PLOS ONE: Identifiering och karakterisering av CXCR4-positiv Gastric cancerstamceller

Abstrakt

Diffus-typ solida tumörer är ofta sammansatt av en hög andel av sällan prolifererande (dvs vilande) cancerceller, vilket starkt indikerar inblandning av cancerstamceller (CSCs) Även om diffus-typ magcancer (GC) patienter har en dålig prognos på grund av hög-frekventa utvecklingen av peritoneal spridning (PD), är det begränsad kunskap att PD-associerad CSCs och effekt av CSC-targeting terapi i diffus-typ GC. I denna studie har vi etablerat mycket metastatiska GC cellinjer från In vivo
urval avsedd för anrikning av PD-associerad GC-celler. Genom microarray analys, fann vi CXC kemokinreceptorn typ 4 (CXCR4) kan vara en ny markör för mycket metastatiska CSCs, eftersom CXCR4-positiva celler kan växa förankrings självständigt initiera tumörer hos möss, vara resistenta mot cytotoxiska läkemedel, och producera differentierade dotter celler. I kliniska prov har dessa CXCR4-positiva celler hittades från inte bara sent metastaser stadium (ackumulerad ascites) men även tidigare skede (peritoneala tvätt). En sådan behandling med transformerande tillväxtfaktor-β förstärkt anti-cancer effekt av docetaxel via induktion av celldifferentiering /asymmetrisk celldelning av CXCR4-positiva gastriska CSCs även i ett vilande tillstånd. Därför differentiering inducerare håller löftet för att erhålla den maximala terapeutiska resultatet från för närvarande tillgängliga anti-cancerläkemedel genom återanvändning av CSCs

Citation. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) Identifiering och karakterisering av CXCR4-positiv Gastric cancerstamceller. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10.1371 /journal.pone.0130808

Redaktör: Masaharu Seno, Okayama University, Japan

Mottagna: 18 februari 2015, Accepteras: 25 maj 2015; Publicerad: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödinformationsfiler. Alla microarray uppgifter har deponerats i en MIAME kompatibel databas, GEO; anslutningsnummer GSE53276

Finansiering:. Detta arbete stöddes delvis av National Institute of Biomedical Innovation (för avancerad forskning för Läkemedels Mining Programme ID10-41), ministeriet för hälsa, arbete och välfärd i Japan (för tredje Omfattande 10-års strategi för cancerkontroll H22-007), National Cancer Center Research och utvecklingsfonden (25-A-6, 26-A-3). DRS T Fujita, M Tamaoki och T Nishimura är mottagare av en forsknings Resident gemenskap från Stiftelsen för främjande av cancerforskning i Japan

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Inledning

Gastric cancer (GC) är en av de främsta orsakerna till cancerrelaterade dödsfall i världen. Histopatologiskt kan GCS delas in i två huvudkategorier: intestinal-typ och diffus typ. Intestinal typ GC dominerar i högrisk geografiska områden och utvecklas genom några sekventiella stadier inklusive Helicobacter pylori
( H
. pylori
) -associated atrofisk gastrit, intestinal metaplasi (IM), och dysplasi. Däremot, diffus typ GC, som står för hälften av alla GC patienter har en stor geografisk spridning och utvecklar även från H
. pylori
-fri, morfologiskt normal magslemhinna utan atrofisk gastrit eller IM, och diffus typ GC kan skilja sig från tarm-typ både genetiskt och fenotypiskt [1-5]. Till skillnad från den minskande förekomsten av tarm typ är förekomsten av diffusa-typ enligt uppgift ökar i världen [6]. Prognosen för avancerad diffus-typ GC patienter har förblivit dåligt under det senaste decenniet på grund av en hög hastighet av peritoneal spridning (PD) (78%) jämfört med den hos intestinal-typ (45%) [7]. Särskilt patienter med Bormann typ IV GC har en extremt dålig prognos, även om de fick tvärvetenskaplig behandling [8]. Därför adresse PD är en angelägen fråga för förbättring av prognosen för diffusa-typ GC patienter.

Diffus-typ GC typiskt kännetecknas av ett omfattande stromal fibros med dålig kärl och sällsynta proliferativ ( i
. e
. vilande) cancerceller, vilket leder till en betydande terapeutisk motstånd. Med avseende på kemoterapi, transformerande tillväxtfaktor β (TGF-P) har varit tänkt att bidra till den aggressiva progression via epitelial-mesenkymala övergång och genom att inducera fibros [9]. Emellertid, TGF-β inhiberar också cellproliferation, inducerar apoptos, och medierar differentiering i epitelceller, vilket antyder att komponenter i de TGF-β signalvägar har tumör-undertryckande aktivitet i epiteliala tumörer [10, 11]. Även ackumulera bevis har visat den avgörande betydelsen av TGF-β i Cancerstamceller (CSC) biologi, det finns begränsad information om dess roll i diffus-typ GC.

Det har rapporterats att varje population av tumörceller visa funktionell heterogenitet som kännetecknas av tydlig proliferation och differentiering kapacitet i olika typer av tumörer [12]. Att redogöra för sådana tumör heterogenitet har två modeller föreslagits: den klonala utvecklingsmodell [13] och CSC modellen [14]. Den senare modellen har fått stor uppmärksamhet, eftersom det ger en rimlig förklaring för resistens mot konventionell kemoterapi och strålbehandling, där vilande eller långsamt cykel CSCs överleva, och resulterar i eventuell tumör återfall [15-17]. Därför terapeutiska strategier rikta CSCs är absolut nödvändigt att utrota kvarvarande sjukdom och för att förhindra återfall i inte bara GC utan även andra cancerformer. Dessutom med nuvarande insikter i cellulära mekanismer av cancer, är den metastatiska potentialen hos tumörceller tillskrivs CSCs, som kloner kan initiera tumörbildning på avlägsna platser [18 19]. Även om ett antal cellytemolekyler har föreslagits som CSC markörer i ett stort antal humana maligniteter, har det inte funnits någon markör för identifiering av PD-associerade CSCs i GC [20-23]. Att identifiera sådana markörer, ansåg vi tanken att funktionellt och genetiskt heterogena tumörer har gemensamma och inneboende mekanismer för tumör underhåll enligt ramen för en given mikromiljö. Följaktligen hypotes vi att CSCs bör definieras funktionellt med väl godkända analyser som In vivo
transplantation. I diffus typ GC, ursprungligen fokuserade vi på bukhinnan specifika kolonisering av celler och berikat PD-associerade CSCs av repetitiva In vivo
val [24, 25]. Här har vi hittat CXC-kemokin-receptor typ 4 (CXCR4) kan vara en markör för PD-associerad ventrikel- CSCs och visade att TGF-β förhöjer effektiviteten av antitumörläkemedel via induktion av celldifferentiering /asymmetrisk celldelning i CXCR4 ^{+ CSC befolkningen även i ett vilande tillstånd.}

Material och metoder

Kliniska prover

Kliniska prover som tillhandahålls av National Cancer Center Hospital (Tokyo, Japan) efter att ha inhämtat skriftligt informerat samtycke från varje patient och godkännande av National Cancer Center Institutional Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

Cellinjer och primära kulturer

En människa GC cellinje, var HSC-60 som fastställts av en medarbetare med användning av förfarandet som beskrivits tidigare [26]. En i hög grad peritoneal-metastatisk cellinje, var 60As6 etablerad från HSC-60 med användning av orthotopic vävnads implantering i SCID /SCID-möss så kortfattat på följande sätt: den xenotransplanterat tumör i HSC-60-celler transplanterades in i den gastriska väggen av en mus. Vi upprepade sex cykler av skörd askitiska tumörceller och den orthotopic inokulering av dessa celler. Dessa två cellinjer upprätthölls i ett RPMI-1640-medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum. Vi har också etablerat två luciferas-uttryckande cellinjer (HSC-60Luc och 60As6Luc). Sex andra GC-härledda cellinjer (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 och KATO III) var också kvar under samma villkor. Av dessa sex, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, och 58As9 fastställdes genom ovanstående förfarande [27, 28], och KATO III erhölls från American Type Culture Collection. För primära kulturer uppsamlades celler från patienternas peritoneala tvättningar och ascites (NSC-16C, NSC-20C, och NSC-22C) och odlades i ett RPMI-1640-medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum.

microarray analys

Totalt RNA från 60As6, 60As6Luc, HSC-60, och HSC-60Luc celler isolerades genom att suspendera cellerna i en ISOGEN lysbuffert (Nippon Gene, Toyama, Japan) följt av isopropanol utfällning. Vi har utfört microarray analys två gånger med hjälp av Human Genome U133 Plus 2,0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Procedurerna utfördes enligt leverantörens protokoll. Matriserna skannades med en Genechip Scanner 3000 (Affymetrix), och data analyserades med microarray Suite version 5.0 med Affymetrix standardanalysinställningar och global skalning som normaliseringsmetod. Den trimmade genomsnittliga målintensitet av varje grupp godtyckligt satt till 1000. Alla microarray uppgifter har deponerats i en MIAME kompatibel databas, GEO; accessionsnummer GSE53276. Av en 2-faldig förändring, var 684 gener valda som specifika gener för 60As6 och 60As6Luc celler och 1150-generna valdes ut för HSC-60 och HSC-60Luc celler.

Djurförsök

Six veckors gammal kvinna C.B17 /ICR scid (SCID /SCID) möss (CLEA Japan, Japan) föddes upp vid rumstemperatur med en 12 h ljus /mörker dagligen cykel. Mössen hölls under specifika patogenfria förhållanden och under förutsättning sterila mat, vatten och burar. 1 × 10 ^{4 till 1 × 10 6 av cancerceller suspenderades med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och injicerades sedan i bukhålan genom användning av en 26 02/01-gauge nål. Mössen vägdes och mättes varje vecka. Humana endpoint kriterier inkluderade signifikant ackumulering av abdominala ascites, dyspné, piloerektion, anemi, eller viktminskning som överstiger 10% av ursprunglig vikt. Alla experiment utfördes i enlighet med de etiska riktlinjerna från den internationella anslutningen för studien av smärta och har godkänts av kommittén för etik inom djurförsöks av National Cancer Center. Ansträngningar gjordes för att minimera antalet och lidande av djur som används i försöken.}

RT-PCR

Totalt RNA isolerades genom att suspendera cellerna i en ISOGEN lysbuffert följt av isopropanol utfällning. Semi-kvantitativ RT-PCR utfördes inom linjära intervallet från 25 till 30 cykler för MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, LGR5
, TGFBR1
, TGFBR2
och ACTB
använder följande primers: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'och 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 "för MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 'och 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3' för CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3 'och 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3' för CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'och 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' för CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'och 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3 "för LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'och 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' för TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'och 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' för TGFBR2
, och 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'och 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' för ACTB
.

immuncytokemi

Indirekt fluorescerande immuncytokemi utfördes för CXCR4, MUC5AC och Smad2 /3 på celler som odlas i fyra brunnar kammarglas. Celler fixerades i 4% paraformaldehyd vid rumstemperatur under 20 min. Efter tre gånger tvättning i PBS (-), inkuberades de med anti-human CXCR4 monoklonal antikropp (R &D Systems, Minneapolis, MN), anti-human MUC5AC antikropp (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz, CA), eller anti- humana Smad2 /3-antikropp (BD Biosciences, Bedford, MA) följt av inkubation med en 1: 1000 spädning av åsne-anti-mus-Alexa 488-konjugerad serum (Invitrogen, Grand Island, NY) under 1 h vid rumstemperatur. Cellkärnor färgades med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). För cell-härstamning analys, sorterade enda CXCR4 ^{+ små celler färgades av Celltracker Green (Invitrogen) för att spåra de livsdugliga cellerna.}

Flödescytometri och cellsortering

60As6 celler (en × 10 ^{6 celler) saminkuberades under 30 min vid 4 ° C med följande antikroppar: APC-anti-humant CD184 (CXCR4) (IgG2a, klon 12G5) eller APC mus IgG2a, k isotypkontroll erhållen från BioLegend ( San Diego, CA). Döda celler märktes med propidiumjodid och uteslöts från analysen. I cellsortering ades CXCR4-positiva och CXCR4-negativa subpopulationer renas med hjälp av en JSAN cellsorterare (Bay Bioscience, Kobe, Japan), och analyserades med en programvara, FlowJo (Träd Star, Inc., Ashland, OR). För cellcykelanalyser, överfördes cellerna till ett serumfritt medium under 5 dagar och därefter skördas med 0,05% trypsin-EDTA, och suspenderades sedan i kall 80% etanol. Efter fixering över natten vid -20 ° C, tvättades proven i PBS (-) och inkuberades i 500}

• PLOS ONE: SIRT3 Förbättrar glykolys och spridning i SIRT3 uttryck Gastric Cancer Cells
• PLOS ONE: MicroRNA-137 Bidrar till Dämpad tumörbildning i Human ventrikelcancer genom att rikta AKT2