PLoS ONE: tunnistaminen ja karakterisointi CXCR4-Positive mahasyövän Stem Cells

tiivistelmä

Diffuusi-tyypin kiinteitä tuumoreita koostuvat usein suuri osa harvoin lisääntyvien (eli lepotilassa) syöpäsolut, voimakkaasti osoittaa osallistumista syövän kantasoluja (CSCS) Vaikka diffuusi-tyypin mahasyövän (GC) potilailla on huono ennuste, koska korkea-usein kehittäminen vatsakalvon levitys (PD), on vähän tietoa, että PD-liittyvä CSCS tehoa ja CSC-kohdistaminen terapiassa diffuusi-tyypin GC. Tässä tutkimuksessa perustimme erittäin metastaattinen GC solulinjoissa in vivo
valinta suunniteltu rikastamista PD liittyvien GC soluihin. Microarray-analyysi, löydettiin CXC-kemokiinireseptori tyypin 4 (CXCR4) voi olla uusi markkeri erittäin metastaattinen CSCS, koska CXCR4-positiivisia soluja voi kasvaa kiinnittämisestä riippumattomasti aloittaa hiirissä, kestettävä sytotoksinen lääke, ja tuottaa eriytetty tytär solut. Kliinisissä näytteissä, nämä CXCR4-positiivisten solujen havaittiin alkaen paitsi myöhään etäpesäkkeiden vaiheessa (kerääntynyt askites), mutta myös aikaisemmin (vatsakalvon pesuja). Lisäksi hoito transformoiva kasvutekijä-β parantaa syövän vastaista vaikutusta dosetakselin indusoimalla solujen erilaistumiseen /epäsymmetrinen solunjakautumisen CXCR4-positiivinen mahalaukun CSCS jopa lepotilassa. Siksi erilaistuminen indusoijia pitää lupauksen saamiseksi mahdollisimman hoitotulokseen päässä olevat syöpälääkkeet kautta kierrätyksen of CSCS.

Citation: Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et ai. (2015) tunnistaminen ja karakterisointi CXCR4-Positive mahasyövän Stem Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10,1371 /journal.pone.0130808

Editor: Masaharu Seno, Okayama University, Japani

vastaanotettu: 18 helmikuu 2015; Hyväksytty: 25 toukokuu 2015; Julkaistu: 25 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja. Kaikki microarray tiedot on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta, GEO; hakunumero GSE53276.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain National Institute of Biomedical Innovation (varten Advanced Research for Medical Products Mining ohjelma ID10-41), terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan (kolmannella Kattava 10-Year strategia syövän ohjaus H22-007), National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (25-A-6, 26-A-3). Drs T Fujita, M Tamaoki ja T Nishimura ovat vastaanottajien Research Resident Fellowship säätiön edistämisen Cancer Research in Japan.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Histopatologisesti GC voidaan jakaa kahteen pääluokkaan: suoliston-tyypin ja hajanainen-tyyppiä. Suoliston-tyyppinen GC vallitseva korkean riskin maantieteellisillä alueilla ja kehittyy läpi vaiheittain kuten Helicobacter pylori
( H
. pylori
) -associated atrofinen gastriitti, suoliston metaplasiaa (IM), ja dysplasia. Sen sijaan hajanainen-tyyppinen GC, jonka osuus on puolet kaikista GC potilaita, on laaja maantieteellinen jakauma ja kehittää jopa H
. pylori
vapaa, morfologisesti normaali mahan limakalvon ilman atrofinen gastriitti tai IM, ja diffuusi-tyypin GC saattaa poiketa suolen-tyypin sekä geneettisesti ja fenotyypiltään [1-5]. Toisin kuin yleisyyden suolen-tyyppi, esiintyvyys hajanainen-tyyppinen on tiettävästi kasvaa maailmanlaajuisesti [6]. Ennuste kokeneille hajanainen-tyyppinen GC potilaista pysyi huonona viime vuosikymmenen aikana, koska on korkea vatsakalvon levitys (PD) (78%) verrattuna suoliston-tyyppi (45%) [7]. Erityisesti potilaat, joilla Bormann tyypin IV GC on erittäin huono ennuste, vaikka he saivat monialaista hoitoa [8]. Siksi käsitellään PD on kiireellinen asia parantamisen ennustetta diffuusi-tyyppinen GC potilailla.

Diffuusi-tyyppi GC tyypillisesti ominaista laaja strooman fibroosia huono verisuonitus ja harvinainen proliferatiivinen ( i
. e
. lepääviä) syöpäsoluja, mikä johtaa huomattavaan terapeuttinen vastus. Näkökulmasta kemoterapiaa, transformoiva kasvutekijä β (TGF-β) on ajateltu edistää aggressiivinen progressiota epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja indusoimalla fibroosi [9]. Kuitenkin, TGF-β estää myös soluproliferaatiota, indusoi apoptoosia, ja välittää erilaistumisen epiteelisoluissa, mikä viittaa siihen, että osat TGF-β signalointireittien on kasvain-suppressiivinen aktiivisuus epiteelikasvaimissa [10, 11]. Vaikka saatu todisteita on osoittanut kriittinen rooli TGF-β syövän kantasolujen (CSC) biologia, on vähän tietoa sen roolista diffuusi-tyypin GC.

On raportoitu, että kunkin populaation syöpäsolujen funktionaalisia heterogeenisyys ominaista selvä lisääntyminen ja erilaistuminen kapasiteettia monentyyppisiä kasvaimia [12]. Jotta voidaan ottaa huomioon tällaisten kasvainten heterogeenisyys, kaksi mallia on ehdotettu: klonaalisen evoluutiomalli [13] ja CSC malli [14]. Jälkimmäinen malli on saanut laajaa huomiota, koska se tarjoaa järkevä selitys vastustuskykyä perinteisille kemo- ja sädehoidon, jossa lepotilassa tai hitaasti pyöräily CSCS hengissä, ja tulokset lopulta kasvain uusiutumisen [15-17]. Siksi terapeuttiset strategiat kohdistaa CSCS ovat välttämättömiä hävittää jäljellä taudin ja toistumisen estämiseksi paitsi GC vaan myös muihin syöpiin. Lisäksi nykyisen oivalluksia solun mekanismeja syövän, metastaattisen potentiaalin kasvainsolujen johtuu CSCS, joka voi kloonaamalla aloittaa kasvaimen muodostumisen kaukaisiin kohtiin [18 19]. Vaikka useita solunpintamolekyylien on ehdotettu CSC merkkiaineiden monenlaisia ​​ihmisen maligniteettien, ei ole merkki tunnistamista varten PD-liittyvän CSCS in GC [20-23]. Tunnistamaan tällaiset markkereita, pidimme käsitystä, että toiminnallisesti ja geneettisesti heterogeeninen kasvaimet ovat yhteisiä ja luontainen mekanismien kasvaimen huolto kontekstin mukaan tietyn mikroympäristön. Niinpä me arveltu, että CSCS olisi määriteltävä toiminnallisesti by validoitu hyvin määrityksiä kuten in vivo
elinsiirrot. Vuonna hajanainen-tyyppinen GC, me aluksi keskittyi vatsakalvon-erityinen asuttaminen solujen ja rikastettu PD-liittyvä CSCS toistuvista in vivo
valinnat [24, 25]. Tässä olemme huomanneet, CXC-kemokiinireseptori tyypin 4 (CXCR4) voi olla markkeri PD-liittyvän maha- CSCS ja osoittaneet, että TGF-β parantaa tehoa kasvaimen vastaisen lääkkeiden indusoimalla solujen erilaistumiseen /epäsymmetrinen solunjakautumisen CXCR4 ^{+ CSC väestö jopa lepotilassa.}

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Kliiniset näytteet saatiin National Cancer Center Hospital (Tokio, Japani) saatuaan kirjallinen suostumus jokaisesta potilaasta ja hyväksyntä National Cancer Center Institutional Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

Solulinjat ja primaariviljelmiä

ihmisen GC solulinja, HSC-60 perustettiin yhteiskäyttäjä menettelyä käyttäen kuten aiemmin on kuvattu [26]. Erittäin vatsakalvon etäpesäkkeitä solulinja, 60As6 perustettiin peräisin HSC-60 käyttäen potilaalle tehdä kudosta istutettaviksi SCID /SCID-hiirten lyhyesti seuraavat: ksenosiirrettyjä kasvain HSC-60-solujen istutetaan mahalaukun seinämän hiiren. Me toistetaan kuusi jaksoa korjuun vesivatsanesteet kasvainsolujen ja potilaalle tehdä rokotus näiden solujen. Nämä kaksi solulinjoja pidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia. Olemme myös perustaneet kaksi lusiferaasia ilmentämissolulinjat (HSC-60Luc ja 60As6Luc). Kuusi muuta GC solulinjat (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, ja KATO III) myös pidettiin samoissa olosuhteissa. Näiden kuuden, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, ja 58As9 määritettiin edellä esitetyllä menetelmällä [27, 28], ja KATO III saatiin American Type Culture Collection. Primääriviljelystä, solut kerättiin potilaiden vatsakalvon pesut ja askites (NSC-16C, NSC-20C, ja NSC-22C), ja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia.

mikrosiruanalyysi

Yhteensä RNA 60As6, 60As6Luc, HSC-60, ja HSC-60Luc solut eristettiin suspendoimalla solut käytettäessä ISOGEN lyysipuskuria (Nippon Gene, Toyama, Japani) ja sen jälkeen isopropanolisaostuksella. Teimme microarray analyyseja kahdesti käyttämällä Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Menettelyt tehtiin mukaan toimittajien protokollia. Taulukot skannattiin kanssa GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix), ja tiedot analysoitiin Microarray Suite 5.0 kanssa Affymetrix maksuhäiriöanalyysin asetukset ja globaali skaalausta normalisoinnin menetelmää. Leikattu keskiarvo tavoitetehosta kunkin array mielivaltaisesti asetettu 1000. Kaikki microarray tiedot on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta, GEO; hakunumero GSE53276. Jonka 2-kertainen muutos, 684 geenit valittiin erityisiä geenejä 60As6 ja 60As6Luc soluja, ja 1150-geenit valitaan HSC-60 ja HSC-60Luc soluissa.

Eläinkokeet

Kuusi -week-vuotias nainen C.B17 /Icr-SCID (SCID /SCID) hiiriä (CLEA Japani, Japani) oli kasvatettu huoneenlämmössä, jossa on 12 tunnin valo /pimeä päivittäin sykli. Hiiriä pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa ja edellyttäen steriiliä ruokaa, vettä ja häkkejä. 1 x 10 ^{4-1 x 10 6 syövän solut suspendoitiin 1 ml: lla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), ja sitten injektoitiin vatsaonteloon käyttämällä 26 1/2 gaugen neula. Hiiret punnittiin ja mitattiin viikoittain. Humane päätepiste kriteereinä olivat merkittävästi kertyminen vatsan askites, hengenahdistus, piloerektio, anemia, tai laihtuminen yli 10% alkuperäisestä painosta. Kaikki kokeet suoritettiin noudattaen eettisten ohjeiden International Association for Study of Pain ja hyväksyttiin komitean Ethics eläinkokeissa National Cancer Center. Pyrittiin minimoimaan numerot ja kärsimystä käytettyjen eläinten kokeissa.}

RT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin suspendoimalla solut käytettäessä ISOGEN lyysipuskuria seurasi isopropanolisaostus-. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR toteutetaan lineaarisella alueella 25 30 jaksoa varten MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, LGR5
, TGFBR1
, TGFBR2
, ja ACTB
käyttäen seuraavia alukkeita: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'ja 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 "varten MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 'ja 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3' varten CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3 'ja 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3' varten CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'ja 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' varten CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'ja 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' varten LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'ja 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' varten TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'ja 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' varten TGFBR2
, ja 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'ja 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' varten ACTB
.

immunosytokemia

Epäsuora loisteputki immunosytokemiassa suoritettiin CXCR4, MUC5AC, ja Smad2 /3-soluissa kasvatettu 4-kaivokammio dioja. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi huoneenlämmössä 20 minuutin ajan. Kun kolme kertaa pesun PBS (-), niitä inkuboitiin anti-ihmis-CXCR4 monoklonaalinen vasta-aine (R &D Systems, Minneapolis, MN), anti-ihmisen MUC5AC-vasta-ainetta (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz, CA) tai anti- ihmisen Smad2 /3-vasta-ainetta (BD Biosciences, Bedford, MA), jota seurasi inkubointi 1: 1000 laimennos aasin anti-hiiri-Alexa 488-konjugoidun seerumia (Invitrogen, Grand Island, NY) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Solutumat värjättiin 4 ', 6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Solujen-linjaa määrityksessä, lajitellaan yksi CXCR4 ^{+ pieniä soluja värjättiin CellTracker Green (Invitrogen) jäljittämisessä eläviä soluja.}

Virtaussytometria ja solujen lajittelu

60As6 soluja (1 x 10 ^{6 solua) co-inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa seuraavilla vasta-aineilla: APC anti-ihmis-CD184 (CXCR4) (IgG2a, klooni 12G5) tai APC hiiren IgG2a, k isotyyppikontrollit saatu BioLegend ( San Diego, CA). Kuolleet solut leimattiin propidiumjodidilla ja jätettiin pois analyysistä. Soluun lajittelu, CXCR4-positiivisten ja CXCR4-negatiivisia osapopulaatioiden puhdistettiin käyttämällä JSAN solulajittelijaa (Bay Bioscience, Kobe, Japani), ja analysoitiin ohjelmisto, FlowJo (Puu Star, Inc., Ashland, OR). Solusyklin analyysit, solut siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen ja 5 päivää, ja tämän jälkeen korjattu 0,05% trypsiini-EDTA: ta, ja suspendoitiin sitten kylmään 80% etanolia. Kiinnityksen jälkeen yli yön -20 ° C: ssa, näytteet pestiin PBS (-) ja inkuboitiin 500 ui PI /RNaasi Värjäys Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA) per 1 x 10 6 solua 30 min huoneenlämpöiseksi ennen analyysiä. Virtaussytometria suoritettiin käyttäen FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), ja analysoitiin ohjelmisto, FlowJo.}

Anchorage riippumattoman solujen kasvun määrityksessä

pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin käyttäen CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) seuraten valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 5 x 10 ^{3 CXCR4-positiivisia tai CXCR4-negatiivinen pieni solut suspendoitiin DMEM, joka sisälsi 0,4% matalassa lämpötilassa sulavaa agaroosia ja 10% FBS: ää, ja ympättiin 1% alhaisen sulamispisteen agaroosia, joka sisälsi DMEM ja 10% FBS: ää. Sen jälkeen, kun soluja on inkuboitu 5 päivää 37 ° C: ssa, 5% CO _{2, solut lyysattiin ja havaittiin CyQuant GR väriainetta. Fluoresenssin pesäkkeitä muodostavien solujen luettiin Monitoiminen Microplate Reader (Safire, Tecan, Mannedorf, Swizerland) virityksellä /emissio aallonpituuksien 485/520 nm.}}

invaasiomääritys

Cell invaasio määritettiin käyttäen BD BioCoat Kasvain Invasion -määrityssysteemiä (BD Biosciences) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 4 x 10 ^{5 60As6 solujen seerumittomassa alustassa ympättiin saliin järjestelmän. Pohja kuopat täytettiin median kanssa 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). 24 tunnin kuluttua inkubaation solut ylemmässä kammiossa poistettiin ja solut, jotka hyökkäsi läpi matrigeelin kalvon värjättiin Diff-Quick tahra (BD Biosciences) ja laskettiin käsin.}

Caspase määritys

Euroopan 60As6 solut valmistettiin 96-kuoppaisen levyn (5 x 10 ^{3 solua /kuoppa). Kaspaasi 3/7 määritys suoritettiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI), 24 tuntia sen jälkeen, kun on lisätty yhdistelmä-TGF-β1 (240-B, R &D Systems) osaksi soluviljelmään pitoisuutena 2 ng /ml.}

Cell kasvun määritykset

määrittämiseksi IC _{50-arvot vastaan ​​doketakseli (Doc), sekä HSC-60 ja 60As6 soluja viljeltiin, kun läsnä oli 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokio, Japani) 4 vuorokautta 37 ° C: ssa 5% CO 2 seuraa tavanomaista MTT-määrityksellä. Validointi yhdistelmä hoidon Doc ja TGF-β, kaikki 60As6 solujen ja 2 primaariviljelmissä (NSC-16C ja -22 ° C) valmistettiin 6-kuoppalevyn (1 x 10 ^{5 solua /kuoppa) ja sen jälkeen käsittelemällä Doc (2,5 nM) ja TGF-β1 (0 tai 2 ng /ml) 72 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO 2. Solut värjättiin trypaanisinisellä ja laskettiin TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, Hercules, CA).}}

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SE, ja analysoitiin käyttäen paritonta t-testiä. Hyväksytty merkitsevyystaso oli p
< 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) käytettiin kaikkiin tilastollisia analyysejä.

Tulokset

Fenotyyppiset erot vanhempien HSC-60-solujen ja erittäin tuumorigeenisiä alalinja 60As6 solujen

käsiteltävä ilmiö diffuusi-tyyppinen GC-liittyvä PD näkökulmasta molekyyli- ja solubiologian, loimme erittäin vatsakalvon etäpesäkkeitä solulinja, 60As6, mistä diffuusi-tyyppinen GC peräisin oleva solulinja, HSC-60, kautta in vivo
valikoima koostuu ortotooppisten inokulaation kasvainsolujen ja eristäminen erittäin metastaattinen niistä peräisin askites immunopuutoksesta hiirissä [25]. Vaikka kahdentumisaika näiden kahden solulinjan oli verrattavissa (30 hr HSC-60 ja 31 tuntia ja 60As6) in vitro
, 60As6 solut muodostivat useita kasvaimen kyhmyjä nopeammin intraperitoneaalisen injektion jälkeen inokulaation hiiriin. Keskimääräinen elinaika oli 167 päivää kiinnittymisen jälkeen 5 x 10 ^{6 HSC-60-solujen, kun taas istuttaminen sama määrä 60As6 solujen johti merkittävä muodostumiseen verinen vatsaonteloon sekä mediaani elinaika oli vain 28 päivää. Anchorage-riippumattomuus voidaan tarvita selviytymisen vapaan syöpäsolujen vatsaonteloon ja Kolonisaatiopotentiaalin. Pesäkkeitä muodostumista määrityksessä, 60As6 solut muodostivat paljon enemmän pesäkkeitä kuin HSC-60-solujen (S1 kuviossa), jotka osoittavat, että 60As6 hallussaan suuri kyky kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Olemme validoitu chemoresistance tunnetaan myös tärkeä ominaisuus CSCS. Soluja viljeltiin, kun läsnä on dosetakselin (Doc), joka on usein käytetty syöpälääke hoitoon GC potilailla. 60As6 oli 6 kertaa suurempi IC _{50 arvo Doc verrattuna HSC-60 (52 nM ja 8,4 nM) (S2 Kuva). Nämä tiedot osoittavat, että 60As6 on saavuttanut korkean solunsalpaajaresistentti fenotyypin. Lisäksi morfologia HSC-60-solujen karakterisoitiin tasainen ja suuri, kun taas on 60As6 solut oli puoliksi kelluva ja pieni, joka on samanlainen morfologia usein havaittu CSCS (S3 kuvassa). Olemme ensi tutkinut Lipidilauttojen lokalisoinnin avulla koleratoksiinin B-alayksikkö (cfxB) kuin lipidilautan merkki, koska se on jo raportoitu, että lipidilautan klustereita rikastuneet Veren kantasolut [29]. Kertymistä loisteputki cfxB havaittiin 60As6 soluissa, mutta ei HSC-60, mikä viittaa toinen CSC kaltainen ominaisuus entisen soluja (S3 kuvassa).}}

arvioimiseksi biologisen eroja HSC-60 ja 60As6 solut, vertasimme geeniekspressioprofiilien mukaan mikrosiruanalyysillä (S1 taulukko). Down-regulation kolmen mahalaukun pit solun erilaistumisen markkereita ( MUC5AC
, MUC1
, ja TFF1
) ja jotkut sytokeratiineja löydettiin 60As6. Sen sijaan useat kantasolujen merkkiaineita ( LY75
, CD44
, GPNMB
, ja CXCR4
) on yliaktiivista tässä solulinjassa. Ilmaisu viittaa siihen, että 60As6 on vahva mesenkymaalisten fenotyyppi, joka on ominaista epiteelisoluperäisen CSCS.

lisäksi tutkittiin mRNA: n ilmentymisen sekä tyypillisen differentiaatiomarkkeri MUC5AC
[3 , 4] ja metastaasin liittyvän kemokiinireseptorin CXCR4
[30] RT-PCR: llä. Mukaisesti microarray tuloksiin, MUC5AC
ja CXCR4
mRNA: t osoittivat toisiaan pois ilmaisun HSC-60 ja 60As6 (kuvio 1A). Kemokiini, SDF-1, jota koodaa CXCL12
tiedetään sitoutuvan CXCR4 ja sen vastaavan reseptorin CXCR7 [30]; kuitenkin, mRNA: n CXCL12
ja CXCR7
ei havaittu kummassakaan solulinjassa. Ilmaisu Sekä MUC5AC ja CXCR4 myös vahvistettiin proteiinin tasolla immunosytokemiallisella värjäytymistä (kuvio 1 B). Täten nämä tulokset viittaavat siihen, että HSC-60-solujen satama enemmän erilaistuneita soluja kuin tehdä 60As6 soluja, jotka ovat enimmäkseen koostuvat eriytymättömiä soluja. Yhdessä kaikki nämä CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia 60As6 osoittavat, että erilaistumattoman alapopulaatio suurella tuumorigeenisyyteen ja lääkeresistenssideterminantit voitaisiin tehokkaasti rikastaa vanhempien soluista aikana in vivo
valintoja.

tunnistaminen ja luonnehdinta mahalaukun CSCS vuonna 60As6 ja ensisijainen viljeltyjä soluja

vieressä tutki roolia CXCR4 heikossa-tyyppinen GC solujen PD. Kuten on esitetty kuviossa 1A, reseptorin CXCR4
oli hyvin ilmaistu 60As6 verrattuna HSC-60, kun taas niiden ligandin CXCL12 /SDF1
ei ollut molemmissa. On kuitenkin huomattava, että tämä ligandi tiedetään ilmaistaan ​​vatsakalvon mesoteelisolujen [31] ja toimimaan kemokiini aiheuttaa etäpesäkkeiden kautta vuorovaikutusta CXCR4-ilmentävien syöpäsolujen [30]. Siksi me tutki CXCR4 voisi toimia markkerina tunnistamiseksi PD-liittyvä CSCS. Ilmaisu CXCR4 60As6 solut analysoitiin fluoresenssilla aktivoidun solun lajittelua (FACS). Mukaan CXCR4 ilmaisun ja eteenpäin sironnan malli, 60As6 solut osoitti heterogeenisuus koostuu kolmesta eri eläinryhmät: I. CXCR4 ^{+ pieniä soluja (15%), II. CXCR4 - pieniä soluja (65%), ja III. CXCR4 - suuria soluja (20%) (kuvio 1Ci). Sitten solut erotettiin, jolloin kustakin alaryhmästä, jonka puhtaus oli I: 97%, II: 99%, ja III: 54%, vastaavasti (kuvio 1Cii-1Civ). Alhainen lajittelu puhtaus CXCR4 - suuri solu subpopulaatio III johtui saastuminen aggregoidut CXCR4 - pieniä soluja (kuvio 1Civ, musta-boxed paneeli). Näistä kolmesta alapopulaatioiden vain CXCR4 - suuri solu subpopulaatio sisälsi MUC5AC + erilaistuneita soluja (kuvio 1Civ, kolme ulkopaneelit). Solujen kasvun seuranta yhdessä solutasolla, todettiin, että CXCR4 - pienet solut lisääntyivät, kun taas CXCR4 - suuria soluja ei tapahtunut solunjakautumisen vielä 3 vuorokauden kuluttua kulttuuri (kuvio 1D ja S4 kuvassa). Nämä havainnot viittaavat siihen, että CXCR4 - pienet solut ovat ohimeneviä vahvistavia soluja, kun taas CXCR4 - suuret solut terminaalisesti erilaistuneita soluja.}

Lajittelun jälkeen kahdesta alaryhmästä (I ja II), analysoimme mikä tahansa muutos solupopulaation (kuvio 2A); 7 päivän viljelyn. CXCR4 ^{+ pieniä soluja vastaten alaryhmästä I syntyy itse, CXCR4 - pieniä soluja, ja CXCR4 - suuria soluja (11%, 62%, ja 21%, tässä järjestyksessä), kun taas CXCR4 - pienissä soluissa vastaten alaryhmästä II pystyivät aiheuttaa pääasiassa itse (80%) noin suuria soluja (17%) ja hyvin harvat CXCR4 + pieniä soluja (2%). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CXCR4 + pieniä soluja on erilaistumista potentiaalia ja tuottaa CXCR4 - suuria soluja mahdollisesti vaihe CXCR4 - pieniä soluja järjestelmässä solujen erilaistumisen.}

Lisäksi CXCR4- ^{+ pieni yksittäinen solu tuotti sisältävän pesäkkeen MUC5AC + erilaistuneet solut 7 päivän jälkeen viljelmässä (kuvio 2B). Tämä havainto tukivat solu-linjaa määrityksessä yhdistettynä elävien solujen värjäytymisen ja immunovärjäyksen MUC5AC (kuvio 2C). Lisäksi, CXCR4 + pieniä soluja osoitettiin ilmentävän korkean tason LGR5
, joka tunnetaan merkkinä mahalaukun epiteeli- kantasoluja sijaitsee rauhanen normaalin limakalvon [32] (kuvio 2D ).}

Seuraavaksi validoitu ankkurointi itsenäisyyden ja kasvaimen aloittamista kyky kaksi pientä solu alaryhmässä (I ja II). Vuonna pesäkemuodostusta, CXCR4 ^{+ pieniä soluja muodostuu paljon enemmän pesäkkeitä kuin ei CXCR4 - pieniä soluja (kuvio 3A). Sarjalaimennokselle kokeita intraperitoneaalisen inokulaation immuunivajaissa hiirillä että CXCR4 + pieniä soluja myös hallussaan korkeampi tuumorigeenistä kyky (kasvainten kehittymistä 4/5 ja 1/5 hiiriin inokulointi 10 5 ja 10 4 solut, vastaavasti) verrattuna CXCR4 - pieniä soluja (1/10 ja 0/10 hiiristä 10 5 ja 10 4 solut, vastaavasti) (kuvio 3Bi). Erityisesti kaikki viisi kasvainta kantavien hiirten siirrostuksen jälkeen CXCR4 + pieniä soluja oli useita kasvain kyhmyt (kuvio 3Bii), ja alkoi kehittää verinen askites 3 viikon kuluessa (kuvio 3Biii).}

Lisäksi diffuusi-tyyppinen GC solulinjoja, tutkimme myös roolia CXCR4 kliinisessä näytteessä (NSC-20C): ensisijainen kulttuuri muodostaa myös askites on hajanainen-tyyppinen GC potilaan kanssa PD. RT-PCR ja immunovärjäys kokeissa todettiin, että primääriviljelmässä näihin CXCR4
, mutta ei CXCR7
(kuvio 3C). Tärkeää on, CXCR4 ^{+ pieniä soluja lajiteltiin NSC-20C hallussaan sekä repopuloiva kyky (kuvio 3Di ja 3Dii) ja korkea pesäkkeenmuodostusta kyky (Kuva 3Diii).}

osallistuminen CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 akseli PD

kuudessa muut hajanainen-tyyppinen GC solulinjat (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, ja KATO III), me tutki tarkemmin suhdetta ilmentymistilanne kahden CXCL12 /SDF-1-reseptorit (CXCR4 ja CXCR7) ja kertymistä askitesta hiirissä ympätty syöpäsoluja vatsaonteloon. RT-PCR-kokeet osoittivat, että kaksi GC solulinjat (HSC-39 ja KATO III) ilmentyy voimakkaasti CXCR4
(kuvio 4A). Lisäksi molemmat ksenosiirrettyjä hiirillä oli useita kasvaimen kyhmyjä ja kertynyt askites (kuvio 4B). Sen sijaan kaksi muuta solulinjat (HSC-44 ja HSC-58) ei osoittanut mitään tai melko alhainen CXCR4 ilmaisu, yhtä tai muutamaa vatsakalvon kasvaimen kyhmy ja ei kertynyt askites (kuvio 4B). Olemme myös vahvistaneet kertyminen askitesta toisessa erittäin vatsakalvon-metastaattinen alalinja 58As9 (peräisin HSC-58), joka ilmaistaan ​​ CXCR7
korkealla tasolla, mutta ei CXCR4
. Yksi poikkeuksellinen tapaus 44As3 peräisin HSC44 että oli useita kasvain kyhmyjä ja kertynyt askites ilman ilmentymistä sekä CXCR4
ja CXCR7
. Kaiken kaikkiaan löysimme suuren korrelaation ekspressiotason CXCR4
tai CXCR7
ja aggressiivinen fenotyyppien seitsemässä kahdeksasta solulinjojen paitsi 44As3.

Kliinisessä , vatsakalvon huuhtelu sytologia (CY) tarjoaa tärkeitä varoituksia syntymässä olevista GC potilaille, koska se voi havaita "siemen" PD ennen sen makroskooppinen ilmentymä. Jopa tapauksissa, joissa ei ole PD (P0), CY-positiivisten potilaiden huonoon ennusteeseen [33], mikä viittaa siihen, että monet metastaattinen CSCS ovat läsnä vatsakalvon huuhtelu näiden potilaiden. Siksi tutkimme seuraavaksi läsnä CXCR4 ^{+ GC solujen vatsakalvon pesuissa potilailta, eikä kliinisesti havaittavia askitesta. CXCR4
mRNA havaitaan harvoin pesuvesi 9 10 CY-negatiivisten potilaiden; kuitenkin, mRNA havaittiin pesuvesi 19 34 CY-positiivisilla potilailla (S5a kuvio). Olemme myös vahvisti läsnäolo CXCR4 ja sytokeratiini kaksinkertainen positiivinen pieni GC solujen cobblestone muotoisen mesoteelisolujen kiinnitetty kulttuuriin lautasen pinnan lyhyen aikavälin (7 päivää) kulttuurin potilaan askites (S5B kuvio). Meidän kokeissa vatsakalvon mesoteelisolujen yleensä katosi pitkäaikaiseen viljelyyn jälkeen noin kuukauden. Tällaisissa pitkän aikavälin kulttuuri, löysimme myös läsnä noin CXCR4- tai CXCR7-erittäin positiivisia GC soluja, jotka osoittivat ominaisuudet epiteelin-mesenkymaalitransitioon, vimentiinistä (VIM) -positiivinen (nuoli pään S5c kuvassa), mutta sytokeratiini (PAN ) -negatiivinen. Siksi CXCR4 + GC solut ovat läsnä pahanlaatuiset vesivatsat paitsi alkuvaiheessa vatsakalvon levittämistä (P0 /CY +), mutta myös lisää asteittain ominaista avoin askites kertymistä. Kaiken edellä kokeellista ja kliinistä näyttöä siitä, että osa CXCR4 + tai CXCR7 + GC soluilla on mahdollisuuksia kehittää vatsakalvon etäpesäkkeitä.}

vieressä tutkineet toiminnallista roolia CXCR4 signalointireitin PD. Ilmaisu on CXCL12 Twitter / SDF-1
ihmisen ja hiiren vatsakalvon Mesothelium varmistettiin RT-PCR: llä (kuvio 5A). Siksi osallistuminen CXCL12 /SDF-1 solujen invaasiota tutkittiin. Kuten kuviossa 5B, määrä invasiivisen 60As6 solujen voimakkaasti kasvanut SDF-1, mikä osoittaa, että nämä solut ovat kemotaksista kyky SDF-1. Lentiviruksen shRNA aiheuttama pudotus ja CXCR4 60As6 heikennettyjä SDF-1-välitteisen invaasio, mutta ei vaikuttanut kasvaimen kyhmy muodostumista vatsaonteloon hiirten (ei esitetty). Lisäksi, pakko CXCR4 ilmentymistä emosolulinjassa HSC-60 ei koskaan lisäsi tuumorigeenisyyden (ei esitetty). Yhdessä meidän tietojen mukaan CXCR4 on mukana liitetiedoston vatsakalvon mutta ei kasvain kyhmy muodostumista.

Osoitimme kaavamaisesti prosesseja suoraan PD mahalaukun seinämän kehittyneissä GC potilaita vuorovaikutusta CXCR4 ^{+ tai CXCR7 + CSCS ja SDF-1 ilmentävien vatsakalvon (kuvio 5C). Ensimmäisessä vaiheessa etäpesäke, CXCR4 + CSCS vuodatettiin pois mahalaukun seinämän vatsaonteloon. Sen jälkeen, nämä solut kiinnittyvät tyvikalvon (BM), vatsakalvon vastauksena mesothelium johdettuja kemoattraktantti SDF-1 ja asuttaa muodostamiseksi kyhmyjä. Nämä tapahtumat tapahtuvat useita sivustoja yli vatsakalvon pintaan, jolloin saarto pump-toiminto ja sitten kertyminen askites.}

TGF-β edistää solujen erilaistumiseen /epäsymmetrinen solunjakautumisen CXCR4 + mahalaukun CSCS

TGF-β on raportoitu vähentää puolella asuu noin diffuusi-tyypin GC solulinjat [34]. Siksi tutkimme onko TGF-β on potentiaalia muuttaa ominaisuuksia CXCR4 ^{+ hajanainen-tyyppinen GC soluissa. Ensin tutkittiin ekspressiotasoja TGF-β-reseptoreihin 60As6 soluissa ja GC johdettuja primäärisiä viljelmiä kaksi riippumatonta potilaista (NSC-16C ja -22 ° C). RT-PCR-kokeet osoittivat, että molemmat kaksi TGF-β-reseptorin geenien ( TGFBR1
ja TGFBR2
) ilmaistuna kaikki nämä solut (S6 kuvio). Tutkimme myös lokalisoinnin Smad2 /3, koska nämä transkriptiotekijät ovat laajalti tiedetään kerääntyvän tumien vasteena TGF-β-signalointia. Kuten kuviossa 6Ai, ydin- kertyminen Smad2 /3 havaittiin 60As6 soluissa sen jälkeen, kun 30 min käsittely 2 ng /ml TGF-β.}

tutkimme seuraavaksi, kuinka CXCR4 ^{+ GC solut ovat vaikuttaa TGF-β-signalointia. RT-PCR-koe osoitti laskua CXCR4
mRNA 60As6 TGF-β käsittely (Kuva 6Aii). Virtaussytometria analyysit paljastavat, että TGF-β hoito vähentää CXCR4 + pieniä soluja 6,3%: sta 0,4% ja lisätä CXCR4 - suuri solujen 17,1%: sta 43,2% (kuvio 6B). Mukaisesti kasvua terminaalisesti erilaistuneita soluja, kaspaasi 3/7 koko solupopulaation aktivoitiin TGF-β jälkeen (kuvio 6C). Siksi TGF-β voi olla potentiaalia aiheuttaa CXCR4 + CSCS on terminaalisesti erilaistuneita soluja. Tutkimme lisäksi vaikutusta TGF-β on lepotilassa 60As6 soluissa, koska CSCS ajatellaan olemassa lepotilassa alle hypovascular kunnossa. Sen jälkeen seerumin ehtyminen 5 päivää, CXCR4 + pieniä soluja kasvoi jopa 42% (kuvio 6Di). Lisäksi huomattava osa 60As6 väestöstä oli G1 vaiheessa (kuvio 6Dii).}

• PLoS ONE: SIRT3 Parantaa Glykolyysi ja proliferaation SIRT3 ilmentävien mahasyövän Cells
• PLoS ONE: MicroRNA-137 Auttaa Värinävaimennettu tuumorigeneesiä Human Mahalaukun Cancer by Targeting AKT2