PLoS One: azonosítása és jellemzése CXCR4-pozitív gyomorkarcinóma Stem Cells

absztrakt katalógusa

A diffúz típusú szilárd tumorok gyakran áll egy magas aránya ritkán osztódó (azaz nyugalmi állapotban) a rákos sejtek, erőteljesen jelzi a bevonása rák őssejtek (CSC) Bár a diffúz típusú gyomorrák (GC) betegek rossz a prognózisa, mert a magas gyakori fejlesztése peritoneális terjesztés (PD), akkor korlátozott ismeretekkel, hogy a PD-asszociált CSC és hatásosságát CSC- célzó terápia diffúz típusú GC. Ebben a tanulmányban megállapított erősen szóródó GC sejtvonalak in vivo katalógusa kiválasztás tervezett dúsítására PD-asszociált GC sejteket. By microarray analízis azt találtuk CXC kemokinreceptor 4-es típusú (CXCR4) lehet egy új marker erősen szóródó CSC, mivel CXCR4-pozitív sejtek nőhet horgonyzástól függetlenül kezdeményez daganatok egerek rezisztensek a citotoxikus gyógyszer, és termel differenciált lánya sejtekben. A klinikai minták, ezek CXCR4-pozitív sejtet találtunk a nemcsak a késői áttétek szakaszában (felhalmozott ascites), hanem korábbi szakaszában (peritoneális mosógépek). Sőt, kezelés a transzformáló növekedési faktor-β fokozta a rákellenes hatás a docetaxel indukálása révén sejtdifferenciálódás /aszimmetrikus sejtosztódás a CXCR4-pozitív gyomor CSC még egy szunnyadó állapotban. Ezért differenciálás induktorok ígéretes megszerzéséhez a maximális terápiás eredmény a jelenleg elérhető rákellenes gyógyszerek révén újra ciklikus CSC. Katalógusa

Citation: Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) azonosítása és jellemzése CXCR4-pozitív gyomorkarcinóma őssejteket. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10,1371 /journal.pone.0130808 katalógusa

Szerkesztő: Masaharu Seno, Okayama University, Japán katalógusa

Beérkezett: Február 18, 2015-ig; Elfogadva: 25. május 2015; Megjelent: június 25, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Fujita et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. Minden microarray adatok kerültek letétbe a MIAME kompatibilis adatbázist, GEO; hozzáférési szám GSE53276. katalógusa

Forrás: Ezt a munkát részben támogatta a National Institute of Biomedical Innovation (az Advanced Research for Medical Products Mining program ID10-41), az Egészségügyi Minisztérium, Munkaügyi és Jóléti Japán (a harmadik átfogó 10 éves stratégia Rákellenes H22-007), National Cancer Center Kutatási és Fejlesztési Alap (25-a-6, 26-a-3). Dr. T Fujita, M Tamaoki és T Nishimura a címzettek egy kutatási Resident Ösztöndíjat az Alapítvány Promotion of Cancer Research Japánban. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető katalógusa

a gyomorrák (GC) az egyik fő oka a rákos halálesetek világszerte. Szövettanilag, GC sorolhatók két fő kategóriába: bél típusú és diffúz típusú. Bél típusú GC túlsúlyban a magas kockázatú földrajzi területek és fejlődik néhány egymást követő szakaszában, beleértve Helicobacter pylori katalógusa ( H katalógusa. pylori katalógusa) -asszociált atrophiás gastritis, intestinalis metaplasia (IM), és diszplázia. Ezzel szemben, diffúz típusú GC, amely felét az összes GC betegek széles földrajzi eloszlása ​​és fejleszti még a H katalógusa. pylori katalógusa -mentes, morfológiailag normál gyomornyálkahártya nélkül sorvadásos gyomorhurut vagy IM, és diffúz típusú GC eltérhet a bél típusú mind genetikailag és fenotípusosan [1-5]. Ellentétben a csökkenő előfordulási a bél típusú, gyakorisága a diffúz típusú állítólag világszerte növekszik. [6] A prognózis a fejlett diffúz típusú GC betegek továbbra is gyenge az elmúlt évtizedben, mert a nagy sebességgel a peritoneális terjesztés (PD) (78%), mint az, hogy a bél típusú (45%) [7]. Különösen betegek Bormann IV típusú GC is rendkívül rossz prognózist, akkor is, ha megkapták a multidiszciplináris kezelés [8]. Ezért címzés PD sürgető problémát javítására prognózisát diffúz típusú GC betegek. Katalógusa

A diffúz típusú GC tipikusan jellemzi kiterjedt stroma fibrózis rossz erezettség és ritka proliferatív ( i
. e katalógusa. szunnyadó) a rákos sejtek, ami jelentős terápiás ellenállás. Szemszögéből kemoterápia, a transzformáló növekedési faktor β (TGF-β) már gondolják, hogy hozzájárul az agresszív progresszió keresztül epithelialis-mesenchymalis átmenet és indukálva fibrosis [9]. Azonban, a TGF-β is gátolja a sejtproliferációt, apoptózist indukál, és közvetíti differenciálódást hámsejtekben, ami arra utal, hogy a komponensek a TGF-β jelátviteli van tumor-szuppresszív aktivitást epithelialis daganatokban [10, 11]. Bár halmozódó bizonyítékok azt mutatják, milyen fontos a TGF-β rákos őssejt (CSC) biológia, kevés információt szerepét diffúz típusú GC. Katalógusa

Leírták, hogy az egyes populációk tumorsejtek azt mutatják, funkcionális heterogenitás jellemzi különböző proliferációját és differenciálódását kapacitás különböző típusú daganatok [12]. Tekintettel az ilyen tumor heterogenitás, két modellt javasoltak: a klonális evolúció modell [13], és a CSC modell [14]. Az utóbbi modell kapott nagy figyelmet, mert ez biztosítja az ésszerű magyarázatot ellenállás a hagyományos kemo- és sugárterápia, ahol nyugalomban vagy lassú kerékpározás CSC túlélni, és az eredmények esetleges tumorrecidiva [15-17]. Ezért terápiás stratégiák a cél CSC elengedhetetlenek felszámolása reziduális betegség kiújulásának megelőzése nemcsak GC hanem egyéb rákok. Továbbá, a jelenlegi betekintést a celluláris mechanizmusok karcinogenezis, a metasztatikus potenciálját tumorsejtek tulajdonítják CSC, ami klonális kezdeményez a tumorképződést a távoli helyek [18 19]. Bár számos sejtfelszíni molekulák javasoltak CSC markerek sokféle humán rosszindulatú, nem volt marker azonosítását a PD-asszociált CSC in GC [20-23]. Azonosítani az ilyen markerek, mi tekinthető az elképzelés, hogy funkcionálisan és genetikailag heterogén daganatok közös és belső mechanizmusai tumor karbantartás szerinti összefüggésben egy adott mikrokörnyezet. Ennek megfelelően azt feltételeztük, hogy a CSC kell meghatározni funkcionálisan jól validált vizsgálatokat, mint a in vivo katalógusa transzplantáció. Diffúz típusú GC azt kezdetben a hashártya-specifikus kolonizáció sejtek és gazdagította a PD-asszociált CSC ismétlődő in vivo katalógusa választás [24, 25]. Itt, azt találtuk, CXC kemokinreceptor 4. típusú (CXCR4) lehet egy markere PD-okozta gyomor- CSC és kimutatták, hogy a TGF-β fokozza a hatékonyságát az anti-tumor gyógyszerek indukálása révén sejtdifferenciálódás /aszimmetrikus sejtosztódás a CXCR4 ^{+ CSC lakosság még alvó állapotban. katalógusa}

anyagok és módszerek katalógusa

Klinikai minták

a klinikai mintákat az Országos Rákkutató Központ Hospital (Tokió, Japán) megszerzése után írásos beleegyezését adta minden beteg és jóváhagyás National Cancer Center Intézményi Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031). katalógusa

sejtvonalak és primer kultúrák katalógusa

az emberi GC sejtvonal, HSC-60 hozta létre egy együttműködő eljárás alkalmazásával a korábban ismertetett módon [26]. Egy erősen peritoneális metasztatizáló sejtvonalból, 60As6 jött létre HSC-60 használatával ortotopikus szövet beültetés SCID /SCID egerekben, röviden a következő: a-xenograftot hordozó tumor HSC-60 sejtek átültetett a gyomor falán egy egér. Megismételtük hat ciklus betakarítás ascites tumor sejtek és az ortotopikus beoltása ezeket a sejteket. Ez a két sejtvonalat fenn RPMI-1640 tápközegben, amelyet 10% magzati borjú szérumot. Azt is megállapították, két luciferáz expresszáló sejtvonalak (HSC-60Luc és 60As6Luc). Hat másik GC-eredetű sejtvonalak (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, és KATO III) szintén fennmarad az azonos állapotban. E hat, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, és 58As9 jöttek létre a fenti eljárással [27, 28], és a KATO III kaptuk az American Type Culture Collection. Az elsődleges tenyészeteket a sejteket gyűjtöttünk a betegek peritoneális mosófolyadékot és az ascites (NSC-16C, NSC-20C, és az NSC-22c), és tenyésztjük olyan RPMI-1640 tápközegben, amelyet 10% magzati borjúszérummal.

Microarray analízis

teljes RNS-60As6, 60As6Luc, HSC-60, és a HSC-60Luc sejteket izoláltuk szuszpendáljuk a sejteket egy ISOGEN lízispufferben (Nippon Gene, Toyama, Japán), majd izopropanolos kicsapással. Végeztünk microarray elemzések kétszer használva Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Az eljárások szerint végeztük a beszállítók protokollokat. A rácsok szkennelésre GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), és az adatokat elemeztük microarray Suite verzió 5.0 Affymetrix alapértelmezett elemzési beállításokat és a globális skálázás a normalizációs módszer. A csonkolt átlag cél intenzitása minden egyes tömb önkényesen állítva 1000. Minden microarray adatok kerültek letétbe helyezett egy MIAME kompatibilis adatbázist, GEO; hozzáférési szám GSE53276. Egy 2-szeres változást, 684 géneket kiválasztott specifikus gének 60As6 és 60As6Luc sejtek és 1150 géneket választottunk ki a HSC-60 és a HSC-60Luc sejtekben.

Állatkísérletek

Six hetes nőstény C.B17 /ICR-SCID (SCID /SCID) egerekbe (CLEA Japán, Japán) tenyésztették szobahőmérsékleten egy 12 órás világosság /sötétség napi ciklusban. Az egereket alatt tartjuk, specifikus patogén-mentes körülmények között, és feltéve, steril élelmiszer, víz, és ketrecek. 1 × 10 ^{4-1 × 10 6 rákos sejtet szuszpendáltunk 1 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS), majd injektáltunk a hasi üreg felhasználásával egy 26 1/2-es méretű injekciós tűt. Az egereket lemérjük és hetente mérni. Kíméletes végpont kritériumok közé jelentős felhalmozódása hasi ascites, légszomj, piloerectio, vérszegénység, vagy fogyás 10% -át meghaladó kezdeti tömeg. Valamennyi kísérletet összhangban etikai irányelvek a Nemzetközi Szövetség a tanulmány a fájdalom és hagyta jóvá a Bizottság Etikai Kísérleti National Cancer Center. Erőfeszítéseket tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a számok és szenvedését felhasznált állatok a kísérletekben.}

RT-PCR-

Teljes RNS-t izoláltunk szuszpendáljuk a sejteket egy ISOGEN lízis pufferrel, majd izopropanolos kicsapással. Fél-kvantitatív RT-PCR-t végeztünk a lineáris tartományban 25-30 ciklusnál MUC5AC katalógusa, CXCR4 katalógusa, CXCR7 katalógusa, CXCL12 katalógusa, LGR5 katalógusa, TGFBR1 katalógusa, TGFBR2 katalógusa, és ACTB katalógusa segítségével következő primerek: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'és 5' GTTGTCCACATGGCTGTT-3 "a MUC5AC katalógusa, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 'és 5' AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 'a CXCR4 katalógusa, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' és 5 'ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3' számára CXCR7 katalógusa, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'és 5' AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3 'a CXCL12 katalógusa, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3' és 5 'CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' a LGR5 katalógusa, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'és 5' GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3 'a TGFBR1 katalógusa, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3' és 5 'GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' a TGFBR2 katalógusa, és az 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'és 5' GCACGAAGGCTCATCATTCA-3 'a ACTB katalógusa.

immuncitokémiája katalógusa

indirekt fluoreszcens immunhisztokémia végeztünk CXCR4, MUC5AC és Smad2 /3 növesztett sejtek 4 lyukas kamra lemezek. A sejteket fixáltuk 4% paraformaldehiddel, szobahőmérsékleten 20 percig. Miután háromszor mostuk PBS-ben (-), ezek inkubáltuk anti-humán CXCR4 monoklonális ellenanyaggal (R &D Systems, Minneapolis, MN), anti-humán MUC5AC antitesttel (Santa Cruz, Biochemistry, Santa Cruz, CA), vagy anti- emberi Smad2 /3 antitestet (BD Biosciences, Bedford, MA), majd inkubálás 1: 1000 hígítású szamár anti-egér Alexa 488 konjugált szérumot (Invitrogen, Grand Island, NY), 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Sejtmagok megfestettük 4 ', 6-diamino-2-fenil-dihidroklorid (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sejt-sejtvonal vizsgálatban rendezve egyetlen CXCR4 ^{+ kis sejteket festettük CellTracker Green (Invitrogen) felkutatására sejtek életképességét. Katalógusa}

Áramlási citometria és sejtszortírozás katalógusa

60As6 sejteket (1 × 10 ^{6 sejt) együtt inkubáltuk 30 percig 4 ° C-on a következő antitestek: APC antihumán CD184 (CXCR4) (IgG2a, klón 12G5), vagy az APC egér IgG2a, K izotípus kontroll nyert BioLegend ( San Diego, CA). Az elpusztult sejteket jelzett propidium-jodiddal és kizártuk az elemzésből. A cella válogatás, a CXCR4-pozitív és CXCR4-negatív szubpopulációk megtisztítjuk, egy JSAN sejtválogató (BAY Bioscience, Kobe, Japán), és analizáltuk egy szoftver, FlowJo (Fa Star, Inc., Ashland, OR). Sejtciklus elemzések, a sejteket szérummentes tápközegben 5 napig, majd ezt követően betakarított 0,05% tripszin-EDTA, majd szuszpendáljuk a hideg 80% -os etanollal. A rögzítés után egy éjszakán át -20 ° C-on, a mintákat PBS-ben mostuk (-), és inkubáljuk 500 ni a PI /RNáz Staining Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA) per 1 × 10 6 sejt 30 percen át szobahőmérsékleten elemzés előtt. Áramlási citometria alkalmazásával végeztük FACSCalibur (bd, Franklin Lakes, NJ), és elemezzük egy szoftver, FlowJo.}

rögzítéstől független sejtnövekedési vizsgálati eljárás

lágy agar telepképző assay végeztük a CytoSelect 96-Well Cell Transformation vizsgáló Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) követve a gyártó utasításait. Röviden, 5 × 10 ^{3 CXCR4-pozitív vagy CXCR4-negatív kis sejtek DMEM-ben szuszpendáltuk, amely 0,4% -os alacsony olvadáspontú agarózt és 10% FBS-t és oltunk 1% alacsony olvadáspontú agaróz tartalmazó DMEM-ben és 10% FBS-t. Inkubálás után a sejteket 5 napon át 37 ° C-on, 5% CO _{2, a sejteket lizáltuk, és detektáljuk CyQuant GR festék. A fluoreszcencia a kolónia képző sejtek olvastuk Multifunkcionális Microplate Reader (Safire, Tecan, Mannedorf, Svájc) a gerjesztési /emissziós hullámhossz a 485/520 nm. Katalógusa}}

Invasion assay katalógusa

Cell invázió alkalmazásával határoztuk meg a BD BioCoat tumorinvázió Assay System (BD Biosciences) utasításai szerint a gyártó. Röviden, 4 × 10 ^{5. 60As6 sejtek szérummentes közegben beoltunk a felső kamrába a rendszer. Aljú lyukaiban tele voltak média 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Az elegyet 24 órás inkubálás után a sejteket a felső kamrában eltávolítottuk, és a sejteket, hogy betört a Matrigel membránon megfestettük Diff-Quick festékkel (BD Biosciences) és megszámoltuk manuálisan.}

Caspase assay

A 60As6 sejteket állítottunk elő egy 96 lyukú lemez (5 × 10 ^{3 sejt /mérőhely). A kaszpáz 3/7 vizsgálatot végeztünk kaszpáz-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI) 24 órával a hozzáadása után a rekombináns TGF-β1 (240-B, R &D rendszerek) az a sejttenyészethez koncentrációban 2 ng /ml.}

sejtnövekedési vizsgálati

Annak meghatározására, IC _{50 értékek ellen docetaxel (DOC), mind a HSC-60 és a 60As6 sejteket jelenlétében 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokió, Japán) kevertetjük 4 napon át 37 ° C-on, 5% CO 2 majd a hagyományos MTT assay. Hitelesítésére vonatkozó kombinált kezelés Doc és TGF-β, mind 60As6 sejtek és 2 primer tenyészetek (NSC-16C és -22 ° C) állítunk elő a 6-lyukú lemez (1 × 10 ^{5 sejt /lyuk), majd egy kezelés Doc (2,5 nM) és a TGF-β1 (0 vagy 2 ng /ml) 72 órán át 37 ° C-on, 5% CO 2. A sejteket festjük tripánkék és megszámoltuk a TC20 automatizált sejtszámláló (Bio-Rad, Hercules, CA).}}

Statisztikai analízis

Minden adatot fejeztük átlag ± SE, és segítségével analizáltuk a páratlan t-teszt. Az elfogadott szignifikanciaszint p katalógusa < 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) alkalmaztunk az összes statisztikai elemzések. Katalógusa

Eredmények katalógusa

fenotípusos különbségeket a szülői HSC-60 sejtek és a magasan tumorképző alvonalát 60As6 sejtek katalógusa

foglalkozik a jelenség a diffúz típusú GC-asszociált PD szemszögéből molekuláris és a sejtbiológia, létrehoztunk egy nagyon hashártya-metasztatikus sejtvonal 60As6, egy diffúz típusú GC eredetű sejtvonal, HSC-60, a in vivo
választás álló ortotopikus beoltása a tumorsejtek és a szigetelés a magasan metasztatikus azok a hasvízkór immunhiányos egerekben [25]. Bár a duplájára ideje két sejtvonalak hasonló volt (30 hr HSC-60 és 31 óra az 60As6) in vitro katalógusa, 60As6 kialakult sejtek több tumorcsomók gyorsabban intraperitoneális beoltás be az egerekbe. A medián túlélési idő 167 nap volt, a beültetés után 5 × 10 ^{6 HSC-60 sejtek, míg a beültetés azonos számú 60As6 sejtek eredményezett jelentős kialakulását véres ascites, és a medián túlélési idő csak 28 nap. Lehorgonyzástól függetlenség szükséges lehet a túlélés a szabad rákos sejtek a hasüregbe és a kolonizáció. A telepképző assay, 60As6 kialakult sejtek sokkal több kolónia képest HSC-60 sejtek (S1 ábra) azt mutatja, hogy 60As6 rendelkezik egy nagy képessége rögzítéstől független növekedését. Mi érvényesítette kemorezisztenciájának is ismert, mint a fő tulajdonsága, CSC. A sejteket jelenlétében tenyésztjük docetaxel (DOC), amely egy gyakran alkalmazott rákellenes gyógyszer kezelésére GC betegeknél. 60As6 mutatott 6-szor magasabb IC _{50-értéke Doc képest, hogy a HSC-60 (52 nM és 8,4 nM, sorrendben) (S2 ábra). Ezek az adatok azt jelzik, hogy 60As6 szerzett magas kemorezisztens fenotípus. Továbbá a morfológiája HSC-60 sejtek, jellemzői a lapos és a nagy, míg a 60As6 sejtek félig úszó és kicsi, ami hasonló a morfológia gyakran megfigyelt CSC (S3 ábra). Mi a következő vizsgált lipid tutajok helyének a kolera toxin B alegység (CtxB), mint a lipid raft marker, hiszen azt már beszámolt arról, hogy a lipid raft klaszter dúsított vérképző őssejtek [29]. Felhalmozódását a fluoreszkáló CixB volt megfigyelhető 60As6 sejtekben azonban nem HSC-60, ami arra utal, a másik CSC-szerű ingatlan a volt sejtek (S3 ábra). Katalógusa}}

Annak felmérése közötti biológiai különbségek HSC-60 és 60As6 sejtek, összehasonlítottuk génexpressziós profilok microarray (S1 táblázat). Leszabályozza három gyomor pit sejt-differenciálódási markerek ( MUC5AC katalógusa, MUC1 katalógusa, és TFF1 katalógusa), és néhány citokeratin találtak 60As6. Ezzel szemben számos őssejtmarker ( LY75 katalógusa, CD44 katalógusa, GPNMB katalógusa, és CXCR4 katalógusa) is fokozódik ebben a sejtvonalban. Az expressziós profil arra utal, hogy 60As6 erős mesenchymalis fenotípus, amely jellemző az epithelialis sejtből származó CSC.

tovább vizsgáltuk a mRNS expressziója mindkét tipikus differenciálódási marker MUC5AC
[3 , 4] és egy metasztázis-asszociált kemokinreceptor CXCR4 katalógusa [30] RT-PCR-rel. Összhangban a microarray eredmények, MUC5AC katalógusa és CXCR4 katalógusa mRNS mutatott kölcsönösen kizáró kifejezést HSC-60 és 60As6 (1A ábra). A kemokinek SDF-1 által kódolt CXCL12 katalógusa ismert, hogy kötődik CXCR4 és annak rokon receptor CXCR7 [30]; Azonban az mRNS CXCL12
és a CXCR7
nem voltak kimutathatók bármelyik sejtvonalban. A kifejezés egyaránt MUC5AC és CXCR4 is megerősítette egy fehérje szinten immuncitokémiai festési (1B ábra). Így ezek az eredmények azt sugallják, hogy a HSC-60 sejtek Harbor tovább differenciálódott sejtek, mint a nem a 60As6 sejteket, amelyek többnyire álló differenciálatlan sejteket. Mindent összevetve, ezek a CSC-szerű jellemzőit 60As6 azt jelzik, hogy a differenciálatlan szubpopuláció magas tumorgenézisre és gyógyszer-rezisztencia lehet hatékonyan feldúsított szülői sejtek során in vivo katalógusa választás.

azonosítása és jellemzése gyomor CSC a 60As6 és primer tenyésztett sejtek katalógusa

a következőkben játszott szerepét vizsgálták CXCR4 diffúz típusú GC sejtek PD. Amint az 1A ábra, a receptor CXCR4
ben erősen expresszálódik 60As6 képest HSC-60, míg a ligandum CXCL12 /SDF1
nem volt mindkettő. Azonban meg kell jegyezni, hogy ez a ligandum ismert, hogy kell kifejezni peritoneális mesothelialis sejtek [31] és működni, mint egy kemokint indukálására távoli metasztázis útján történő kölcsönhatás CXCR4-et expresszáló rákos sejtek [30]. Ezért megvizsgáltuk, hogy vajon a CXCR4 szolgálhat egy marker azonosítására PD-asszociált CSC. A kifejezés a CXCR4 on 60As6 sejteken analizáltuk fluoreszcencia aktivált sejt (FACS) analízissel. Szerint a CXCR4 expresszióját és előre szórás minta, 60As6 sejtek mutattak heterogenitása, amely három különböző alpopulációk: I. CXCR4 ^{+ kis sejtek (15%), a II. CXCR4 - kis sejtek (65%), és a III. CXCR4 - nagy sejtek (20%) (ábra 1Ci). A sejteket ezután elválasztjuk az egyes szubpopuláció tisztaságú I: 97%, II: 99%, és a III: 54% -kal (ábra 1Cii-1Civ). Az alacsony válogatás tisztaságát CXCR4 - nagy sejtes szubpopuláció III tudható be szennyeződés összesített CXCR4 - kis sejtekben (1Civ, fekete-dobozos panel). Ezek közül három alcsoportra, csak egy CXCR4 - nagy sejtes szubpopuláció foglalt MUC5AC + differenciálódott sejtekben (1Civ, három külső panelek). Azáltal sejtnövekedés megfigyelés egyetlen sejt szintjén, azt találtuk, hogy a CXCR4 - kis sejtek szaporodtak, míg a CXCR4 - nagy sejtek nem mentek át a sejtosztódást még 3 nap után a kultúra (ábra 1D és S4 ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a CXCR4 - kis sejtek tranziens erősítő sejtek, míg a CXCR4 - nagy sejtek terminálisán differenciált sejtek.}

A válogatás után a két szubpopuláció (I és II), elemezzük bármely elmozdulás a sejtpopuláció (2A ábra); 7 nap után a kultúra. CXCR4 ^{+ kis sejtek megfelelő szubpopuláció generálva maguknak, CXCR4 - kis sejtek, és CXCR4 - nagy sejtek (11%, 62%, illetve 21% -kal), míg a CXCR4 - a kis sejtek megfelelő szubpopuláció II képesek voltak ad okot elsősorban magukat (80%), néhány nagy sejtek (17%), és nagyon kevés a CXCR4 + kis sejtek (2%). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CXCR4 + kis sejtek differenciálódását potenciál és termel CXCR4 - nagy sejtek esetleg egy szakasza CXCR4 - kis sejtek a rendszer a sejtek differenciálódása. Katalógusa}

Továbbá, CXCR4 ^{+ kis egyetlen sejt termelt egy kolóniát tartalmazó MUC5AC + differenciálódott sejtek 7 nap után a tenyészetben (2B ábra). Ezt a megállapítást támasztja alá a sejt-sejtvonal vizsgálatban együtt élő sejtfestési és immunfestésével MUC5AC (2C ábra). Ezen túlmenően, a CXCR4 + kis sejtekről kimutatták, hogy kifejezzék a magas szintű LGR5 katalógusa, amely ismert, mint a marker a gyomornyálkahártya őssejtek található a mirigy normális nyálkahártya [32] (ábra 2D ).}

Ezután azt érvényesíteni rögzítési függetlenség és a tumor-kezdeményező képességét a két kissejtes szubpopuláció (I és II). A telepképző assay, CXCR4 ^{+ kis kialakult sejtek sokkal több kolónia, mint volt a CXCR4 - a kis sejtek (3A ábra). Soros hígítás kísérletek hasűri beoltás immunhiányos egerekben kiderült, hogy CXCR4 + kis sejtek is rendelkezett magasabb tumorigenikus képesség (tumor kialakulásának 5/4 és 1/5 egerek esetén beoltása 10 5 és 10 4 sejtekben az), mint CXCR4 - a kis sejtek (1/10 és 0/10 egerekben 10 5 és 10 4 sejt esetében) (ábra 3Bi). Figyelemre méltó, hogy mind az öt daganatos egerekben beoltása után CXCR4 + kis sejtek már több tumorcsomók (ábra 3Bii), és kezdett kialakulni véres ascites 3 héten belül (ábra 3Biii). Katalógusa}

Ezen kívül diffúz típusú GC sejtvonalak, mi is betöltött szerepét vizsgáltuk CXCR4 klinikai mintában (NSC-20 ° C): primer kultúra alakult a hasvízkór diffúz típusú GC beteg PD. RT-PCR és immunhisztokémiai vizsgálatok során megerősítést nyert, hogy a primer kultúra kifejezni CXCR4 katalógusa de nem CXCR7 katalógusa (3C). Fontos megjegyezni, hogy CXCR4 ^{+ kis sejtek válogatva NSC-20C rendelkezett mind a repopulációs képesség (ábra 3Di és 3Dii) és nagy telepek kialakulása képesség (ábra 3Diii). Katalógusa}

bevonása a CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 tengely PD katalógusa

a másik hat diffúz típusú GC eredetű sejtvonalak (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 és KATO III), akkor tovább vizsgálta a kapcsolat a expressziós státus két CXCL12 /SDF-1 receptorok (CXCR4 és CXCR7) és a felhalmozási ascites beoltott egerek a rákos sejtek intraperitoneálisan. Az RT-PCR kísérletekben azt mutatta, hogy két GC sejtvonalak (HSC-39 és KATO III) erősen expresszálódik CXCR4 katalógusa (ábra 4A). Ezenkívül mindkét xenograftot hordozó egerek voltak többszörös tumor gócok és a felhalmozott ascites (ábra 4B). Ezzel szemben a másik két sejtvonal (HSC-44 és HSC-58) nem mutatott, vagy meglehetősen alacsony CXCR4 kifejezés, egyetlen vagy néhány peritoneális tumor göb, és nem halmozódik ascites (ábra 4B). Azt is megerősítette, a felhalmozási ascites másik nagyon hashártya-áttétes alvonalát 58As9 (származó HSC-58), amelyek kifejezett CXCR7 katalógusa magas szinten, de nem CXCR4 katalógusa. Egy kivételes eset volt 44As3 származik HSC44, hogy már több tumorcsomók és a felhalmozott ascites nélkül a kifejezés mindkét CXCR4 katalógusa és CXCR7 katalógusa. Összességében tehát azt találtuk magas korrelációt expressziós szintje CXCR4 katalógusa vagy CXCR7 katalógusa és az agresszív fenotípusok a nyolc sejtvonalak kivéve 44As3. Katalógusa

A klinikai gyakorlatban , peritoneális öblítéssel citológia (CY) nyújt fontos prognosztikai információkat GC betegek, mert lehet felismerni a "mag" a PD előtt makroszkopikus megnyilvánulása. Még abban az esetben nincs PD (P0), CY-pozitív betegek rossz a prognózisa [33], ami arra utal, hogy jó néhány metasztatikus CSC jelen vannak a peritoneális öblítéssel ezen betegek. Ezért a következő vizsgáltuk jelenlétében CXCR4 ^{+ GC sejtek hashártya mosások a betegek anélkül, hogy klinikailag ascites. CXCR4 katalógusa mRNS-t ritkán észlelt a mosásterméket 9 10 CY-negatív betegek; Azonban az mRNS-t detektáltunk a mosófolyadékot 19 34 CY-pozitív betegek (S5A ábra). Azt is megerősítette a jelenlétét a CXCR4 és citokeratin duplán pozitív kis GC sejtek a macskaköves alakú mesothelialis sejtek csatolt a kultúra edény felületét egy rövid távú (7 nap) kultúra a beteg ascites (S5B ábra). Kísérleteinkben a peritoneális mesothelial sejtek általában eltűnt hosszú távú kultúra után körülbelül egy hónap. Ilyen hosszú távú kultúra, azt is megállapította jelenlétében néhány CXCR4- vagy CXCR7-nagyon pozitív GC sejtek mutatott jellemzőket epithelialis-mesenchymalis átalakulás vimentinre (VIM) pozitív (nyíl fejét S5C ábra), de citokeratint (PAN )-negatív. Ezért CXCR4 + GC sejtek vannak jelen a rosszindulatú hasvízkór nem csak a korai szakaszában a peritoneális terjesztés (P0 /CY +), hanem inkább fokozatos szakaszában jellemző egy nyílt ascites felhalmozódása. Összegezve, a fenti kísérleti és klinikai bizonyítékok arra utalnak, hogy egy része a CXCR4 + vagy CXCR7 + GC sejtek képesek a fejlődő hashártya áttét. Katalógusa}

A következőkben megvizsgáltuk a funkcionális szerepe a CXCR4 jelátviteli PD. A kifejezés a CXCL12
/ az SDF-1
az emberi és egér peritoneális mesothelium igazoltuk RT-PCR (5A). Ezért bevonásával CXCL12 /SDF-1 sejtek invázióját vizsgáltuk. Ábrán látható az 5B, a számos invazív 60As6 sejtek drasztikusan nőtt az SDF-1, jelezve, hogy ezek a sejtek rendelkeznek a kemotaxis képessége, hogy az SDF-1. Lentivírus shRNS indukált kiütése CXCR4 a 60As6 legyengített SDF-1 által közvetített invázió, de nem befolyásolta a tumor göb kialakulását a hasüregbe egerek (nem látható). Sőt, kényszerű CXCR4 expresszióra szülői sejtvonalban HSC-60 sosem növelte a tumorképző (nem látható). Mindent összevetve, a mi az adatok azt sugallják, hogy a CXCR4 részt vesz a kötődés a hashártya, de nem a tumor góc kialakulása.

Kimutattuk vázlatosan folyamatok közvetlen PD származó gyomor fal előrehaladott GC keresztül a betegek közötti kölcsönhatás CXCR4 ^{+ vagy CXCR7 + CSC és az SDF-1-et kifejező hashártya (ábra 5C). Az első lépésben a metasztázis, a CXCR4 + CSC arra shed ki a gyomor fal a hasüregbe. Ezt követően ezeket a sejteket tulajdonítanak a alapmembrán (BM) a hashártya, válaszul a mesothelium-eredetű kemoattraktáns SDF-1 és megtelepedni alkotnak csomók. Ezek az események fordulnak elő, számos helyszínen át a hashártya felületére, így a blokád szivattyú-funkciót, majd a felhalmozódása a ascites. Katalógusa}

TGF-β elősegíti a sejtek differenciálódását /aszimmetrikus sejtosztódás CXCR4 ^{+ gyomor CSC}

TGF-β leírták, hogy csökkenti az oldalsó népesség bizonyos diffúz típusú GC sejtvonalak [34]. Ezért megvizsgáltuk, hogy a TGF-β potenciállal rendelkezik jellemzőinek módosításához CXCR4 ^{+ diffúz típusú GC sejteket. Mi először megvizsgálta az expressziós szintek a TGF-β receptorok 60As6 sejtekben és GC primer tenyészetek származó két független betegnél (NSC-16C és -22 ° C). RT-PCR kísérletek azt mutatták, hogy mind a két TGF-β-receptor gén ( TGFBR1
és a TGFBR2
) kifejezett összes ilyen sejtek (S6 ábra). Azt is megvizsgáltuk, a lokalizáció Smad2 /3, mivel ezek a transzkripciós faktorok széles körben ismert, hogy felhalmozódhatnak a magok, válaszul az aktiválás a TGF-β jelátvitel. Ábrán látható 6AI, a nukleáris felhalmozódása Smad2 /3 volt kimutatható 60As6 sejtekben után 30 perc kezelés 2 ng /ml TGF-β.}

következő vizsgáltuk, hogyan CXCR4 ^{+ GC sejtek által érintett aktiválás a TGF-β jelátvitel. Az RT-PCR kísérlet csökkenést mutatott CXCR4 katalógusa mRNS 60As6 TGF-β kezelés (ábra 6Aii). Áramlási citometria elemzés azt mutatja, hogy a TGF-β kezelés csökkenti CXCR4 + kis sejtek 6,3% -ról 0,4% -os és a CXCR4 - nagy sejtek 17,1% -ról 43,2% -ra (6B). Összhangban a növekedés véglegesen differenciálódott sejtek, a kaszpáz 3/7 az egész sejtpopulációt aktivált TGF-β kezelés (ábra a 6C). Ezért, a TGF-β lehet egy potenciális indukálni CXCR4 + CSC, hogy véglegesen differenciálódott sejteket. Mi tovább vizsgálták hatását a TGF-β a nyugalmi 60As6 sejtekben, minthogy CSC úgy gondolják, hogy létezik egy szunnyadó állapotban alatt hypovascularis állapotban. Miután szérum kimerülése 5 napig, a CXCR4 + kis sejtek megnövekedett akár 42% (ábra 6Di).}

• PLoS One: SIRT3 Javítja Glikolízis és elterjedése SIRT3 expresszáló gyomorkarcinóma Cells
• PLoS One: a mikro-RNS-137 Hozzájárul, hogy a nedves tumorképzésért Emberi gyomorkarcinóma által célzás Akt2