PLoS ONE: Идентификация и характеристика CXCR4-желудочной рака Стволовые Cells

Абстрактный
<р> диффузного типа солидных опухолей часто состоят из высокой долей редко пролиферирующих (то есть, в состоянии покоя) раковых клеток, что указывает на сильно вовлечение раковых стволовых клеток (ЦОК) Хотя диффузного типа рака желудка (GC) пациенты имеют плохой прогноз из-за высокой частое развитие перитонеального распространения (PD), это ограниченное знание, что PD-ассоциированной ЦОК и эффективности CSC- нацеливание терапии в диффузного типа GC. В данном исследовании мы установили высоко метастатических линии GC клеток с помощью в естественных условиях
выбора, предназначенный для обогащения PD-ассоциированных GC клеток. В результате анализа микрочипов, мы нашли СХС тип рецептора хемокина 4 (CXCR4) может быть новым маркером для сильно метастатических ЦОК, так как CXCR4-позитивные клетки могут расти анкеровки-независимо друг от друга, инициировать опухоли у мышей, быть стойкими к цитотоксическое лекарственное средство, и производить дифференцированную дочь клетки. В клинических образцах эти CXCR4-положительные клетки были обнаружены не только из поздней стадии метастазирования (накопленная асцит), но и более ранней стадии (перитонеальные стирок). Кроме того, лечение с трансформирующий фактор роста-бета усиливает противораковое действие доцетаксела посредством индукции дифференцировки клеток /асимметричного деления клеток из CXCR4-желудочной ЦОК даже в неактивном состоянии. Таким образом, дифференциация индукторы перспективны для получения максимального терапевтического эффекта от имеющихся в настоящее время противораковых препаратов через сайклинг-ЦОНов
<р> Образец цитирования:. Фуджита T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Аояги K, Yanagihara K, Нисимура Т, и др. (2015) Идентификация и характеристика CXCR4-позитивных рака желудка стволовых клеток. PLoS ONE 10 (6): e0130808. DOI: 10.1371 /journal.pone.0130808
<р> Редактор: Масахару Сено, Окаяма университет, JAPAN
<р> Поступило: 18 февраля 2015; Принято: 25 мая 2015 года; Опубликовано: 25 июня 2015
<р> Copyright: © 2015 Фуджита и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в его сопутствующую информацию, файлы и бумаги. Все данные микрочипов были сданы на хранение в базе данных MIAME совместимой, GEO; инвентарный номер GSE53276
<р> Финансирование:. Эта работа была частично поддержана Национальным институтом биомедицинских инноваций (для передовых исследований для изделий медицинского назначения Mining Программа ID10-41), Министерства здравоохранения, труда и благосостояния Японии (для третьей всеобъемлющей 10-летней стратегии для борьбы с раком H22-007), Национального научно-исследовательского фонда Cancer Center (25-а-6, 26-A-3). Д-ра Т Фуджита, М Tamaoki и Т Нисимура являются получателями стипендий Resident Research из Фонда содействия исследований рака в Японии
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является одной из ведущих причин смертности от онкологических заболеваний во всем мире. Гистопатологически, ГКС могут быть разделены на две основные категории: кишечная типа и диффузного типа. Кишечные типа GC преобладает в группы высокого риска географических районах и развивается через несколько последовательных этапов, включая хеликобактерной
( H
. пилори
) -associated атрофический гастрит, кишечная метаплазия (IM), и дисплазия. В отличие от диффузного типа GC, на долю которого приходится половина всех пациентов GC, имеет широкое географическое распространение и развивается даже от H
. пилори
-бесплатно, морфологически нормальных слизистой оболочки желудка без атрофический гастрит или IM, и диффузного типа GC может отличаться от кишечного типа как генетически, так и фенотипически [1-5]. В отличие от уменьшения распространенности кишечного типа, распространенность диффузного типа, как сообщается, растет во всем мире [6]. Прогноз для пациентов GC Advanced диффузного типа остается бедным за последнее десятилетие из-за высокой скорости перитонеального распространения (PD) (78%) по сравнению с кишечным типа (45%) [7]. В частности, у больных с типа Борман IV ГК имеют крайне неблагоприятный прогноз, даже если они получили мультидисциплинарного лечения [8]. Поэтому, обращаясь к PD является насущной проблемой для улучшения прогноза больных диффузным типа GC.
<Р> диффузного типа ШС, как правило, характеризуются обширным стромы фиброза с плохой васкуляризации и редкой пролиферативной ( I
. е
. бездействующие) раковые клетки, что приводит к существенному терапевтического сопротивления. С точки зрения химиотерапии, трансформирующий фактор роста &beta (TGF-бета) была мысль, чтобы внести свой вклад в агрессивной прогрессии через эпителиально-мезенхимальных перехода и вызывая фиброз [9]. Тем не менее, TGF-β также ингибирует клеточную пролиферацию, индуцирует апоптоз, и опосредует дифференцировку эпителиальных клеток, предполагая, что компоненты TGF-β сигнальных путей, обладают активностью в опухолевой супрессии в эпителиальных опухолей [10, 11]. Хотя накопление доказательств продемонстрировал критическую роль TGF-бета в раковых стволовых клеток (ЦОК) биологии, есть ограниченная информация о его роли в ШС диффузного типа.
<Р> Сообщалось, что каждая популяция опухолевых клеток показать функциональную неоднородность характеризуется отчетливым пролиферации и дифференцировки способности в различных типах опухолей [12]. Для учета такой опухоли неоднородности, были предложены две модели: Клональная модель эволюции [13] и модель CSC [14]. Последняя модель получила широкое внимание, так как она обеспечивает разумное объяснение устойчивости к традиционной химио- и лучевой терапии, в котором в состоянии покоя или медленно велоспорта ОКК выжить, и приводит к возможному рецидива опухоли [15-17]. Таким образом, терапевтические стратегии целевой ОКК являются обязательными для ликвидации остаточной болезни и для предотвращения рецидива не только GC, но и других видов рака. Кроме того, с текущим проникновением в клеточные механизмы канцерогенеза, метастатического потенциала опухолевых клеток приписывается ЦОК, который может клонированных инициируют образование опухоли в отдаленных местах [18 19]. Хотя ряд молекул клеточной поверхности, были предложены в качестве маркеров ЦОК в большом разнообразии злокачественных опухолей человека, не было никакой идентификации маркера для PD-ассоциированной ЦОК в ГКС [20-23]. Для выявления таких маркеров, мы рассмотрели понятие, что функционально и генетически разнородные опухоли имеют общие и внутренние механизмы поддержания опухоли в соответствии с контекстом данной микросреды. Соответственно, мы предположили, что ОКК должны быть определены функционально хорошо апробированы анализов, таких как В естественных условиях
трансплантации. В диффузного типа GC, мы изначально ориентированы на брюшины конкретных колонизации клеток и обогащали PD-ассоциированный CSCs повторными
естественных условиях выборов в [24, 25]. Здесь мы нашли СХС хемокиновый рецептор типа 4 (CXCR4) может быть маркером PD-ассоциированной ЦОК желудка и показано, что TGF-β повышает эффективность противоопухолевых препаратов с помощью индукции дифференцировки клеток /деление асимметричной клеток в CXCR4 <вир> + население CSC даже в состоянии покоя.

Материалы и методы

Клинические образцы
<р> Клинические образцы были предоставлены Национальным онкологического центра больницы (Токио, Япония) после получения письменное информированное согласие от каждого пациента и утверждения Национального совета по рассмотрению онкологического центра Institutional (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

клеточных линий и первичных культур

человеческого GC клеточная линия, ГСК-60 была создана соавтора с использованием процедуры, как описано ранее [26]. Очень перитонеальный-метастатической клеточная линия, 60As6 была создана из HSC-60 с использованием имплантации ортотопическая ткани в SCID /SCID мышей, как кратко следующим образом: ксенотрансплантированной опухоль ГСК-60 клеток пересаживали в желудочную стенку мыши. Мы повторили шесть циклов уборки асцитных опухолевых клеток и ортотопической инокуляции этих клеток. Эти две клеточные линии поддерживали в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной сыворотки теленка. Мы также установили две люциферазы-экспрессирующих клеточных линий (HSC-60Luc и 60As6Luc). Шесть других клеточных линий GC-производным (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 и КАТО III) также поддерживается в тех же условиях. Из этих шести, ГСК-39, ГСК-44, 44As3, ГСК-58, и 58As9 были установлены выше методике [27, 28], и КАТО III была получена из Американской коллекции типовых культур. Для получения первичных культур, клетки собирали из перитонеальной стирок и асцит пациентов (NSC-16С, НСК-20C, и НСК-22C) и культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной сыворотки теленка.

микрочипов анализ
<р> Общая РНК 60As6, 60As6Luc, ГСК-60, а также клетки HSC-60Luc выделяли путем суспендирования клеток в буфере для лизиса ISOGEN (Nippon Gene, Тояма, Япония) с последующим осаждением изопропанолом. Мы провели анализ микрочипов дважды с помощью Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния). Процедуры проводились в соответствии с протоколами поставщиков. Массивы были отсканированы с GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), и данные были проанализированы с помощью микрочипов Suite, версия 5.0 с настройками по умолчанию анализа Affymetrix и глобального масштаба в качестве метода нормализации. Обрезанные средняя целевая интенсивность каждого массива был произвольно установлен в 1000. Все данные микрочипов были сданы на хранение в базе данных MIAME совместимой, GEO; инвентарный номер GSE53276. К 2-кратному изменению, 684 генов, были выбраны в качестве специфических генов для 60As6 и 60As6Luc клеток, и 1150 генов, были выбраны для HSC-60 и ГСК-60Luc клеток.

Эксперименты на животных
<р> Шесть -недельный-Пол C.B17 /ICR-SCID (SCID /SCID) мышей (Clea Japan, Япония) разводили при комнатной температуре с 12 ч свет /темнота суточного цикла. Мышей содержали под конкретного патогена условиях и при условии, стерильные продукты питания, воду и клетки. 1 × 10 4 до 1 × 10 6 раковых клеток суспендируют 1 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и затем вводили в брюшную полость за счет использования 26 1/2-иглу калибра. Мыши были взвешены и измерены еженедельно. Гуманное конечных точек критерии включают в себя значительное накопление брюшной асцит, одышку, пилоэрекцию, анемия, или потеря веса превышает 10% от первоначального веса. Все эксперименты проводились в соответствии с этическими принципами Международной ассоциации по изучению боли и были одобрены Комитетом по этике в экспериментирования животных Национального онкологического центра по. Были предприняты усилия, чтобы минимизировать число и любые страдания животных, используемых в экспериментах.

RT-PCR
<р> Общую РНК выделяли путем суспендирования клеток в ISOGEN буфере для лизиса с последующим осаждением изопропанолом. Полуколичественное ОТ-ПЦР проводили в линейном диапазоне от 25 до 30 циклов для MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, LGR5
, TGFBR1
, TGFBR2
, и ACTB
с использованием следующих праймеров: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'и 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 'для MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3' и 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 'для CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' и 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 'для CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'и 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' для CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'и 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' для LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'и 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' для TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'и 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' для TGFBR2
и 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'и 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' для ACTB
.

Иммуноцитохимическая
<р> Косвенное флуоресцентный иммуноцитохимия проводили для CXCR4, MUC5AC и Smad2 /3 на клетках, выращенных в 4-луночных камерных горками. Клетки фиксировали в 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 20 мин. После того, как три раза промывания в PBS (-), их инкубировали с анти-человеческим CXCR4, моноклональные антитела (R &Amp; D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота), анти-антитело человека MUC5AC (Santa Cruz биохимия, Санта Круз, Калифорния), или анти- человек Smad2 /3 антитела (BD Biosciences, Bedford, MA) с последующей инкубацией с 1: 1000 раствора осла против мышиного Alexa 488-конъюгированной сыворотки (Invitrogen, Grand Island, NY) в течение 1 ч при комнатной температуре. Ядра клеток окрашивали 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Для анализа клеточных клонов, отсортировано одиночный CXCR4 ^{+ мелкие клетки окрашивали CellTracker Green (Invitrogen) для отслеживания жизнеспособных клеток.}

Проточная цитометрия и сортировка клеток

60As6 клетки (1 × 10 ^{6 клеток) совместно инкубировали в течение 30 мин при 4 ° с со следующими антителами: АРС против человеческого CD184 (CXCR4) (IgG2a, клон 12G5) или APC мышиного IgG2a, управление Изотип K полученные из BioLegend ( Сан - Диего, Калифорния). Мертвые клетки метили пропидийиодидом и исключены из анализа. Сортировкой клеток, что CXCR4-позитивных и CXCR4-отрицательные субпопуляции были очищены с использованием клеток сортировщик JSAN (залив Bioscience, Кобе, Япония), а также были проанализированы с помощью программного обеспечения, FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Для клеточного цикла анализа, клетки переносили в бессывороточной среде в течение 5 дней, а затем собирают с 0,05% трипсин-ЭДТА, а затем суспендировали в холодном 80% этаноле. После фиксации в течение ночи при -20 ° С, образцы были промыты в PBS (-) и инкубировали в 500 мкл PI /РНКазы окрашивающего буфера (BD Pharmingen, San Diego, CA) за 1 × 10 6 клеток в течение 30 мин при комнатной температуры перед проведением анализа. Проточной цитометрии проводили с использованием FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), и анализировали с помощью программного обеспечения, FlowJo.}

Анкоридж-независимый анализ клеточного роста
<р> Мягкое агар Анализ образования колоний проводилась с помощью трансформации клеток набора для анализа CytoSelect 96-Well (Cell Biolabs, San Diego, CA), следуя инструкциям изготовителя. В кратком изложении, 5 × 10 3 CXCR4-положительные или CXCR4-отрицательные мелкие клетки суспендировали в среде DMEM, содержащей 0,4% с низкой температурой плавления агарозы и 10% FBS и высевали на 1% агарозном геле легкоплавкой, содержащей DMEM и 10% FBS. После инкубации клеток в течение 5 дней при температуре 37 ° С в 5% CO <суб> 2, клетки лизируют и обнаружены с CyQuant GR краситель. Флуоресценция колониеобразующих клеток считывали в многофункциональном микропланшетов Reader (Safire, Tecan, Mannedorf, Swizerland) при возбуждении /эмиссионных длин волн 485/520 нм.

Invasion анализ
<р> инвазии клеток определяли с помощью BD Biocoat Опухоль Invasion система анализа (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, 4 × 10 5 60As6 клеток с бессывороточной средой были посеяны в верхнюю камеру системы. Донные лунки были заполнены среде с 10 нг /мл SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). После 24 ч инкубации клетки в верхней камеры удаляли и клетки, которые вторгались через мембрану Матригель окрашивали Diff-Quick пятно (BD Biosciences) и подсчитывали вручную.

каспазы анализ
<р> клетки 60As6 готовили в 96-луночный планшет (5 × 10 3 клеток /лунку). Каспазы 3/7 анализ проводили с использованием каспазы-Glo 3/7 анализа (Promega, Madison, WI) в 24 ч после добавления рекомбинантного TGF-β1 (240-B, R &Amp; D Systems) в культуре клеток в концентрация 2 нг /мл.

анализы клеточного роста
<р> Для определения IC <суб> 50 значений против доцетаксела (Doc), оба HSC-60 и 60As6 клетки культивировали в присутствии 0-100 нмоль Док (Aventis Pharma, Токио, Япония) в течение 4 дней при температуре 37 ° с в 5% СО <суб> 2 с последующим обычным МТТ-анализе. Для проверки комбинированное лечение с Doc и TGF-бета, все клетки 60As6 и 2 первичных культур (NSC-16C и -22C) получали в 6-луночный планшет (1 × 10 ^{5 клеток /лунку), а затем лечение с помощью Doc (2,5 нМ) и TGF- 1 (0 или 2 нг /мл) в течение 72 ч при 37 ° с в атмосфере 5% сО <югу> 2. Клетки окрашивали трипановым синим и подсчитывали с TC20 Automated Счетчик клеток (Bio-Rad, Hercules, CA).}

Статистический анализ
<р> Все данные были выражены как среднее ± SE, и проанализированы с помощью непарный т-тест. Принятый уровень значимости был р
&л; 0,05. SPSS (SPSS, Чикаго, Иллинойс) был использован для всех статистических анализов.

Результаты

Фенотипические различия между родительскими HSC-60 клеток и высоко онкогенные подлиния 60As6 клеток
<р> Для рассмотреть феномен диффузного типа GC-ассоциированной БП с точки зрения молекулярной и клеточной биологии, мы создали высоко перитонеальный-метастатическим линии клеток, 60As6, из диффузного типа GC, полученной клеточной линии, ГСК-60, через в естественных условиях
выборы, состоящие из ортотопической инокуляции опухолевых клеток и выделение высокоочищенных метастатических те из асцита иммунодефицитных мышей [25]. Хотя время удвоения этих двух клеточных линий была сравнима (30 ч для HSC-60 и 31 ч для 60As6) в пробирке
, 60As6 клетки формировали множественные узелки опухоли более быстро после внутрибрюшинного введения мышам. Медиана выживаемости составила 167 дней после имплантации 5 × 10 ^{6 HSC-60 клеток, в то время как имплантация того же количества клеток 60As6 привело к заметному образованию кровавых асцита и медиана выживаемости было всего 28 дней. Анкоридж-индепендентство может потребоваться для выживания свободных раковых клеток в брюшную полость и для колонизации. В анализе образования колоний, 60As6 клетки образуется много больше колоний по сравнению с HSC-60 клеток (S1 ФПГ), показывающие, что 60As6 обладает высокой способностью анкерного независимый рост. Мы подтверждено химическую устойчивость также известный как важнейшее свойство ЦОНов. Клетки культивировали в присутствии доцетаксела (Doc), который является часто используется противораковый препарат для лечения больных ГХ. 60As6 показал 6 раз выше IC <суб> 50 значение Doc по сравнению с ГСК-60 (52 нМ и 8,4 нМ, соответственно) (рис S2). Эти данные указывают на то, что 60As6 приобрела высокую химиорезистентных фенотип. Кроме того, морфология ГСК-60 клеток характеризуется как плоский и большой, в то время как у клеток 60As6 был Полуплавающий и небольшой, которая аналогична морфологии часто наблюдаемой для ОКК (S3 ФПГ). Затем мы исследовали локализацию липидные рафты с использованием холерного токсина (CtxB субъединицу) в качестве липидного плота маркера, так как уже сообщалось, что липидные кластеры плота были обогащены гемопоэтических стволовых клеток [29]. Накопление флуоресцентного CtxB наблюдалась для 60As6 клеток, но не в ГСК-60, предлагая другой CSC-как свойство для бывших клеток (S3 Рис)
. <Р> Для того, чтобы оценить биологические различия между ГСК-60 и 60As6 клетки, мы сравнили профили экспрессии генов при помощи анализа микрочипов (S1 Table). Понижающая регуляция трех маркеров дифференцировки клеток желудка ямы ( MUC5AC
, MUC1
и TFF1
) и некоторые цитокератины были найдены в 60As6. В отличие от этого, несколько маркеров стволовых клеток ( ly75
, CD44
, GPNMB
и CXCR4
) были в этой позитивной регуляции клеточной линии. Профиль экспрессии позволяет предположить, что 60As6 имеет сильную мезенхимальных фенотипа, который является характеристикой эпителиальных клеток, полученных ОКК.
<Р> Мы дополнительно исследовали экспрессию мРНК как типичного маркера дифференцировки MUC5AC
[3 , 4] и метастаз ассоциированного рецептора хемокинов <ЕМ> CXCR4
[30] с помощью RT-PCR. В соответствии с результатами микрочипов, MUC5AC
и CXCR4
показал мРНК взаимоисключающие выражение в ГСК-60 и 60As6 (рис 1А). Хемокин SDF-1, кодируемый CXCL12
известно связать CXCR4 и его родственный рецептор CXCR7 [30]; Однако мРНК <ЕМ> CXCL12
и CXCR7
не были обнаружены в любой клеточной линии. Экспрессия обоих MUC5AC и CXCR4 было также подтверждено на уровне белка с помощью иммуногистохимического окрашивания (фиг.1В). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что клетки в ГСК-60 питают более дифференцированных клеток, чем делают клетки 60As6, которые в основном состоят из недифференцированных клеток. Взятые вместе, все эти CSC-подобные характеристики 60As6 показывают, что недифференцированные субпопуляции с высокой туморогенности и лекарственной устойчивости может быть эффективно обогащается от родительских клеток во время В естественных условиях
выборов.}

Идентификация и характеристика желудка ЦОК в 60As6 и первичных культивированных клеток

Далее мы рассмотрели роль CXCR4 в GC клетках диффузного типа для PD. Как показано на фиг.1А, рецептор <ЕМ> CXCR4
высоко выражена в 60As6 по сравнению с HSC-60, в то время как их лигандом <ЕМ> CXCL12 /sdf1
не было в обоих. Тем не менее, следует отметить, что этот лиганд, как известно, выражается в перитонеальных мезотелиальных клеток [31] и функционировать в качестве хемокина, чтобы вызвать отдаленные метастазы через взаимодействие с раковыми клетками CXCR4-экспрессирующих [30]. Таким образом, мы исследовали, может ли CXCR4 служить в качестве маркера для идентификации PD-ассоциированных CSCs. Выражение CXCR4 на клетках 60As6 анализировали с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) анализа. По выражению CXCR4 и вперед картины рассеяния, 60As6 клетки проявляли гетерогенность, состоящую из трех различных субпопуляций: I. CXCR4 ^{+ небольшие клетки (15%), II. CXCR4 - мелкие клетки (65%), и III. CXCR4, - крупные клетки (20%) (рис 1CI). Затем клетки разделены на каждой субпопуляции с чистотой I: 97%, II: 99%, а III: 54%, соответственно (рис 1Cii-1Civ). Низкая чистота сортировка CXCR4 - большая ячейка субпопуляции III объясняется загрязнением с агрегированной CXCR4 - мелкие клетки (рис 1Civ, черно-боксировал панель). Среди этих трех субпопуляций, лишь CXCR4 - большая клетка субпопуляции содержала MUC5AC + дифференцированные клетки (рис 1Civ, три внешние панели). Путем мониторинга роста клеток в одном уровне клетки, было установлено, что CXCR4 - малые клетки пролиферируют, в то время как CXCR4 - крупные клетки не претерпевают деление клеток даже через 3 дня после культивирования (рис 1D и S4 Рис). Эти данные позволяют предположить, что CXCR4 - небольшие клетки являются преходящие усилительных клетки, в то время как CXCR4 - крупные клетки терминально дифференцированные клетки
<р> После сортировки две субпопуляции (I и II), мы анализируем. любое смещение клеточной популяции (рис 2А); после 7 дней культивирования. CXCR4 + небольшие клетки, соответствующие субпопуляции я сгенерировал себя, CXCR4 - мелкие клетки, и CXCR4 - крупные клетки (11%, 62% и 21%, соответственно), тогда как CXCR4 - мелкие клетки, соответствующие субпопуляции II смогли привести в основном к себе (80%) с некоторыми крупными ячейками (17%) и очень мало CXCR4 + небольшие ячейки (2%). Эти результаты свидетельствуют о том, что CXCR4 + небольшие клетки имеют потенциал дифференциации и производят CXCR4 - крупные клетки, возможно, через стадию CXCR4 -. Мелкие ячейки в схеме дифференцировки клеток
<р> Кроме того, CXCR4 + небольшие одной клетки получают колонию, содержащую MUC5AC + дифференцированные клетки через 7 дней в культуре (рис 2В). Этот вывод был поддержан с помощью анализа клеточных клонов в сочетании с окрашиванием живых клеток и иммунным MUC5AC (рис 2C). Кроме того, CXCR4, + небольшие клетки экспрессируют высокий уровень LGR5
, который известен как маркер желудочных эпителиальных стволовых клеток, расположенных в железе нормальной слизистой оболочке [32] (рис 2D ).
<р> Далее, мы заверило креплении независимости и опухолевый инициирующий способность двух маленьких клеток субпопуляции (I и II). В анализе образования колоний, CXCR4 + небольшие клетки образуются гораздо больше колоний, чем сделал CXCR4 - мелкие клетки (рис 3А). Серийные эксперименты разбавление внутрибрюшинного заражения в иммунодефицитных мышей показало, что CXCR4 + небольшие клетки также обладают более высокой онкогенного способностью (развитие опухоли в 4/5 и 1/5 мышей при инокуляции 10 5 и 10 4 клетки, соответственно) по сравнению с CXCR4 - мелких клеток (1/10 и 0/10 мышей после 10 5 и 10 4 ячейки, соответственно) (рис 3Bi). Примечательно, что все пять опухоль мышей после прививки CXCR4 + небольшие клетки имели множественные опухолевые узелки (рис 3Bii), и начал развивать кровавый асцит в течение 3-х недель (рис 3Biii).
<Р> В дополнение к диффузного типа линии ГХ клеток, мы также исследовали роль CXCR4 в клиническом образце (NSC-20C): первичную культуру устанавливается из асцитов ГХ пациента диффузного типа с PD. В ОТ-ПЦР и экспериментов иммуноокрашивания, было подтверждено, что первичная культура выражают CXCR4
но не <ЕМ> CXCR7
(фиг.3С). Важно отметить, что CXCR4 + небольшие клетки, упорядоченные от НСК-20С обладает одновременно заселив способностью (рис 3Di и 3Dii) и способность формирования высокой колонии (рис 3Diii).}

Участие CXCR4 /SDF /CXCR7 -1 оси в PD
<р> в шести других GC клеточных линиях диффузного типа (ГСК-39, ГСК-44, 44As3, ГСК-58, 58As9 и КАТО III) мы также исследовали взаимосвязь между выражение статус двух CXCL12 /SDF-1 рецепторов (CXCR4 и CXCR7) и накоплением асцита у мышей, привитых с раковыми клетками внутрибрюшинно. Эксперименты RT-PCR показало, что две клеточные линии GC (HSC-39 и КАТО III) высоко экспрессируется CXCR4
(рис 4A). Кроме того, оба этих ксенотрансплантированной мышей имели множественные узелки опухоли и накопленных асцит (рис 4В). В отличие от этого, другие две клеточные линии (HSC-44 и HSC-58) показали отсутствие или весьма низкой экспрессии CXCR4, одного или нескольких перитонеального опухоли и узелки не накапливались асцит (рис 4В). Мы также подтвердили накопление асцита в другой весьма перитонеального-метастатического сублиния 58As9 (полученного из ГСК-58), которая выражается CXCR7
на высоком уровне, но не CXCR4
. Один исключительный случай был 44As3 получен из HSC44, что имел множественные узелки опухоли и накопленные асцит без экспрессии и CXCR4
и CXCR7
. В целом, мы обнаружили высокую корреляцию между уровнем экспрессии CXCR4
или CXCR7
и агрессивные фенотипы в семи из восьми клеточных линий, за исключением 44As3.
<Р> В клинической практике , перитонеальный лаваж цитологии (CY) обеспечивает важную прогностическую информацию для пациентов GC, так как он может обнаружить «семя» БП до его макроскопического проявления. Даже в тех случаях, не имеющих PD (P0), CY-положительных пациентов имеют плохой прогноз [33], предполагая, что довольно много метастатических ОКК присутствуют в перитонеального лаважа этих пациентов. Поэтому мы далее исследовали присутствие CXCR4 + GC клеток в перитонеальных смывах из пациентов без клинически видимых асцита. CXCR4
мРНК редко обнаружен в промывных водах в 9 из 10 CY-отрицательных пациентов; Тем не менее, мРНК был обнаружен в промывных водах в 19 из 34 CY-положительных пациентов (S5A ФПГ). Мы также подтвердили присутствие CXCR4 и цитокератиновых двойных положительных малых GC клеток на булыжником-образную форму мезотелиальной клеток, прикрепленных к поверхности культуры блюдо в короткий срок (7 дней) культуры асцита пациента (S5B FIG). В наших опытах брюшины мезотелиальной клетки, как правило, исчезали в долгосрочной культуре после того, как около одного месяца. В такой долгосрочной культуре, мы также обнаружили присутствие некоторого CXCR4- или CXCR7-высоко положительных GC клеток, которые показали характеристики для эпителиально-мезенхимальных перехода, виментина (VIM) -положительным (стрелка головки по S5C рис), но цитокератин (PAN ) -отрицательное. Поэтому CXCR4 + GC клетки присутствуют в злокачественных асцит не только на ранней стадии перитонеального распространения (P0 /CY +), но и в более прогрессивных этапах характеризуется накоплением откровенной асцит. В целом, выше экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что часть CXCR4 + или CXCR7 + GC клетки имеют потенциал для развития перитонеальный метастаз.
<Р> Далее мы исследовали функциональную роль CXCR4 сигнального пути в PD. Выражение <ЕМ> CXCL12
/<ЕМ> SDF-1
в брюшную мезотелием человека и мыши была подтверждена с помощью ОТ-ПЦР (фиг.5А). Таким образом, участие CXCL12 /SDF-1 для вторжения клеток исследовали. Как показано на фиг.5В, число инвазивных клеток 60As6 была резко увеличена на SDF-1, что свидетельствует о том, что эти клетки обладают способностью хемотаксис к SDF-1. Лентивирусов shRNA индуцированных нокдаун CXCR4 в 60As6 ослабляется SDF-1-опосредованной инвазии, но не влияет на образование опухолей узелков в брюшной полости мышей (не показано). Кроме того, принудительное выражение CXCR4 в клеточной линии родительской ГСК-60 никогда не увеличивало онкогенность (не показан). Взятые вместе, наши данные свидетельствуют о том, что CXCR4 участвует в приложении к брюшине, но не в образовании опухоли узелков.
<Р> Мы показали схематически процессы прямой PD от стенки желудка в прогрессирующих больных ГЦ через взаимодействие между CXCR4 + или CXCR7 + ОКК и SDF-1-экспрессирующие брюшины (рис 5C). На первом этапе метастазирования, то CXCR4 + ОКК было пролито из стенки желудка в брюшную полость. Затем эти клетки прикрепляются к базальной мембране (БМ) брюшины в ответ на Мезотелия полученный хемоаттрактанту SDF-1 и колонизировать с образованием узелков. Эти события происходят в многочисленных участков на поверхности брюшины, в результате блокады насоса-функции, а затем в накоплении асцита.

TGF-β способствует дифференциации клеток /асимметричная деление клеток CXCR4 + Желудочный ОКК
<р> TGF-β было сообщено, чтобы уменьшить боковую популяцию некоторых GC клеточных линий диффузного типа [34]. Поэтому мы исследовали, есть ли TGF-β потенциал, чтобы изменить характеристики CXCR4 + диффузного типа GC клеток. Сначала мы исследовали уровни экспрессии TGF-бета-рецепторов в клетках 60As6 и первичных культур GC, полученных из двух независимых пациентов (NSC-16C и -22C). ОТ-ПЦР эксперименты показали, что оба из двух генов рецептора TGF-β ( TGFBR1
и TGFBR2
) экспрессируется во всех этих клетках (S6 ФПГ). Мы также исследовали локализацию SMAD2 /3, так как эти факторы транскрипции широко известны накапливаться в ядрах в ответ на активацию передачи сигналов TGF-бета. Как показано на рис, 6Ai ядерного накопления SMAD2 /3 был обнаружен в клетках 60As6 после 30 мин обработки 2 нг /мл TGF-бета в.
<Р> Далее мы исследовали, как CXCR4 + GC клетки зависит от активации сигнализации TGF-бета. Эксперимент RT-PCR показали снижение CXCR4
мРНК в 60As6 путем обработки TGF-бета (рис 6Aii). Проточная цитометрия анализ показывают, что лечение TGF-β уменьшает CXCR4 + небольшие клетки с 6,3% до 0,4% и увеличить CXCR4 - крупные клетки с 17,1% до 43,2% (рис 6б). В соответствии с увеличением терминально дифференцированных клеток, каспазы 3/7 в популяции цельных клеток активировали с помощью обработки TGF-бета (фиг.6С). Таким образом, TGF-β может иметь потенциал, чтобы вызвать CXCR4 + CSCs в терминально дифференцированных клеток. Кроме того, мы исследовали влияние TGF-бета на покоящихся клетках 60As6, так как ОКК, как полагают, существуют в состоянии покоя при hypovascular состоянии. После того, как в сыворотке крови истощения в течение 5 дней, CXCR4, + небольшие клетки увеличилась до 42% (рис 6Di).

• PLoS ONE: SIRT3 Усиливает гликолиза и пролиферации в SIRT3-экспрессирующих клеток рака желудка
• PLoS ONE: микроРНК-137 Содействует расхоложенные онкогенеза в человека рака желудка с помощью таргетинга AKT2