PLOS ONE: Identification et caractérisation de CXCR4-positive cancer gastrique souches Cells

Résumé

Diffuse de type tumeurs solides sont souvent composées d'une proportion élevée de rarement proliférantes (c.-à-sommeil) des cellules cancéreuses, ce qui indique fortement la implication des cellules souches cancéreuses (CSC) Bien que le cancer gastrique de type diffus (GC) patients ont un mauvais pronostic en raison du développement de haute fréquence de diffusion péritonéale (DP), il est une connaissance limitée que la CSCs PD-associé et l'efficacité des CSC- ciblage thérapeutique dans le type diffus GC. Dans cette étude, nous avons établi très métastatiques lignées de cellules GC par in vivo
sélection conçu pour l'enrichissement des cellules GC PD-associé. Par l'analyse des microréseaux, nous avons trouvé CXC type de récepteur de chimiokine 4 (CXCR4) peut être un nouveau marqueur pour CSCs hautement métastatiques, puisque les cellules CXCR4-positives peuvent pousser l'ancrage indépendamment, initier des tumeurs chez les souris, être résistant aux médicaments cytotoxiques, et produisent fille différenciée cellules. Dans des échantillons cliniques, ces cellules CXCR4 positifs ont été trouvés non seulement de stade tardif de métastases (ascitique accumulé), mais aussi l'étape précédente (lavages péritonéaux). En outre, le traitement par facteur de croissance transformant β renforcé l'effet anti-cancer du docétaxel par induction de la différenciation cellulaire division /cellulaire asymétrique des cellules souches cancéreuses gastriques CXCR4-positif même dans un état dormant. Par conséquent, les inducteurs de différenciation sont prometteurs pour obtenir le résultat thérapeutique maximale à partir actuellement disponibles médicaments anti-cancéreux par recyclage des CSCs

Citation:. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) Identification et caractérisation de CXCR4-positive cancer gastrique Cellules souches. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10.1371 /journal.pone.0130808

Editeur: Masaharu Seno, Université d'Okayama, JAPON

Reçu le 18 Février 2015; Accepté: 25 mai 2015; Publié le 25 Juin, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Fujita et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et. Toutes les données de puces à ADN ont été déposés dans une base de données compatible MIAME, GEO; numéro d'accession GSE53276

Financement:. Ce travail a été soutenu en partie par l'Institut national de l'innovation biomédicale (pour la recherche avancée sur les produits médicaux Programme minier ID10-41), le ministère de la Santé, du Travail et des Affaires sociales du Japon (pour la stratégie de 10 ans Troisième complète pour lutter contre le cancer H22-007), le Fonds national Cancer Research Center et le développement (25-A-6, 26-A-3). Drs T Fujita, M Tamaoki et T Nishimura sont les bénéficiaires d'un résident de bourses de recherche de la Fondation pour la promotion de la recherche sur le cancer au Japon

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

introduction

le cancer gastrique (GC) est l'une des principales causes de décès liés au cancer dans le monde entier. Histopathologique, glucocorticoïdes peuvent être classés en deux grandes catégories: de type intestinal et de type diffus. Type Intestinal GC prédomine dans les zones géographiques à haut risque et se développe à travers des étapes successives, y compris Helicobacter pylori
( H
. pylori
) -Associated gastrite atrophique, la métaplasie intestinale (IM), et la dysplasie. En revanche, de type diffus GC, qui représente la moitié de tous les patients du GC, a une large répartition géographique et développe même de H
. pylori
-free, muqueuse gastrique morphologiquement normale sans gastrite atrophique ou IM, et de type diffus GC peut être différent du type intestinal tant génétique et phénotypique [1-5]. A la différence de la fréquence décroissante du type intestinal, la prévalence du type diffus est aurait augmenté dans le monde [6]. Le pronostic pour les patients du GC de type diffus avancé est resté faible au cours de la dernière décennie en raison d'un taux élevé de diffusion péritonéale (DP) (78%) par rapport à celui de type intestinal (45%) [7]. En particulier, les patients de type Bormann IV GC ont un très mauvais pronostic, même si elles ont reçu un traitement multidisciplinaire [8]. Par conséquent, répondre PD est une question urgente pour améliorer le pronostic des patients de type diffus GC.

Diffuse type GCS sont généralement caractérisée par une fibrose extensive stromale avec une mauvaise vascularisation et proliférative rare ( i
. e.
dormants des cellules cancéreuses), ce qui conduit à une résistance thérapeutique substantielle. Du point de vue de la chimiothérapie, en transformant β du facteur de croissance (TGF-ß) a été pensé pour contribuer à la progression agressive par transition épithélio-mésenchymateuse et en induisant la fibrose [9]. Cependant, le TGF-β inhibe également la prolifération cellulaire, induit l'apoptose, et médie la différenciation des cellules épithéliales, ce qui suggère que les composants de la voie de signalisation TGF-β ont une activité suppressive de tumeur dans les tumeurs epitheliales [10, 11]. Bien que l'accumulation de preuves a démontré le rôle critique de TGF-β dans les cellules souches du cancer (SCC) biologie, il y a peu d'informations au sujet de son rôle dans le GCS de type diffus.

Il a été rapporté que chaque population de cellules tumorales montrer l'hétérogénéité fonctionnelle caractérisée par une prolifération distincte et la capacité de différenciation dans divers types de tumeurs [12]. Pour tenir compte de cette hétérogénéité tumorale, deux modèles ont été proposés: le modèle clonal d'évolution [13] et le modèle CSC [14]. Ce dernier modèle a reçu une grande attention, car il fournit une explication raisonnable pour la résistance à la chimiothérapie et la radiothérapie conventionnelle, dans laquelle CSCs repos ou lent cyclisme survivent, et les résultats dans la rechute de la tumeur éventuelle [15-17]. Par conséquent, les stratégies thérapeutiques pour cibler CSCs sont indispensables pour éradiquer la maladie résiduelle et pour prévenir la récidive non seulement GC, mais aussi d'autres cancers. En outre, avec un aperçu de courant dans les mécanismes cellulaires de la carcinogenèse, le potentiel métastatique des cellules tumorales est attribuée à des cellules souches cancéreuses, ce qui peut clonale initier la formation de tumeurs à des sites distants [18 19]. Bien qu'un certain nombre de molécules de surface cellulaire ont été proposés comme marqueurs du SCC dans une grande variété de tumeurs malignes humaines, il n'y a pas d'identification de marqueur pour CSCs PD-associé dans GCS [20-23]. Afin d'identifier de tels marqueurs, nous avons considéré la notion selon laquelle les tumeurs fonctionnellement et génétiquement hétérogène ont des mécanismes communs et intrinsèques de l'entretien de la tumeur en fonction du contexte d'un micro-environnement donné. En conséquence, nous avons supposé que les CSC devraient être définies fonctionnellement par des dosages bien validés tels que in vivo
transplantation. Dans de type diffus GC, nous avons d'abord mis l'accent sur la colonisation spécifiques péritoine des cellules et enrichi les CSCs PD-associé par répétitives in vivo
sélections [24, 25]. Ici, nous avons trouvé CXC type de récepteur de chimiokine 4 (CXCR4) peut être un marqueur pour les cellules souches cancéreuses gastriques PD-associés et a démontré que le TGF-β augmente l'efficacité des médicaments anti-tumorale par l'induction de la différenciation cellulaire /division cellulaire asymétrique dans le CXCR4 ^{+ population du SCC, même dans un état de dormance.}

les échantillons cliniques de Matériels et méthodes

les échantillons cliniques ont été fournis par le national Hospital Cancer Center (Tokyo, Japon) après avoir obtenu le consentement éclairé de chaque patient et l'approbation par le Conseil national Cancer Center Institutional Review (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

les lignées cellulaires et cultures primaires

Un humain lignée cellulaire GC, HSC-60 a été créé par un collaborateur en utilisant la procédure comme décrit précédemment [26]. Une lignée cellulaire hautement péritonéale métastatique, 60As6 a été établie à partir de HSC-60 en utilisant l'implantation de tissu orthotopique chez des souris SCID SCID /que brièvement suit: la tumeur xénogreffe de HSC-60 cellules a été transplanté dans la paroi gastrique d'une souris. Nous avons répété six cycles de récolte des cellules tumorales ascitiques et l'inoculation orthotopique de ces cellules. Ces deux lignées cellulaires ont été maintenues dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10% de sérum de veau foetal. Nous avons également établi deux lignées de cellules luciférase exprimant (HSC-60Luc et 60As6Luc). Six autres lignées cellulaires dérivées GC (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 et KATO III) ont également été maintenus dans les mêmes conditions. Parmi ces six, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, et 58As9 ont été établis par la procédure ci-dessus [27, 28], et KATO III a été obtenu à partir de American Type Culture Collection. Pour les cultures primaires, les cellules ont été recueillies à partir du péritoine lavages et ascite des patients (NSC-16C, NSC-20C, et NSC-22C) et cultivées dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10% de sérum de veau foetal.

analyse microarray

ARN total de 60As6, 60As6Luc, HSC-60, et les cellules HSC-60Luc a été isolé par mise en suspension des cellules dans un tampon de lyse ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japon), suivie par précipitation à l'isopropanol. Nous avons effectué des analyses de micropuce à deux reprises à l'aide de Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Les procédures ont été effectuées selon les protocoles des fournisseurs. Les tableaux ont été numérisés avec un scanner GeneChip 3000 (Affymetrix), et les données ont été analysées par Microarray Suite version 5.0 avec Affymetrix paramètres par défaut d'analyse et mise à l'échelle mondiale en tant que méthode de normalisation. L'intensité cible moyenne tronquée de chaque tableau a été fixé arbitrairement à 1000. Toutes les données de puces à ADN ont été déposés dans une base de données compatible MIAME, GEO; numéro d'accession GSE53276. Par un changement de 2 fois, 684 gènes ont été choisis comme gènes spécifiques pour les cellules 60As6 et 60As6Luc et 1150 gènes ont été sélectionnés pour les cellules HSC-60 et HSC-60Luc.

L'expérimentation animale

Six -Week-old C.B17 femelle /Icr-scid (SCID /SCID) (CLEA Japon, Japon) ont été élevés à une température ambiante avec un cycle quotidien 12 h lumière /obscurité. Les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques et ont fourni la nourriture, l'eau stérile, et les cages. 1 × 10 ^{4 pour 1 × 10 6 des cellules cancéreuses ont été mis en suspension avec 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) et ensuite injecté dans la cavité abdominale en utilisant une aiguille de 26 1/2-jauge. Les souris ont été pesés et mesurés chaque semaine. critères finaux Humane inclus accumulation significative de ascites abdominales, dyspnée, horripilation, une anémie ou une perte de poids supérieure à 10% du poids initial. Toutes les expériences ont été menées en conformité avec les directives éthiques de l'Association internationale pour l'étude de la douleur et ont été approuvés par le Comité pour l'éthique dans l'expérimentation animale du Centre national du cancer. Des efforts ont été faits pour minimiser le nombre et toute souffrance des animaux utilisés dans les expériences.}

RT-PCR

L'ARN total a été isolé par mise en suspension des cellules dans un tampon de lyse ISOGEN suivie par précipitation à l'isopropanol. Semi-RT-PCR quantitative a été réalisée dans la plage linéaire de 25 à 30 cycles pour MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, LGR5
, TGFBR1
, TGFBR2
et ACTB
en utilisant des amorces suivantes: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'et 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 'pour
MUC5AC, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3' et 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 '
CXCR4, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' et 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 ' CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'et 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'et 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'et 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'et 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' TGFBR2
et 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'et 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' pour ACTB
.

immunocytochimie

immunocytochimie immunofluorescence indirecte a été réalisée pour CXCR4, MUC5AC et Smad2 /3 sur des cellules cultivées dans des glissières de chambre 4 puits. Les cellules ont été fixées dans 4% de paraformaldehyde à la température ambiante pendant 20 min. Au bout de trois fois le lavage dans du PBS (-), elles ont été incubées avec un anticorps monoclonal CXCR4 anti-humain (R & D Systems, Minneapolis, MN), un anticorps MUC5AC anti-humain (Santa Cruz, Biochemistry, Santa Cruz, Californie) ou anti- Smad2 /3 anticorps humain (BD Biosciences, Bedford, MA), suivi d'une incubation avec une dilution 1: 1000 d'âne anti-souris, Alexa 488 sérum conjugué (Invitrogen, grand Island, NY) pendant 1 h à température ambiante. Les noyaux cellulaires ont été colorés avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pour le dosage cellulaire lignée, triés seule CXCR4 ^{+ petites cellules ont été colorées par CellTracker Green (Invitrogen) pour tracer les cellules viables.}

cytométrie de flux et de tri
cellules

cellules 60As6 (1 x 10 ^{6 cellules) ont été co-incubées pendant 30 min à 4 ° C avec les anticorps suivants: APC anti-humain CD184 (CXCR4) (IgG2a, le clone 12G5) ou APC de souris IgG2a, k isotype contrôle obtenu à partir BioLegend ( San Diego, CA). Les cellules mortes ont été marquées avec de l'iodure de propidium et exclues de l'analyse. Dans le tri de cellules, les sous-populations CXCR4-positives et CXCR4-négatifs ont été purifiés en utilisant un trieur de cellules JSAN (Bay Bioscience, Kobe, Japon), et ont été analysés par un logiciel, FlowJo (Arbre Star, Inc., Ashland, OR). Pour les analyses de cycle cellulaire, les cellules ont été transférées dans un milieu dépourvu de sérum pendant 5 jours, puis récoltées avec 0,05% de trypsine-EDTA, puis mis en suspension dans de l'éthanol à 80% froid. Après la fixation de la nuit à -20 ° C, les échantillons ont été lavés dans du PBS (-) et mises en incubation dans 500 pi de PI /RNase tampon de marquage (BD Pharmingen, San Diego, CA) pour 1 x 10 6 cellules pendant 30 min à la température ambiante avant l'analyse. La cytométrie en flux a été effectuée en utilisant FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ) et analysés par un logiciel FlowJo.}

indépendante de l'ancrage test de croissance cellulaire

Un test de formation de colonies sur gélose molle a été réalisée en utilisant le kit CytoSelect 96 puits de transformation des cellules Assay (cellulaires Biolabs, San Diego, CA) suivant les instructions du fabricant. En bref, 5 x 10 ^{petites cellules 3 CXCR4-positives ou CXCR4-négatif ont été mises en suspension dans DMEM contenant 0,4% de bas point de fusion d'agarose et 10% de FBS et ensemencées sur 1% d'agarose à bas point de fusion contenant DMEM et 10% de FBS. Après incubation des cellules pendant 5 jours à 37 ° C dans 5% de CO _{2, les cellules ont été lysées et détectées avec CyQuant GR colorant. La fluorescence de la formation de colonies de cellules a été lu dans Multifonctionnel lecteur de microplaques (Safire, Tecan, Mannedorf, Swizerland) à des longueurs d'ondes d'excitation /émission de 485/520 nm.}}

test d'invasion

L'invasion cellulaire a été déterminée en utilisant BD BioCoat Tumor Invasion Assay System (BD Biosciences) selon les instructions du fabricant. En bref, 4 × 10 ^{5 des cellules 60As6 avec des milieux sans sérum ont été ensemencées dans la chambre supérieure du système. puits de fond ont été remplis avec les médias avec 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Après 24 heures d'incubation, les cellules dans la chambre supérieure ont été enlevés et les cellules qui ont envahi à travers la membrane de Matrigel ont été colorées avec coloration Diff-Quick (BD Biosciences) et comptés manuellement.}

test de Caspase

Les cellules 60As6 ont été préparés dans une plaque de 96 puits (5 x 10 ^{3 cellules /puits). Le dosage de la caspase 7/3 a été effectuée en utilisant la caspase-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI) à 24 h après l'addition de TGF-β1 recombinante (240-B, R & D Systems) dans la culture cellulaire à une concentration de 2 ng /ml.}

tests de croissance cellulaire

Pour déterminer IC _{50 valeurs contre le docétaxel (Doc), les deux cellules HSC-60 et 60As6 ont été cultivées en présence de 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokyo, Japon) pendant 4 jours à 37 ° C dans 5% de CO 2 suivie par le test MTT classique. Pour valider le traitement de combinaison avec Doc et TGF-β, l'ensemble des cellules 60As6 et 2 cultures primaires (NSC-16C et -22C) a été préparé dans une plaque de 6 puits (1 x 10 ^{5 cellules /puits) suivie un traitement avec Doc (2,5 nM) et le TGF-β1 (0 ou 2 ng /ml) pendant 72 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2. Les cellules ont été colorées par le bleu trypan et comptées avec cellule TC20 automatisé Compteur (Bio-Rad, Hercules, CA).}}

L'analyse statistique

Toutes les données sont exprimées par la moyenne ± SE, et analysées à l'aide le test t apparié. Le niveau accepté d'importance était p
< 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) a été utilisé pour toutes les analyses statistiques.

Les résultats des différences phénotypiques entre les parents HSC-60 cellules et les cellules 60As6 de SUBLINE hautement tumorigène

Pour face au phénomène de type diffus GC-associé PD du point de vue de la biologie moléculaire et cellulaire, nous avons établi une ligne très péritonéale métastatique cellule, 60As6, à partir d'une lignée cellulaire dérivée de type diffuse GC, HSC-60, par in vivo
sélections consistant en une inoculation orthotopique de cellules tumorales et l'isolement de ceux qui sont très métastatiques à partir des ascites de souris immunodéficientes [25]. Bien que le temps de doublement de ces deux lignées cellulaires était comparable (30 h pour HSC-60 et 31 h pour 60As6) in vitro
, les cellules 60As6 formées de multiples nodules tumoraux plus rapidement après l'inoculation intrapéritonéale chez les souris. La durée médiane de survie était de 167 jours après l'implantation de 5 x 10 ^{6 HSC-60 cellules, alors que l'implantation du même nombre de cellules 60As6 a donné lieu à une formation remarquable de ascite sanglante et la durée de survie médiane était de seulement 28 jours. Anchorage-indépendance peut être nécessaire pour la survie des cellules cancéreuses libres dans la cavité péritonéale et pour la colonisation. Dans dosage de formation de colonies, les cellules 60As6 formées beaucoup plus de colonies par rapport à HSC-60 cellules (S1 Fig) montrant que 60As6 possède une forte capacité de croissance indépendante de l'ancrage. Nous avons validé la chimiorésistance aussi connu comme une propriété importante de CSCs. Les cellules ont été cultivées en présence de docétaxel (Doc), qui est un médicament anti-cancer fréquemment utilisé pour le traitement des patients atteints de GC. 60As6 a montré une fois supérieur 6 IC _{50 valeur du Doc par rapport à celle des SH-60 (52 nM et 8,4 nM, respectivement) (figure S2). Ces données indiquent que 60As6 a acquis un phénotype chimiorésistance élevé. En outre, la morphologie des cellules HSC-60 a été caractérisé comme plat et large, alors que celle des cellules était 60As6 semi-flottant et petite, ce qui est similaire à la morphologie souvent observée pour les cellules souches cancéreuses (S3) Fig. Nous avons ensuite examiné la localisation des radeaux lipidiques à l'aide du choléra sous-unité B de la toxine (CtxB) comme marqueur lipidique radeau, étant donné qu'il a déjà été signalé que les grappes de radeaux lipidiques ont été enrichies en cellules souches hématopoïétiques [29]. Une accumulation de la fluorescence ctxB a été observée pour les cellules 60As6 mais pas dans HSC-60, ce qui suggère une autre propriété du SCC comme pour les anciennes cellules (S3 Fig).}}

Pour évaluer les différences biologiques entre HSC-60 et 60As6 des cellules, nous avons comparé les profils d'expression génétique par analyse de puces à ADN (S1 tableau). La régulation de trois marqueurs de cellules de différenciation fosse gastrique ( MUC5AC
, MUC1
et TFF1
) et quelques cytokératines ont été trouvés dans 60As6. En revanche, plusieurs marqueurs de cellules souches ( LY75
, CD44
, GPNMB
et CXCR4
) ont été surexprimés dans cette lignée cellulaire. Le profil d'expression suggère que 60As6 a un phénotype mésenchymateuses forte, ce qui est une caractéristique de CSCs dérivées de cellules épithéliales.

Nous avons également étudié l'expression de l'ARNm de la fois un marqueur de différenciation typique MUC5AC
[3 , 4] et un récepteur de chimiokine associée à des métastases CXCR4
[30] par RT-PCR. En fonction des résultats de puces à ADN, MUC5AC
et CXCR4 de ARNm a montré une expression mutuellement exclusive dans HSC-60 et 60As6 (Fig 1A). A chimiokine SDF-1 codée par CXCL12
est connu pour lier CXCR4 et son récepteur apparenté CXCR7 [30]; cependant, l'ARNm de CXCL12
et CXCR7
n'ont pas été détecté dans la lignée cellulaire. L'expression des deux MUC5AC et CXCR4 a également été confirmé à un niveau de protéine par coloration immunocytochimique (figure 1B). Ainsi, ces résultats suggèrent que les cellules HSC-60 hébergent des cellules plus différenciées que ne le font les cellules 60As6, qui sont principalement composées de cellules indifférenciées. Pris ensemble, toutes ces caractéristiques CSC-comme de 60As6 indiquent que la sous-population indifférenciée avec une forte tumorigénicité et la résistance aux médicaments pourrait être efficacement enrichie de cellules parentales pendant in vivo
sélections.

Identification et la caractérisation des cellules souches cancéreuses gastriques dans 60As6 et des cellules en culture primaire

Nous avons ensuite examiné le rôle de CXCR4 dans les cellules du GC de type diffus pour PD. Comme cela est représenté sur la figure 1A, le récepteur
CXCR4 a été fortement exprimé dans 60As6 par rapport HSC-60, alors que leur ligand CXCL12 /SDF1
n'a pas été dans les deux. Cependant, il est à noter que ce ligand est connu pour être exprimé dans des cellules mésothéliales péritonéales [31] et pour fonctionner comme une chimiokine pour induire des métastases à distance par le biais d'une interaction avec les cellules cancéreuses exprimant CXCR4 [30]. Par conséquent, nous avons examiné si CXCR4 pourrait servir de marqueur pour identifier CSCs PD-associé. L'expression de CXCR4 sur des cellules 60As6 a été analysée par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Selon l'expression de CXCR4 et le modèle de diffusion vers l'avant, les cellules 60As6 présentaient une hétérogénéité composée de trois sous-populations différentes: I. CXCR4 ^{+ petites cellules (15%), II. CXCR4 - de petites cellules (65%), et III. CXCR4 - grandes cellules (20%) (figure 1Ci). Les cellules ont ensuite été séparées à chaque sous-population avec une pureté de I: 97%, II: 99% et III: 54%, respectivement (figure 1Cii-1Civ). La faible pureté de tri du CXCR4 - grande sous-population de cellules III était attribuable à la contamination par des agrégée CXCR4 - de petites cellules (Fig 1Civ, panneau noir-encadré). Parmi ces trois sous-populations, seule une CXCR4 - grande sous-population de cellules contenait MUC5AC + cellules différenciées (Fig 1Civ, trois panneaux extérieurs). Par la surveillance de la croissance des cellules dans un niveau de la cellule unique, il a été constaté que CXCR4 - de petites cellules prolifèrent, tandis que le CXCR4 - grandes cellules ne subissent pas la division cellulaire, même 3 jours après la culture (Fig 1D et S4 Fig). Ces résultats suggèrent que CXCR4 - de petites cellules sont des cellules d'amplification transitoire, tandis que le CXCR4 - grandes cellules sont des cellules en phase terminale différencié}

Après le tri des deux sous-population (I et II), nous analysons. tout changement de la population de cellules (figure 2A); Après 7 jours de culture. CXCR4 ^{+ petites cellules correspondant à la sous-population I se généré, CXCR4 - de petites cellules, et CXCR4 - grandes cellules (11%, 62% et 21%, respectivement), tandis que CXCR4 - petites cellules correspondant à la sous-population II ont pu donner lieu principalement à eux-mêmes (80%) avec quelques grandes cellules (17%) et très peu CXCR4 + petites cellules (2%). Ces résultats suggèrent que CXCR4 + de petites cellules ont un potentiel de différenciation et produisent CXCR4 - grandes cellules éventuellement par une étape de CXCR4 -. Petites cellules dans le schéma de la différenciation des cellules}

En outre, un CXCR4 ^{+ petits cellule unique produit une colonie contenant MUC5AC + cellules différenciées après 7 jours de culture (figure 2B). Cette constatation a été soutenue par un dosage cellulaire lignée combinée avec la coloration de cellules vivantes et immunocoloration de MUC5AC (Fig 2C). En outre, CXCR4 + petites cellules se sont révélées exprimer un niveau élevé de LGR5
, qui est connu comme un marqueur de cellules souches épithéliales gastriques situées à la glande de la muqueuse normale [32] (figure 2D ).}

ensuite, nous avons validé l'indépendance d'ancrage et de la capacité des deux petits sous-population de cellules (I et II) tumeur d'initiation. Dans l'essai de formation de colonies, des cellules CXCR4 ^{+ petites colonies formées beaucoup plus que ne le font CXCR4 - petites cellules (figure 3A). expériences de dilution en série de l'inoculation intrapéritonéale chez des souris immunodéficientes ont révélé que CXCR4 + de petites cellules possédait aussi une plus grande capacité tumorigène (développement de tumeurs chez 4/5 et 1/5 souris sur l'inoculation de 10 5 et 10 4 cellules, respectivement) comparés avec CXCR4 - de petites cellules (1/10 et 0/10 souris après 10 5 et 10 4 cellules, respectivement) (figure 3BI). Notamment, tous les cinq souris porteuses de tumeurs après l'inoculation de CXCR4 + de petites cellules avaient de multiples nodules tumoraux (Fig 3Bii), et a commencé à développer une ascite sanglante dans les 3 semaines (Fig 3Biii).}

En plus de des lignées de cellules GC-type diffus, nous avons également étudié le rôle de CXCR4 dans un échantillon clinique (NSC-20C): une culture primaire établie à partir de l'ascite d'un patient GC de type diffus parkinsoniens. Dans RT-PCR et des expériences de immunocoloration, il a été confirmé que la culture primaire express CXCR4
mais pas (figure 3C)
CXCR7. Surtout, CXCR4 ^{+ petites cellules triées de NSC-20C possédaient à la fois une capacité de repopulation (Fig 3Di et 3Dii) et une capacité de formation de haute colonie (figure 3Diii).}

Implication du CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 axe PD

dans six autres lignées cellulaires dérivées GC de type diffus (CSH-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 et KATO III), nous avons encore étudié la relation entre la le statut d'expression de deux CXCL12 /SDF-1 (récepteurs CXCR4 et CXCR7) et l'accumulation d'ascites chez les souris inoculées avec les cellules cancéreuses intrapéritonéale. Les expériences de RT-PCR a révélé que deux lignées de cellules GC (HSC-39 et KATO III) fortement exprimés (figure 4A)
CXCR4. Par ailleurs, deux de ces souris avaient des xénogreffes nodules tumoraux multiples et ascites accumulées (figure 4B). En revanche, les deux autres lignées cellulaires (HSC HSC-44 et-58) ne présentaient aucun ou très faible expression de CXCR4, un nodule de la tumeur peritoneale simple ou peu et ne pas accumuler ascite (figure 4B). Nous avons également confirmé l'accumulation d'ascite dans un autre sous-lignée hautement péritonéale métastatique 58As9 (dérivé de HSC-58) qui a exprimé CXCR7
à un niveau élevé, mais pas CXCR4
. Un cas exceptionnel a été 44As3 dérivé de HSC44 qui avait de multiples nodules tumoraux et ascites accumulées sans l'expression à la fois CXCR4
et CXCR7
. Dans l'ensemble, nous avons trouvé une forte corrélation entre le niveau d'expression de CXCR4
ou CXCR7
et les phénotypes agressifs dans sept des huit lignes de cellules sauf 44As3.

Dans la pratique clinique , cytologie lavage péritonéal (CY) fournit une information pronostique important pour les patients du GC, car il peut détecter la «semence» de PD avant sa manifestation macroscopique. Même dans les cas sans PD (P0), les patients CY-positifs ont un mauvais pronostic [33], ce qui suggère que bon nombre CSCs métastatiques sont présents dans le lavage péritonéal de ces patients. Par conséquent, nous avons ensuite étudié la présence de CXCR4 ^{+ cellules GC dans le lavage péritonéal des patients sans ascite cliniquement apparentes. CXCR4 de l'ARNm a été rarement détectée dans les lavages dans 9 des 10 patients CY-négatifs; Cependant, l'ARNm a été détecté dans le liquide de lavage dans 19 des 34 patients CY-positifs (S5A) Fig. Nous avons également confirmé la présence du CXCR4 et les cellules cytokératine GC petits double positifs sur les cellules mésothéliales en forme de pavé-attachées à la surface de la boîte de culture dans un court terme (7 jours) la culture des ascites du patient (S5B Fig). Dans nos expériences, les cellules mésothéliales péritonéales disparu généralement dans la culture à long terme après environ un mois. Dans une telle culture à long terme, nous avons également constaté la présence de certains CXCR4 ou cellules GC CXCR7 hautement positifs qui ont montré une caractéristique de la transition épithéliale-mésenchymateuse, vimentine (VIM) (tête de flèche dans S5C Fig) -positif mais cytokératine (PAN )-négatif. Par conséquent, CXCR4 Les cellules + GC sont présents dans les ascites malignes non seulement dans le stade précoce de la diffusion péritonéale (P0 /CY +) mais aussi dans des stades plus progressive caractérisée par une accumulation d'ascite manifeste. En somme, la preuve expérimentale et clinique ci-dessus suggère qu'une partie de CXCR4 + ou CXCR7 cellules + GC ont un potentiel de développement de métastases péritonéales.}

Nous avons ensuite étudié le rôle fonctionnel du CXCR4 la voie de signalisation dans la MP. L'expression de la CXCL12
/ SDF-1
dans le mésothélium péritonéal humain et de souris a été confirmée par RT-PCR (figure 5A). Par conséquent, on a étudié l'implication de CXCL12 /SDF-1 pour l'invasion des cellules. Comme cela est représenté sur la figure 5B, le nombre de cellules invasives 60As6 a été considérablement augmentée par SDF-1, ce qui indique que ces cellules ont la capacité de chimiotaxie à SDF-1. knock-down lentivirus shRNA induite de CXCR4 dans 60As6 atténué invasion SDF-1 médiée mais pas affecté la formation de nodules de tumeur dans la cavité péritonéale de souris (non représenté). En outre, l'expression forcée de CXCR4 dans une lignée cellulaire parentale HSC-60 n'a jamais augmenté la tumorigénicité (non représenté). Pris ensemble, nos données suggèrent que le CXCR4 est impliqué dans la pièce jointe au péritoine, mais pas dans la formation de nodule de la tumeur.

Nous montré schématiquement les processus de PD directe de la paroi gastrique chez les patients du GC avancés par l'interaction entre CXCR4 ^{+ ou CXCR7 + CSCs et le péritoine SDF-1 exprimant (Fig 5C). Lors de la première étape de métastases, le CXCR4 + CSCs ont été versé sur la paroi gastrique dans la cavité péritonéale. Par la suite, ces cellules se fixent à la membrane basale (BM) du péritoine en réponse à la chimio-attractif mésothélium dérivé SDF-1 et colonisent pour former des nodules. Ces événements se produisent dans de nombreux sites sur la surface péritonéale, ce qui entraîne un blocage de la pompe-fonction, puis dans l'accumulation de l'ascite.}

TGF-β favorise la différenciation cellulaire /division cellulaire asymétrique de CXCR4 +

TGF-β de cellules souches cancéreuses gastriques a été rapporté pour diminuer la population de côté de certaines lignées de cellules GC de type diffus [34]. Par conséquent, nous avons examiné si le TGF-β a un potentiel de changer les caractéristiques de CXCR4 ^{+ Les cellules GC de type diffus. Nous avons d'abord examiné les niveaux de récepteurs de TGF-ß expression dans les cellules 60As6 et GC cultures primaires dérivées de deux patients indépendants (NSC-16C et -22C). des expériences de RT-PCR ont montré que les deux gènes du récepteur de TGF-β ( TGFBR1
et TGFBR2
) exprimé dans l'ensemble de ces cellules (S6) Fig. Nous avons également étudié la localisation de SMAD2 /3, étant donné que ces facteurs de transcription sont largement connus pour s'accumuler dans le noyau en réponse à l'activation de la signalisation du TGF-β. Comme on le voit sur la figure 6Ai, l'accumulation nucléaire de SMAD2 /3 a été détectée dans les cellules 60As6 après un traitement de 30 minutes avec 2 ng /ml de TGF-β.}

Nous avons ensuite étudié la façon dont CXCR4 ^{+ cellules GC sont affectée par l'activation de la signalisation du TGF-β. L'expérience de RT-PCR a montré une diminution de CXCR4 de l'ARNm dans 60As6 par traitement TGF-β (figure 6Aii). Cytométrie de flux des analyses révèlent que le traitement TGF-β diminue CXCR4 + de petites cellules de 6,3% à 0,4% et d'augmenter CXCR4 - grandes cellules de 17,1% à 43,2% (figure 6B). Conformément à une augmentation des cellules différenciées en position terminale, la caspase 7/3 dans l'ensemble de la population cellulaire a été activé par traitement du TGF-β (figure 6C). Par conséquent, le TGF-β peut avoir un potentiel d'induire CXCR4 + CSCs à des cellules différenciées. Nous avons étudié davantage l'effet du TGF-β sur les cellules 60As6 de repos, puisque CSCs sont pensés pour exister dans un état dormant sous une condition hypovascularisée. Après épuisement de sérum pendant 5 jours, le CXCR4 + petites cellules a augmenté jusqu'à 42% (figure 6DI).}

• PLOS ONE: SIRT3 Améliore la glycolyse et la prolifération dans les cellules du cancer gastrique SIRT3-Exprimer
• PLOS ONE: microARN-137 Contribue à antivibratoires tumorigenèse dans le cancer gastrique humain par ciblage AKT2