXCR4 ^{+ CSC bevolking zelfs in een slapende toestand.}

Materialen en methoden

Klinische monsters

de klinische monsters werden verstrekt door de National Cancer Center Hospital (Tokyo, Japan) na het behalen van schriftelijke toestemming van elke patiënt en goedkeuring door National Cancer Center Institutional review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

cellijnen en primaire kweken

Een menselijk GC cellijn, HSC-60 werd opgericht door een medewerker met behulp van de procedure zoals eerder [26] beschreven. Een zeer peritoneale-metastatische cellijn, 60As6 opgericht van HSC-60 gebruikt orthotope weefselimplantatie in SCID /SCID-muizen als volgt kort: de xenogetransplanteerde tumor van HSC-60 cellen getransplanteerd in de maagwand van een muis. We herhaalden zes cycli van verzameling ascites tumorcellen en de orthotope inoculatie van deze cellen. Beide cellijnen werden in een RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalverserum gehouden. We hebben ook vastgesteld twee-luciferase tot expressie cellijnen (HSC-60Luc en 60As6Luc). Zes andere GC afgeleide cellijnen (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, en KATO III) werden eveneens gehandhaafd onder dezelfde voorwaarde. Van deze zes, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, en 58As9 werden vastgesteld door de bovenstaande procedure [27, 28], en KATO III werd verkregen van American Type Culture Collection. Voor primaire kweken werden cellen verzameld van peritoneale wassingen en ascites patiënten (NSC-16C, NSC-20C en NSC-22C) en gekweekt in een RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum.

microarray-analyse

Totaal RNA van 60As6, 60As6Luc, HSC-60, en HSC-60Luc cellen werd geïsoleerd door schorsing van de cellen in een ISOGEN lysisbuffer (Nippon Gene, Toyama, Japan), gevolgd door isopropanol neerslag. Wij hebben microarray analyses tweemaal door het gebruik van Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). De procedures werden uitgevoerd volgens de protocollen van de leverancier. De arrays werden gescand met een GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), en de gegevens werden geanalyseerd door Microarray Suite versie 5.0 met Affymetrix standaard analyse instellingen en wereldwijde schaal als normalisering methode. De getrimde gemiddelde doelstelling intensiteit van elke reeks werd arbitrair tot 1000. Al de microarray data zijn gedeponeerd in een MIAME compliant database GEO; toegangsnummer GSE53276. Een 2-voudige verandering, werden 684 genen geselecteerd specifieke genen voor 60As6 en 60As6Luc cellen en 1150 genen geselecteerd voor HSC-60 en HSC-60Luc cellen.

Dierproeven

Six -week-jarige vrouw C.B17 /Icr-SCID (SCID /SCID) muizen (CLEA Japan, Japan) werden gekweekt bij kamertemperatuur met een 12 uur licht /donker dagelijkse cyclus. De muizen werden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden en steriel voedsel, water en kooien. 1 x 10 ^{4-1 x 10 6 van kankercellen werden gesuspendeerd met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en vervolgens in de buikholte geïnjecteerd door gebruik van een 26 1/2-gauge naald. Muizen werden gewogen en wekelijks gemeten. Humaan eindpunt criteria opgenomen significante accumulatie van abdominale ascites, ademnood, pilo-erectie, bloedarmoede, of gewichtsverlies van meer dan 10% van het oorspronkelijke gewicht. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Internationale Vereniging voor de Studie van Pijn en goedgekeurd door het Comité voor Ethiek in de dierproeven van het National Cancer Center. De inspanningen werden gedaan om de aantallen en elk lijden van de dieren die worden gebruikt in de experimenten te minimaliseren.}

RT-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd door schorsing van de cellen in een ISOGEN lysisbuffer gevolgd door isopropanol neerslag. Semi-kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd binnen lineaire bereik 25-30 cycli voor MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, Lgr5
, TGFBR1
, TGFBR2
en ACTB
hand van de volgende primers: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'en 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 'voor MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3' en 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 'voor CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' en 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 'voor CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'en 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' voor CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'en 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' voor Lgr5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'en 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' voor TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'en 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' voor TGFBR2
, en 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'en 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' voor ACTB
.

immunocytochemie

indirecte fluorescerende immunocytochemie werd uitgevoerd voor CXCR4, MUC5AC en Smad2 /3 op cellen gekweekt in 4-well kamer dia's. Cellen werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Na drie keer wassen in PBS (-), werden ze geïncubeerd met anti-humaan CXCR4 monoklonaal antilichaam (R &D Systems, Minneapolis, MN), anti-humaan MUC5AC antilichaam (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz, CA), of anti- menselijk Smad2 /3-antilichaam (BD Biosciences, Bedford, MA) gevolgd door incubatie met een 1: 1000 verdunning van ezel-anti-muis Alexa 488-geconjugeerde serum (Invitrogen, Grand Island, NY) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Celkernen werden gekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Voor cel-lijn-test, gesorteerd enkele CXCR4 ^{+ kleine cellen werden gekleurd door CellTracker Green (Invitrogen) voor het opsporen van de levensvatbare cellen.}

Flowcytometrie en celsortering

60As6 cellen (1 x 10 ^{6 cellen) werden samen gedurende 30 minuten bij 4 ° C met de volgende antilichamen: APC anti-humaan CD184 (CXCR4) (IgG2a, kloon 12G5) of APC muis IgG2a k isotype controle verkregen BioLegend ( San Diego, CA). Dode cellen werden gelabeld met propidiumjodide en uitgesloten van de analyse. In celsortering werden de CXCR4-positieve en negatieve CXCR4-subpopulaties gezuiverd met een JSAN cell sorter (Bay Bioscience, Kobe, Japan) en werden geanalyseerd door een software FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Voor celcyclus analyses werden de cellen overgebracht naar een serumvrij medium gedurende 5 dagen, en vervolgens met 0,05% trypsine-EDTA geoogst, en vervolgens gesuspendeerd in koude 80% ethanol. Na vaststelling nacht bij -20 ° C werden de monsters gewassen in PBS (-) en geïncubeerd in 500 pl PI /RNase Staining Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA) per 1 x 10 6 cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor de analyse. Flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), en geanalyseerd door een software, FlowJo.}

Anchorage-onafhankelijke celgroei assay

Een zachte agar kolonie formatie test werd uitgevoerd met behulp van de CytoSelect 96-Well celtransformatietest Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden 5 x 10 ^{3 CXCR4-positieve of CXCR4-negatieve kleine cellen gesuspendeerd in DMEM bevattende 0,4% laagsmeltende agarose en 10% FBS en gezaaid op 1% van de laagsmeltende agarose bevattende DMEM en 10% FBS. Na incuberen van de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in 5% CO _{2 werden de cellen gelyseerd en gedetecteerd met CyQuant GR kleurstof. De fluorescentie van de kolonievormende cellen werd voorgelezen in Multifunctionele Microplate Reader (Safire, Tecan, Mannedorf, Swizerland) bij excitatie /emissie golflengten van 485/520 nm.}}

Invasion assay

Mobiele invasie werd bepaald met BD BioCoat tumorinvasie Assay System (BD Biosciences) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort, 4 × 10 ^{5 van 60As6 cellen met serum-vrije media werden gezaaid in de bovenste kamer van het systeem. Onderste putjes werden gevuld met medium met 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Na 24 uur incubatie werden de cellen in de bovenste kamer verwijderd en de cellen die binnengevallen door de Matrigel membraan werden gekleurd met Diff-Quick vlek (BD Biosciences) en handmatig geteld.}

Caspase assay

De 60As6 cellen werden bereid in een 96-putjes plaat (5 x 10 ^{3 cellen /putje). De caspase 3/7 assay werd uitgevoerd met de caspase-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI) en 24 uur na de toevoeging van recombinant TGF-β1 (240-B, R &D Systems) in de celkweek op een concentratie van 2 ng /ml.}

Celgroei assays

Om IC bepalen _{50 waarden tegen docetaxel (Doc), zowel HSC-60 en 60As6 cellen werden gekweekt in aanwezigheid van 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokyo, Japan) gedurende 4 dagen bij 37 ° C in 5% CO 2 gevolgd door de gebruikelijke MTT assay. Voor het valideren van de combinatiebehandeling met Doc en TGF-β, al 60As6 cellen en 2 primaire kweken (NSC-16C en -22C) werd bereid in een 6-putjes plaat (1 x 10 ^{5 cellen /putje) gevolgd door een behandeling met Doc (2,5 nM) en TGF-β1 (0 of 2 ng /ml) gedurende 72 uur bij 37 ° C in 5% CO 2. Cellen werden gekleurd met trypan blauw en geteld met TC20 geautomatiseerde Cell Counter (Bio-Rad, Hercules, CA).}}

Statistische analyse

Alle gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde ± SE, en geanalyseerd met behulp de ongepaarde t-test. De geaccepteerde niveau van betekenis was p Restaurant < 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) werd gebruikt voor alle statistische analyses.

Resultaten

fenotypische verschillen tussen de ouderlijke HSC-60 cellen en de zeer tumorigene sublijn 60As6 cellen

Om pakken het fenomeen van de diffuse-type-GC verbonden PD vanuit het oogpunt van de moleculaire en cellulaire biologie, hebben we een zeer peritoneale-metastatische cellijn, 60As6, vanuit een diffuse-type GC afgeleide cellijn, HSC-60, door middel van in vivo selecties
bestaande uit een orthotope inoculatie van de tumorcellen en de isolatie van zeer metastatische die uit de ascites van immunodeficiënte muizen [25]. Hoewel de verdubbeling tijd van deze twee cellijnen was vergelijkbaar (30 hr voor HSC-60 en 31 uur voor 60As6) In vitro
, 60As6 cellen gevormd meerdere tumoren sneller na intraperitoneale enting in de muizen. De mediane overlevingstijd was 167 dagen na implantatie van 5 x 10 ^{6 HSC-60-cellen, terwijl de implantatie van hetzelfde aantal 60As6 cellen resulteerde in een opmerkelijke vorming van bloedige ascites en de mediane overlevingstijd was slechts 28 dagen. Verankering-onafhankelijkheid kan nodig zijn voor het overleven van vrije kankercellen in de peritoneale holte en voor kolonisatie. In kolonievorming assay, 60As6 cellen gevormd veel meer kolonies in vergelijking met HSC-60-cellen (S1 afb) waaruit blijkt dat 60As6 beschikt over een hoog vermogen van de verankering-onafhankelijke groei. We gevalideerd de chemoresistance ook bekend als een belangrijke eigenschap van CSCs. De cellen werden gekweekt in de aanwezigheid van docetaxel (Doc), een veel gebruikte anti-kanker geneesmiddel voor de behandeling van patiënten GC. 60As6 toonde een 6-voudige hogere IC _{50 waarde van Doc vergeleken met die van HSC-60 (52 nM en 8,4 nM) (Fig S2). Deze gegevens tonen aan dat een hoge 60As6 chemoresistent fenotype heeft verworven. Bovendien is de morfologie van HSC-60 cellen werd gekarakteriseerd als vlak en groot, terwijl die van 60As6 cellen was halfzwevende en klein, wat lijkt op de morfologie vaak waargenomen voor CSCs (Fig S3). We vervolgens onderzocht lipide rafts lokalisatie middels cholera toxine B subeenheid (CtxB) als een lipide raft marker, aangezien reeds gerapporteerd dat lipide raft clusters werden verrijkt in hematopoietische stamcellen [29]. Een opeenstapeling van de fluorescerende ctxB werd waargenomen voor 60As6 cellen, maar niet in HSC-60, hetgeen duidt op een andere CSC-achtige woning voor de voormalige cellen (S3 figuur).}}

Om de biologische verschillen tussen HSC-60 en 60As6 beoordelen cellen, vergeleken we genexpressie profielen door middel van microarray-analyse (S1 tabel). Down-regulatie van de drie maag pit cel-differentiatie markers ( MUC5AC
, MUC1
en TFF1
) en een aantal cytokeratines werden gevonden in 60As6. Daarentegen enkele stamcel markers ( LY75
, CD44
, GPNMB
en CXCR4
) werden opgereguleerd in deze cellijn. Het expressieprofiel stelt 60As6 een sterke mesenchymale fenotype dat kenmerkend is voor epitheliale cellen afgeleide CSCs.

We verder onderzocht de mRNA expressie van zowel een typische differentiatiemarker MUC5AC
[3 , 4] en een metastase-geassocieerde chemokinereceptor CXCR4
[30] door RT-PCR. In overeenstemming met de microarray resultaten, MUC5AC Kopen en CXCR4
mRNA toonde een elkaar uitsluitende uiting in HSC-60 en 60As6 (figuur 1A). Een chemokine SDF-1 wordt gecodeerd door CXCL12
is bekend CXCR4 en zijn verwante receptor CXCR7 binden [30]; echter het mRNA van de CXCL12 Kopen en CXCR7
werden niet gedetecteerd in beide cellijn. De expressie van zowel MUC5AC en CXCR4 werd bevestigd op eiwitniveau door immunocytochemische kleuring (figuur 1B). Derhalve suggereren deze resultaten dat de HSC-60-cellen herbergen meer gedifferentieerde cellen doen dan de 60As6 cellen, die meestal bestaan ​​uit ongedifferentieerde cellen. Bij elkaar genomen, al deze CSC-achtige kenmerken van 60As6 geven aan dat de ongedifferentieerde subpopulatie met een hoge tumorgeniciteit en drug-resistentie efficiënt uit ouderlijke cellen kunnen worden verrijkt tijdens de In vivo
selecties.

Identificatie en karakterisering van de maag CSCs in 60As6 en primaire gekweekte cellen

We naast onderzocht de rol van CXCR4 in diffuse-type GC cellen voor PD. Zoals getoond in figuur 1A, de receptor CXCR4
werd sterk tot expressie gebracht in 60As6 opzichte van HSC-60, terwijl hun ligand CXCL12 /SDF1
niet beide. Het is echter opmerkelijk dat het ligand bekend is tot expressie in peritoneale mesotheelcellen [31] en om te functioneren als een chemokine naar verre metastase te induceren door een samenspel met CXCR4 tot expressie kankercellen [30]. Daarom onderzochten we of CXCR4 kan dienen als marker voor het identificeren PD-geassocieerde CSC. De expressie van CXCR4 op 60As6 cellen werd geanalyseerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering analyse (FACS). Volgens de CXCR4 expressie en voorwaartse verstrooiing patroon, 60As6 cellen vertoonden een heterogeniteit bestaat uit drie verschillende subpopulaties: I. CXCR4 ^{+ kleine cellen (15%), II. CXCR4 - kleine cellen (65%), en III. CXCR4 - grote cellen (20%) (Fig 1Ci). De cellen werden vervolgens gescheiden elke subpopulatie met een zuiverheid van I: 97%, II: 99% en III: 54%, respectievelijk (Fig 1Cii-1Civ). De lage sortering zuiverheid van de CXCR4 - grote cel subpopulatie III was te danken aan de verontreiniging met geaggregeerde CXCR4 - kleine cellen (Fig 1Civ, black-boxed paneel). Onder deze drie subpopulaties, slechts een CXCR4 - grote cel subpopulatie bevatte MUC5AC + gedifferentieerde cellen (Fig 1Civ, drie buitenpanelen). Door de celgroei controle in een enkele cel niveau, bleek dat CXCR4 - kleine cellen verspreid, terwijl de CXCR4 - grote cellen heeft celdeling ondergaan zelfs 3 dagen na kweek (Fig 1D en S4 Fig). Deze bevindingen suggereren dat CXCR4 - kleine cellen transitionele amplificerende cellen, terwijl de CXCR4 - grote cellen terminaal gedifferentieerde cellen}

Na het sorteren de twee subpopulatie (I en II), we analyseren. elke verschuiving van de celpopulatie (figuur 2A); na 7 dagen van de cultuur. CXCR4 ^{+ kleine cellen die corresponderen met subpopulatie ik gegenereerd zelf, CXCR4 - kleine cellen, en CXCR4 - grote cellen (11%, 62% en 21%, respectievelijk), terwijl CXCR4 - kleine cellen gevonden volgens subpopulatie II konden aanleiding geven voornamelijk zichzelf (80%) met een aantal grote cellen (17%) en zeer weinig CXCR4 + kleine cellen (2%). Deze resultaten suggereren dat CXCR4 + kleine cellen differentiatie potentieel en produceren CXCR4 - grote cellen mogelijk door een stadium van CXCR4 -. Kleine cellen in het stelsel van celdifferentiatie}

Bovendien, een CXCR4 ^{+ kleine eencellige produceerde een kolonie met MUC5AC + gedifferentieerde cellen na 7 dagen in de cultuur (figuur 2B). Deze bevinding werd ondersteund door een cel-afstammingslijn assay combinatie met levende cel kleuring en immunokleuring van MUC5AC (figuur 2C). Bovendien, CXCR4 + kleine cellen werden naar een hoog Lgr5
, die bekend staat als een marker van maag epitheliale stamcellen zich op de klier van normale mucosa [32] (figuur 2D express ).}

Vervolgens hebben we bevestigd de verankering onafhankelijkheid en tumor-initiërende capaciteit van de twee kleine cel subpopulatie (I en II). In de kolonie formatie assay, CXCR4 ^{+ kleine cellen gevormd veel meer kolonies dan heeft de CXCR4 - kleine cellen (Fig 3A). Seriële verdunning experimenten van intraperitoneale inenting in immunodeficiënte muizen bleek dat CXCR4 + kleine cellen bezat ook een hogere tumorigene vermogen (de ontwikkeling van tumoren in 4/5 en 1/5 muizen na inenting van 10 5 en 10 4 cellen, respectievelijk) in vergelijking met CXCR4 - kleine cellen (1/10 en 0/10 muizen na 10 5 en 10 4 cellen, respectievelijk) (Fig 3BI). Met name alle vijf tumordragende muizen na inoculatie van CXCR4 + kleine cellen had meerdere tumoren (figuur 3Bii) en begon bloedige ascites ontwikkelen binnen 3 weken (Fig 3Biii).}

Naast diffuse-type GC cellijnen, onderzochten we ook de rol van CXCR4 in een klinisch monster (NSC-20C): een primaire kweek vastgesteld op basis van de ascites van een diffuse-type GC patiënt met PD. In de RT-PCR en immunokleuring experimenten werd bevestigd dat de primaire kweek te drukken CXCR4
maar niet CXCR7
(figuur 3C). Belangrijk is dat CXCR4 ^{+ kleine cellen gesorteerd van NSC-20C bezat zowel een opnieuw bevolken vermogen (Fig 3Di en 3Dii) en een grote kolonie formatie vermogen (afb 3Diii).}

De betrokkenheid van de CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 as in PD

in zes andere diffuse-type GC afgeleide cellijnen (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, en KATO III), we nader onderzoek gedaan naar de relatie tussen de expressie status van twee CXCL12 /SDF-1 receptoren (CXCR4 en CXCR7) en de ophoping van ascites in muizen geïnoculeerd met de kankercellen intraperitoneaal. De RT-PCR-experimenten bleek dat twee GC cellijnen (HSC-39 en KATO III) sterk tot expressie CXCR4
(figuur 4A). Bovendien, beide xenotransplantatie muizen had meerdere tumoren en geaccumuleerde ascites (figuur 4B). In tegenstelling tot de andere twee cellijnen (HSC-44 en HSC-58) geen of zeer lage expressie CXCR4, een of enkele peritoneale tumor gezwel en niet ascites (figuur 4B) accumuleren. We hebben ook bevestigd dat de ophoping van ascites in een andere zeer peritoneale-uitgezaaide sublijn 58As9 (afgeleid van HSC-58), die CXCR7
op een hoog niveau, maar niet CXCR4
uitgedrukt. Een uitzonderlijk geval werd 44As3 afgeleid van HSC44 die meerdere tumoren en geaccumuleerde ascites hadden zonder de expressie van beide CXCR4 Kopen en CXCR7
. Over het algemeen, vonden we een hoge correlatie tussen de expressie van CXCR4 golfreizen of CXCR7
en de agressieve fenotypes in zeven van de acht cellijnen behalve 44As3.

In de klinische praktijk , peritoneale lavage cytologie (CY) levert belangrijke prognostische informatie over GC-patiënten, omdat het "zaad" van PD vóór de macroscopische manifestatie kan detecteren. Zelfs in de gevallen zonder PD (P0), CY-positieve patiënten hebben een slechte prognose [33], wat suggereert dat nogal wat metastatische CSC in de peritoneale lavage van deze patiënten. Daarom hebben we naast onderzoek gedaan naar de aanwezigheid van CXCR4 ^{+ GC cellen in peritoneale spoelvloeistof van de patiënten zonder dat klinisch zichtbare ascites. CXCR4
mRNA werd zelden waargenomen in het waswater in 9 van de 10 CY-negatieve patiënten; De mRNA werd gedetecteerd in het waswater in 19 van 34 CY-positieve patiënten (Fig S5A). Ook bevestigde de aanwezigheid van de CXCR4 en cytokeratine-positieve dubbele kleine GC cellen op het geplaveide-vormige mesotheelcellen aan de kweekschaal oppervlak in korte termijn (7 dagen) cultuur van ascites van de patiënt (Fig S5B). In onze experimenten, de peritoneale mesotheelcellen meestal verdwenen langetermijnkweek na ongeveer een maand. In een dergelijk lange termijn cultuur, vonden we ook de aanwezigheid van enkele CXCR4 of CXCR7-zeer positief GC cellen die een van de kenmerken van epitheliale-mesenchymale transitie, vimentine (VIM) -positieve (pijlpunt in S5C figuur), maar cytokeratine toonden (PAN )-negatief. Daarom CXCR4 + GC cellen aanwezig in de kwaadaardige ascites niet alleen in het beginstadium van peritoneale verspreiding (P0 /CY +), maar ook meer geleidelijk gekenmerkt door een duidelijke accumulatie ascites. Kortom, de bovenstaande experimenteel en klinisch bewijs suggereert dat een deel van CXCR4 + of CXCR7 + GC cellen een potentieel voor de ontwikkeling van peritoneale metastasen.}

Vervolgens onderzochten we de functionele rol van de CXCR4 signaleringsroute in PD. De expressie van CXCL12
/ SDF-1
van de mens en muis peritoneale mesotheel werd bevestigd door RT-PCR (figuur 5A). Daarom is de betrokkenheid van CXCL12 /SDF-1 voor cellulaire invasie onderzocht. Zoals getoond in figuur 5B, is het aantal invasieve 60As6 cellen drastisch verhoogd SDF-1, wat aangeeft dat deze cellen het vermogen om chemotaxis SDF-1. Lentivirale shRNA-geïnduceerde knockdown van CXCR4 in 60As6 verzwakte SDF-1-bemiddelde invasie maar geen invloed op de tumorvorming gezwel in de peritoneale holte van muizen (niet afgebeeld). Bovendien gedwongen CXCR4 expressie in een ouderlijke cellijn HSC-60 nooit tumorgeniciteit (niet getoond) toe. Samengevat, onze gegevens suggereren dat de CXCR4 betrokken is bij de bevestiging aan het peritoneum, maar niet in de tumorvorming gezwel.

We toonden schematisch processen rechtstreeks PD uit maagwand in geavanceerde GC patiënten via de interactie tussen CXCR4 ^{+ of CXCR7 + CSCs en de SDF-1 tot expressie buikvlies (figuur 5C). Bij de eerste stap van metastase, de CXCR4 + CSCs werden vergoten uit de maagwand in de buikholte. Vervolgens deze cellen hechten aan het basale membraan (BM) van het peritoneum in reactie op de mesothelium afgeleide chemoattractant SDF-1 en koloniseren knobbeltjes te vormen. Deze gebeurtenissen treden op tal van plaatsen via peritoneale oppervlak, waardoor een blokkade van pomp-functie en vervolgens in de accumulatie van ascites.}

TGF-β bevordert celdifferentiatie /asymmetrische celdeling van CXCR4 + maag CSCs

TGF-β is gemeld aan de kant populatie van enkele diffuse type GC cellijnen [34] verminderen. Daarom onderzochten we of TGF-β heeft het potentieel om de kenmerken van CXCR4 ^{+ diffuse type GC cellen wijzigen. Eerst onderzochten we de expressie van TGF-β receptoren in 60As6 cellen en GC primaire kweken afgeleid van twee onafhankelijke patiënten (NSC-16C en -22C). RT-PCR experimenten toonden aan dat beide twee TGF-β receptor genen ( TGFBR1 Kopen en TGFBR2
) uitgedrukt in al deze cellen (Fig S6). We onderzochten ook de lokalisatie van SMAD2 /3, omdat deze transcriptiefactoren gekend zijn accumuleren in kernen in reactie op de activering van TGF-β signalering. Zoals getoond in figuur 6AI, nucleaire accumulatie van SMAD2 /3 werd gedetecteerd in 60As6 cellen na 30 min behandeling met 2 ng /ml TGF-β.}

Vervolgens onderzochten we hoe CXCR4 ^{+ GC cellen beïnvloed door de activering van TGF-β signalering. De RT-PCR-experiment toonde een afname van CXCR4
mRNA in 60As6 door TGF-β behandeling (Fig 6Aii). Flowcytometrie analyses tonen aan dat TGF-β behandeling verminderen CXCR4 + kleine cellen van 6,3% tot 0,4% en CXCR4 verhogen - grote cellen van 17,1% naar 43,2% (figuur 6B). Volgens een toename van terminaal gedifferentieerde cellen, caspase 3/7 in de hele celpopulatie werd geactiveerd door TGF-β behandeling (figuur 6C). Derhalve kan TGF-β een potentieel CXCR4 + CSCs terminaal gedifferentieerde cellen induceren. Verder hebben we het effect van TGF-β on 60As6 latente cellen, omdat CSCs worden verondersteld te bestaan ​​in een slapende toestand onder hypovasculaire aandoening. Na depletie serum gedurende 5 dagen, het CXCR4 + kleine cellen verhoogde tot 42% (figuur 6Di).}

• PLoS ONE: SIRT3 Verbetert glycolyse en proliferatie in-SIRT3 uitdrukken maagkanker Cellen
• PLoS ONE: MicroRNA-137 Draagt ​​bij aan Gedempte tumorvorming bij Human MaagKanker door zich te richten AKT2