Plos ONE: Identifikacija in karakterizacija CXCR4-Pozitivni Rak želodca Stem Cells

Povzetek

Razpršeni tipa tumorji so pogosto sestavljeni iz velikega deleža redko razraščajo (tj, v mirujočem stanju) rakavih celic, močno kaže na to vključenost rakavih matičnih celic (FT) Čeprav difuzna tipa raka želodca (GC) da imajo pacienti slabo prognozo zaradi visokih pogoste razvoj peritonealne razširjanja (PD), je omejeno znanje, ki je-PD povezana CSCS in učinkovitosti CSC- ciljanje terapijo difuzna tipa GC. V tej študiji smo ugotovili visoko metastaznih linij GC celico z vivo
izbiri namenjen za obogatitev-PD povezana GC celic. Z analizo mikromrež smo ugotovili CXC vrsto kemokin receptor 4 (CXCR4) lahko nov označevalec visoko metastaznimi CSCS, saj lahko CXCR4-pozitivne celice rastejo sidrišče, neodvisno sproži tumorjev pri miših, so odporne proti citotoksičnega zdravila in proizvajajo diferencirane hčerko celice. V kliničnih vzorcev, so bili ti CXCR4-pozitivne celice najdemo od ne le prepozno metastaz fazi (nabrali ascitesa), ampak tudi zgodnejši fazi (peritonealno sprane). Poleg tega je zdravljenje z transformirajoči rastni faktor-P izboljšan učinek proti raku docetaksela preko indukcije celične diferenciacije /delitve asimetrične celic želodca CSCS CXCR4 pozitivni tudi v mirujočem stanju. Zato je razlikovanje spodbujevalci držite obljubo za pridobitev najvišjega terapevtski izid iz trenutno razpoložljivih zdravil proti raku s ponovno kroženje CSCS

Navedba. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T et al. (2015) Identifikacija in karakterizacija CXCR4-Pozitivni Rak želodca matične celice. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10,1371 /journal.pone.0130808

Urednik: Masaharu Seno, Okayama University, Japonska

Prejeto: 18. februar 2015; Sprejeto: 25. maj 2015; Objavljeno: 25. junij 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek. Vsi podatki mikromrež so shranjeni v skladnih podatkovni bazi MIAME, GEO; Število pristop GSE53276

Financiranje:. To delo je bilo delno pa jo Nacionalni inštitut za biomedicinsko inovacije (za Advanced Research za medicinske izdelke Mining program ID10-41), Ministrstvo za zdravje, delo in socialne zadeve Japonske (za tretje celoviti 10-letne strategije za boj proti raku za nadzor H22-007), National Cancer Center raziskovalnega in razvojnega sklada (25-A-6, 26-A-3). Drs T Fujita, M Tamaoki in T Nishimura so prejemniki raziskovalnega Resident štipendijo Fundacije za promocijo raziskave raka na Japonskem

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je eden od glavnih vzrokov smrti, povezanih z rakom po celem svetu. Histopathologically lahko GK se razvrstijo v dve glavni kategoriji: črevesne tipa in difuznega tipa. Črevesne tipa GC prevladuje v geografskih območjih z visokim tveganjem in razvija skozi nekaj zaporednih stopnjah, vključno s Helicobacter pylori
( H
. pylori
) -associated atrofični gastritis, intestinalno metaplazijo (IM), in displazija. Nasprotno, difuzna tipa GC, ki predstavlja polovico vseh bolnikov GC, ima široko geografsko porazdelitev in razvija tudi iz H
. pylori
-brezplačen, morfološko normalna želodca sluznica brez atrofični gastritis ali IM, in difuzno tipa GC se lahko razlikujejo od črevesne tipa tako genetsko in fenotipsko [1-5]. Za razliko od zmanjševanja pojavnosti črevesne tipa, razširjenost difuznega tipa je po navedbah povečuje po vsem svetu [6]. Prognoza za paciente GC napredne difuzna tipa ostaja slaba v zadnjem desetletju zaradi visoke stopnje peritonealno razširjanja (PD) (78%), v primerjavi s položajem črevesne tipa (45%) [7]. Zlasti pri bolnikih s tipom Bormann IV GC imajo zelo slabo prognozo, čeprav so prejeli multidisciplinarno obravnavo [8]. Zato obravnava PD je nujno vprašanje za izboljšanje prognoze bolnikov difuzna tipa GC.

Razpršeni tipa GK so običajno značilna obsežno stromalni fibrozo s slabim vaskularnosti in redkih proliferacijskih ( i
. e
. mirujoče) rakave celice, kar vodi do znatnega terapevtski odpornosti. Z vidika kemoterapije, preoblikuje rastni faktor ß (TGF-beta) je mislil, da prispevajo k agresivnemu napredovanje preko epitelija-mezenhimskih tranzicije in s spodbujanjem fibrozo [9]. Vendar, TGF-β prav tako zavira proliferacijo celic, inducira apoptozo in posreduje diferenciacije v epitelijskih celicah, kar kaže, da imajo komponente poti na TGF-β-signalnih tumor-supresivno aktivnost na epitelijskih tumorjev [10, 11]. Čeprav se zbirajo dokazi pokazali, odločilno vlogo TGF-ß v rak matičnih celic (CSC) biologije, je omejene informacije v zvezi z njegovo vlogo pri difuzni tipa GK.

To so poročali, da je vsaka populacija tumorskih celic kažejo funkcionalno heterogenost je značilna izrazito proliferacijo in diferenciacijo zmogljivosti v različnih vrstah tumorjev [12]. Se obračuna tak tumorja heterogenosti, so bila predlagana dva modela: The klonske razvoj modela [13] in model CSC [14]. Slednji model, je prejela veliko pozornosti, saj zagotavlja razumno razlago za odpornost na konvencionalne kemo- in radioterapijo, v katerem mirujočem ali počasno kolesarjenje CSCS preživetje, in rezultati v morebitnem tumorja ponovitve [15-17]. Zato, terapevtske strategije za ciljne CSCS so nujni za odpravo preostale bolezni in za preprečitev ponovitve ne samo v GC, ampak tudi druge oblike raka. Poleg tega se s sedanjimi vpogled v celičnih mehanizmih rakotvornosti, se metastatskega potenciala tumorskih celic pripisati FT, ki lahko klonsko sprožijo nastanek tumorjev na oddaljenih lokacijah [18 19]. Čeprav so bili predlagani številni celičnih površinskih molekul, kot CSC označevalcev v zelo različnih človeških malignih bolezni, ni bilo identifikacija označevalec-PD povezana CSCS v GK [20-23]. Za identifikacijo takih označevalcev, smo upoštevali stališče, da je funkcionalno in genetsko heterogena tumorji skupne in bistvene mehanizme vzdrževanja tumorja glede na kontekst določenega mikrookolja. V skladu s tem smo predpostavili, da je treba CSCS funkcionalno je opredeljena z dobro potrjenih-teste, kot so in vivo
presaditev. V difuzna tipa GC, smo se najprej osredotočili na peritonej specifične kolonizacijo celic in obogatili-PD povezana FT zaradi ponavljajočih vivo
izbire [24, 25]. Tu smo našli CXC vrsto kemokin receptor 4 (CXCR4) lahko marker za-PD povezana želodčnih CSCS in dokazali, da TGF-β povečuje učinkovitost anti-tumorskih zdravil z indukcijo diferenciacije celic /delitve asimetrične celic v CXCR4 ^{+ CSC prebivalstva tudi v mirujočem stanju.}

materiali in metode

Klinični vzorci

Klinični vzorci so bili predvideni državni bolnišnici Cancer Center (Tokio, Japonska), po pridobitvi pisno privolitev iz vsakega bolnika in odobritev s strani National Cancer Center Institutional Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

celičnih linij in primarnih kultur

A človeka GC celično linijo, je HSC-60, ki jo ustanovi sodelavec po postopku, kot je bilo prej [26] opisano. Celična linija visoko peritonealno-metastatskega je 60As6 ki od HS-60 z uporabo orthotopic vnašanja tkiva v SCID /SCID miši, kot je na kratko naslednji: ksenotransplantirali tumor HSC-60 celice, smo presajeni v želodčni steni miš. ponovili smo šest ciklusov spravila ascitic tumorskih celic in orthotopic inokulacijo teh celic. Ti dve celične linije smo ohranjali in RPMI-1640 mediju dopolnjenem z 10% fetalnega telečjega seruma. Ugotovili smo tudi dva-luciferaza izražanje celičnih linij (HSC-60Luc in 60As6Luc). Šest-GC izvira celične linije (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 in KATO III) so se ohranili tudi pod enakim pogojem. Od teh šestih HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, in 58As9 so bile določene po zgoraj opisanem postopku [27, 28], in KATO III je bil pridobljen od American Type Culture Collection. Za primarne kulture, smo celice zbrali s peritonealno izpiranju in ascites pacientov (NSC-16c, NSC-20C in NSC-22C) in kultivirane razlog za RPMI-1640 medij z dodatkom 10% fetalnega telečjega seruma.

mikromrež analiza

Total RNA 60As6, 60As6Luc, HSC-60, in HSC-60Luc celice izoliramo z opustitvijo celice v ISOGEN liznega pufra za (Nippon gen, Toyama, Japonska), sledijo izopropanola padavin. Opravili smo mikromrež analizira dvakrat z uporabo človeškega genoma U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Postopki so bili opravljeni v skladu s protokoli dobaviteljev. V nizi so bili skenirani s GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), in podatki, ki so bili analizirani s Mikromrežni Suite 5.0 z nastavitvami Affymetrix privzete analize in globalno luščenje kot metoda normalizacije. Obrezane srednja Cilj intenzivnosti vsakega niza je samovoljno nastavljena na 1000. Vsi podatki mikromrež so deponirani v skladnih podatkovni bazi MIAME, GEO; Število pristop GSE53276. Z 2-kratnim spremembam, so 684 genov izbrali specifičnih genov za 60As6 in 60As6Luc celic in 1150 geni so za HSC-60 in HSC-60Luc celic izbrali.

Poskusi na živalih

Six -week-old ženski C.B17 /ICR-SCID (SCID /SCID) miši (CLEA Japonska, Japonska) so redili pri sobni temperaturi s 12 h svetlo /temno dnevnega cikla. Miši so se ohranili pod posebnimi pogoji, brez patogenov in pod pogojem, sterilne hrane, vode, in kletke. 1 x 10 ^{4-1 x 10 6 rakavih celic suspendiramo z 1 ml-fosfatnim pufrom (PBS), nato vbrizgamo v trebušno votlino z uporabo 26 1/2-iglo a. Miši smo stehtali in merijo tedensko. Humane končne točke merila vključena pomembno kopičenje trebušne ascitesa, dispnejo, piloerekcije, anemija ali zmanjšanje telesne mase presega 10% začetne teže. Vsi poskusi so bili opravljeni v skladu z etičnimi smernicami Mednarodno združenje za preučevanje bolečine in so bili potrjeni s strani Odbora za etiko v poskusih na živalih državnega Cancer Center. So bila prizadevanja za zmanjšanje števila in vse trpljenje živali, ki se uporablja v poskusih.}

RT-PCR

Total RNA smo izolirali s suspendiranje celic v ISOGEN lize pufru, čemur je sledilo izopropanola padavin. Semi-kvantitativno RT-PCR je bila opravljena v linearnem območju od 25 do 30 ciklov za MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, LGR5
, TGFBR1
, TGFBR2
in ACTB
uporabo naslednjih primerjev: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'in 5' GTTGTCCACATGGCTGTT-3 "za MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 'in 5' AGACTGTACACTGTAGGTGC-3" za CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3 'in 5' ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 "za CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'in 5' AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3 "za CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'in 5' CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3" za LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'in 5' GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3 "za TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'in 5' GAGACCTTCCACCATCCAAA-3" za TGFBR2
in 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'in 5' GCACGAAGGCTCATCATTCA-3 "za ACTB
.

imunocitokemija

Posredna fluorescentno imunocitokemija je bila izvedena za CXCR4, MUC5AC in Smad2 /3 v celicah, gojenih v 4-tudi komornih diapozitive. Celice so bile določene v 4% paraformaldehida pri sobni temperaturi 20 minut. Po trikrat spiranju v PBS (-), so inkubirali z anti-humana CXCR4 monoklonsko protitelo (R &D Systems, Minneapolis, MN), MUC5AC protitelesa proti humanemu (Santa Cruz biokemijo, Santa Cruz, CA) ali anti človeški Smad2 /3 protitelo (BD Biosciences, Bedford, MA), čemur sledi inkubacija z 1: 1000 razredčitvijo osel anti-miš Alexa 488-konjugiranega seruma (Invitrogen, Grand Island, NY) 1 uro pri sobni temperaturi. Celic jedra smo obarvali z 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole dihidroklorida (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Za celice rodu testom, razporejene eno CXCR4 ^{+ majhne celice smo obarvali s CellTracker Green (Invitrogen) za sledenje žive celice.}

pretočno citometrijo in

60As6 celice sortiranje
celic (1 x 10 ^{6 celic) smo sočasno inkubirana 30 minut pri 4 ° C z naslednjimi protitelesi: APC anti-humanega CD184 (CXCR4) (IgG2a, klon 12G5) ali APC miška IgG2a, k kontrolni izotip pridobljena iz BioLegend ( San Diego, CA). Mrtve celice so bile označene z propidijevim jodidom in izključen iz analize. V celici razvrščanje, so CXCR4-pozitivne in CXCR4-negativne Podskupine očistimo s pomočjo sortiranja celic JSAN (Bay Bioscience, Kobe, Japonska), in smo analizirali s programsko opremo, FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Za analize celičnega ciklusa, smo celice prenesli v mediju brez seruma za 5 dni, nato pridelani z 0,05% tripsina-EDTA in nato suspendirali v mrzlem 80% etanola. Po določitvi preko noči pri -20 ° C, smo vzorce sprali v PBS (-) in inkubirali v 500μl s PI /RNazo pufra za barvanje (BD Pharmingen, San Diego, CA), na 1 x 10 6 celic za 30 min pri sobna temperatura pred analizo. Pretočna citometrija smo izvedli z uporabo FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), in analizirali s programsko opremo, FlowJo.}

Sidrišče neodvisen test celično rast

mehkega agarja tvorbo kolonije test je bil izveden z CytoSelect 96-Cell Transformation testu Kit (Cell BioLabs, San Diego, CA), sledi navodilom proizvajalca. Na kratko, 5 x 10 ^{3 CXCR4 pozitivni ali CXCR4 negativni majhne celice suspendiramo v DMEM, ki vsebuje 0,4% nizko temperaturo tališča agaroze in 10% FBS in zasejali 1% nizko talilno agaroze vsebuje DMEM in 10% FBS. Po inkubiranje celic za 5 dni pri 37 ° C v 5% CO _{2, smo celice lizirali in zaznan s CyQuant GR barvilom. Fluorescenca kolonije tvorijo celice je potrebno brati v Večnamenski Microplate Reader (Safire, Tecan, Männedorf, Swizerland) pri valovnih dolžin vzbujanja /emisij 485/520 nm.}}

Invasion test

Cell invasion je bila določena z uporabo BD BioCoat tumorska invazija preskusnega sistema (BD Biosciences) v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, 4 x 10 ^{5 60As6 celic z medijem brez seruma smo zasejali v zgornjo komoro sistema. Bottom vrtine so bile napolnjene z mediji z 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Po 24 h inkubacije, so bile celice v zgornji komori odstranili in celice, ki napadel skozi Matrigel membrane smo obarvali z Diff-Quick madež (BD Biosciences) in prešteti ročno.}

kaspazne vsebnosti

v 60As6 celice smo pripravili na ploščo s 96 vdolbinami (5 x 10 ^{3 celic /jamico). Kaspaze 3/7 test smo izvedli z uporabo kaspazne-Glo 3/7 testom (Promega, Madison, WI) pri 24 ur po dodatku rekombinantnega TGF-β1 (240-B, R &D sistemi) v celični kulturi koncentracija 2 ng /ml.}

testi rasti Cell

Če želite ugotoviti, IC _{50 vrednosti proti docetakselom (Doc), sta bili obe HSC-60 in 60As6 celice gojimo v prisotnosti 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokio, Japonska) 4 dni pri 37 ° C v 5% CO 2, ki ji sledi konvencionalno MTT testu. Za potrditev zdravljenje kombinirano z Doc in TGF-ß je vse 60As6 celic in 2 primarnih kultur (NSC-16C in -22C), pripravljeno v 6 vdolbinicami (1 × 10 ^{5 celic /vdolbinico) sledi zdravljenje z Dok (2,5 nM) in TGF-β1 (0 ali 2 ng /ml) 72 ur pri 37 ° C v 5% CO 2. Celice smo barvali s trypan modro in šteje skupaj TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, Hercules, CA).}}

Statistična analiza

Vsi podatki so bili izraženi kot povprečje ± SE, in analizirali s pomočjo neparni t-test. Sprejeta Stopnja pomembnosti je p
< 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL), je bila uporabljena za vse statistične analize.

Rezultati

Fenotipske razlike med starševskim 60. HSC-celic in 60As6 celic zelo tumorogen subline

obravnavati fenomen difuzna-tipa GC povezana PD s stališča molekularne in celične biologije, smo vzpostavili zelo peritonealno zasevkov celične linije, 60As6, od difuzna tipa GC izpeljane celične linije, HSC-60, z in vivo
izbira sestojijo iz orthotopic inokulacijo tumorskih celic in izolacijo visoko metastatski tiste iz ascitesa z imunsko pomanjkljivostjo miši [25]. Čeprav je bil čas podvojitve teh dveh celičnih linij primerljiva (30 ur za HSC-60 in 31 ur za 60As6) in vitro
, 60As6 celice oblikujejo več tumor vozlički hitreje po intraperitonealni inokulaciji v miši. Mediana časa preživetja je bila 167 dni po vsaditvi 5 × 10 ^{6 HSC-60 celic, medtem ko implantacijo enakem številu 60As6 celic za posledico izjemno nastanek krvavih ascites v in čas Mediano preživetje je bilo le 28 dni. Sidrišče-Neodvisnost se lahko zahtevajo za preživetje prostih rakavih celic v peritonealno votlino in za kolonizacijo. V kolonij tvorjenje testu 60As6 celice oblikovana mnogo več kolonij v primerjavi z HSC-60 celice (S1 Sl), ki kažejo, da 60As6 ima visoko sposobnost rasti pritrditve neodvisni. potrjena smo chemoresistance znan tudi kot velik premoženja FT. Celice smo gojili v prisotnosti docetaksela (Doc), ki je pogosto zaposleni proti raku zdravilo za zdravljenje bolnikov GC. 60As6 pokazala 6-krat večji IC _{50 vrednost Doc v primerjavi s položajem HSC-60 (52 nm in 8,4 nM) (S2 slika). Ti podatki kažejo, da je 60As6 pridobili velik kemoterapijo fenotip. Poleg tega je bila morfologija HSC-60 celic označimo kot stanovanje in velika, medtem ko je 60As6 celic je bil pol-plava in majhne, ​​kar je podobno morfologijo pogosto opaziti pri FT (S3 Sl). Mi poleg pregleda lipidne rafte lokalizacije s pomočjo kolera toksin B podenoto (CtxB) kot lipidov splav čuvaja, saj je bilo že poročali, da so bili lipidov splav grozdi, obogaten hemopoetičnih matičnih celic [29]. so opažali kopičenje fluorescenčnih CtxB za 60As6 celice, ne pa tudi pri HSC-60, kar kaže na še eno CSC-kot premoženje za nekdanje celice (S3 sl).}}

Za oceno biološke razlike med HSC-60 in 60As6 celice, smo primerjali izražanje genov profilov z analizo mikromrež (S1 tabeli). Dol-ureditev treh celično diferenciacijo označevalcev želodca pit ( MUC5AC
, MUC1
in TFF1
) in nekatere citokeratinov so bile ugotovljene v 60As6. Nasprotno, več označevalcev matičnih celic ( LY75
, CD44
, GPNMB
in CXCR4
) so povečana pri tej celični liniji. Profil izraz kaže, da ima 60As6 močan mezenhimskih fenotip, ki je značilna za epitelijskih FT-celic izvira.

dodatno preiskala mRNA izraz tako tipično diferenciacije označevalec MUC5AC
[3 , 4] in-metastaze, povezane kemokin receptor CXCR4
[30] RT-PCR. V skladu z rezultati mikromrež, MUC5AC
in CXCR4
mRNA pokazala medsebojno izključno izraz v HSC-60 in 60As6 (slika 1A). Kemokin SDF-1 kodiran s CXCL12
je znano, da se veže CXCR4 in sorodnim receptorjem CXCR7 [30]; Vendar mRNA CXCL12
in CXCR7
niso bili odkriti v obeh celične linije. Izraz tako MUC5AC in CXCR4 bila potrjena tudi na nivoju proteina, ki ga imunocitokemijski barvanjem (slika 1B). Tako ti rezultati kažejo, da so celice HSC-60 pristana bolj diferenciranih celic kot narediti 60As6 celice, ki so v glavnem sestavljene iz nediferenciranih celic. Skupaj, vsi ti CSC podobnih značilnosti 60As6 kažejo, da bi se nediferencirani podskupina z visoko tumorjev in drog odpornost učinkovito obogaten s starševske celice v in vivo
izborov.

Identifikacija in karakterizacija želodčnih CSCS v 60As6 in primarnih gojenih celic

smo poleg preučila vlogo CXCR4 v GC celicah difuzna tipa za PD. Kot je prikazano na sliki 1A, receptor CXCR4
je zelo izražena v 60As6 primerjavi z HSC-60, medtem ko je njihov ligand CXCL12 /SDF1
ni bil v obeh. Vendar pa je treba poudariti, da je ta ligand znano, da se izrazi v peritonealno mesothelial celic [31] in deluje kot kemokin za indukcijo oddaljenih metastaz skozi interakcijo z-CXCR4 izražanje rakavih celic [30]. Zato smo preverili, ali bi CXCR4 služi kot pokazatelj za ugotavljanje-PD povezana FT. Izraz CXCR4 na 60As6 celic smo analizirali s fluorescenca aktivirana celica sortirno analizo (FACS). V skladu z enačbo CXCR4 in sprednjim sipanja vzorec, 60As6 celice pokazal heterogenost sestavljen iz treh različnih podpopulacij: I. CXCR4 ^{+ malih celic (15%), II. CXCR4 - majhne celice (65%), in III. CXCR4 - velike celice (20%) (slika 1Ci). Celice smo nato ločimo vsaki podpopulaciji s čistostjo I: 97%, II: 99%, in III: 54%, oziroma (slika 1Cii-1Civ). sortiranje čistost nizko na CXCR4 - velika celica podskupina III je bila posledica okužbe z zbirni CXCR4 - majhne celice (slika 1Civ, črno-boxed panel). Med temi tremi skupinami prebivalstva, le CXCR4 - velika celica podskupina vsebuje MUC5AC + diferencirane celice (Slika 1Civ, tri zunanje plošče). S spremljanjem celične rasti v enem celičnem nivoju, je bilo ugotovljeno, da CXCR4 - majhne celice proliferated, medtem ko CXCR4 - velike celice niso podvržene delitev celic še 3 dni po kulturi (Slika 1D in S4 Sl). Te ugotovitve kažejo, da CXCR4 - so majhne celice prehodne pomnoževanje celic, medtem ko je CXCR4 - velike celice terminalno diferencirane celice}

Po dveh subpopulacijo (I in II), sortiranje, smo analizirali. vsaka izmena populacije celic (slika 2A); po 7 dneh kulture. CXCR4 ^{+ majhne celice, ki ustrezajo podskupini bolnikov I sami ustvarili, CXCR4 - majhne celice, in CXCR4 - velike celice (11%, 62% in 21%, v tem zaporedju), medtem ko CXCR4 - majhne celice, ki ustrezajo podskupini II so lahko povzročajo predvsem sami (80%), z nekaterimi velikimi celicami (17%) in zelo malo CXCR4 + majhnih celic (2%). Ti rezultati kažejo, da imajo CXCR4 + majhne celice diferenciacije potencial in proizvodnjo CXCR4 - velika celic morebiti prek fazi CXCR4 -. Majhne celice v sistemu celične diferenciacije}

Nadalje, CXCR4- ^{+ majhna sama celica proizvaja kolonijo, ki vsebuje MUC5AC + diferenciranih celic po 7 dneh v kulturi (slika 2b). Ta ugotovitev je podprta z celičnega rodu testom v kombinaciji z barvanje celic živo in imunskim barvanjem MUC5AC (slika 2C). Poleg tega CXCR4 + majhne celice smo dokazali, da izraža visoko stopnjo LGR5
, ki je znan kot označevalec želodca epitelijskih izvornih celic, ki se nahajajo na žlezi normalne sluznice [32] (sl 2D ).}

Nato smo validirali pritrdišča neodvisnosti in tumorjem začetek sposobnost dveh majhnih celic podskupini (I in II). V testu tvorbe kolonij, CXCR4 ^{+ majhne celice oblikujejo mnogo več kolonij, kot ga je imel CXCR4 - majhne celice (slika 3a). Serijski poskusi redčenja z intraperitonealno inokulacijo na imunsko pomanjkljivostjo miših je pokazala, da CXCR4 + majhne celice imela tudi višje tumorogeno sposobnosti (razvoj tumorjev v 4/5 in 1/5 miši na inokulacijo 10 5 in 10 4 celice, v tem zaporedju) v primerjavi z CXCR4 - malih celic (1/10 in 0/10 miši po 10 5 in 10 4 celice, v tem zaporedju) (slika 3Bi). Predvsem vseh pet tumorjem ob miši po inokulacijo CXCR4 + majhne celice imel več tumorjev gomoljev (slika 3Bii), in začel razvijati krvave ascitesa v 3 tednih (slika 3Biii).}

Poleg tega, da difuzna tipa GC celične linije, smo raziskovali tudi vlogo CXCR4 v klinični vzorca (NSC-20 ° C): primarne kulture s sedežem iz ascitesa GC bolniku difuzna tipa s PD. V RT-PCR in imunskim barvanjem poskusov je bilo potrjeno, da je primarni kultura izraziti CXCR4
vendar ne CXCR7
(slika 3C). Pomembno je, da CXCR4 ^{+ majhne celice, razvrščena od NSC-20C imela tako na doseljevanja sposobnosti (slika 3Di in 3Dii) in sposobnost za tvorjenje visoko kolonija (slika 3Diii).}

Vključevanje CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 os v PD

v šestih drugih difuzna tipa GC izhaja celičnih linijah (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 in KATO III), bomo še naprej raziskovali odnos med stanje izraz dveh CXCL12 /SDF-1 receptorjev (CXCR4 in CXCR7) in kopičenje ascitesa pri miših, cepljenih z rakavih celic intraperitonealno. Poskusi RT-PCR je pokazala, da dve GC celične linije (HSC-39 in Kato III) zelo izraženo CXCR4
(slika 4A). Poleg tega oba ksenotransplantirali miši imel več tumorjev gomoljev in nabrane ascitesa (slika 4b). V nasprotju s tem, drugi dve celične linije (HSC-44 in HSC-58) je pokazala, brez ali z zelo nizko CXCR4 izraz, enojno ali nekaj peritonealno tumorja vozliča in ne kopičijo ascitesa (slika 4b). Prav tako je potrdil nabiranje ascitesa v drugi zelo peritonealno-metastatskega subline 58As9 (ki izhaja iz HSC-58), ki je izražena CXCR7
na visoki ravni, vendar ne CXCR4
. Ena izjemen primer je bil 44As3 izvira iz HSC44, da je imel več tumorjev gomoljev in nabrane ascitesa brez izražanja obeh CXCR4
in CXCR7
. Na splošno smo ugotovili visoko korelacijo med stopnjo ekspresije CXCR4
ali CXCR7
in agresivne fenotipov v sedmih od osmih celičnih linij, razen 44As3.

V klinični praksi , peritonealna izpiranje citologijo (CY) zagotavlja pomemben napovedni informacije za bolnike GC, saj lahko zazna "seme" PD pred makroskopski manifestacije. Tudi v primerih, brez PD (P0), CY-pozitivnih bolnikih, imajo slabo prognozo [33], kar kaže, da so prisotne v peritonealno lavažo teh bolnikov kar nekaj metastatskih FT. Zato bomo naslednjič raziskovali prisotnost CXCR4 ^{+ GC celic v peritonealno izpiranju iz bolnikih brez klinično očitnih ascites. CXCR4
mRNA je redko zaslediti v pranj pri 9 od 10 CY-negativnih bolnikov; Vendar pa je mRNA odkrita v izpiranju pri 19 od 34 CY-pozitivnih bolnikov (S5A Sl). Prav tako smo potrdili prisotnost CXCR4 in Cytokeratin dvojno pozitivnih malih GC celic na mesothelial celic, tlakovanih obliki vezanih na površino kulture jed v kratkoročno (7 dni) kultura bolnikovih ascitesa (S5B Sl). V naših poskusih, peritonealne mesothelial celice običajno izgine v dolgoročni kulture po približno enem mesecu. V takem dolgoročno kulture, smo ugotovili tudi prisotnost nekaterih CXCR4- ali CXCR7-zelo pozitivne GC celic, ki je pokazala, karakteristike za epitelija-mezenhimskih prehod, vimentina (VIM) -positive (puščica glave v S5C sliki), ampak Cytokeratin (PAN ) -negativno. Zato CXCR4 + GC celice so prisotne v malignega ascitesa ne samo v zgodnji fazi peritonealno razširjanja (P0 /CY +), ampak tudi v bolj postopno označen z izraženo kopičenje na ascitesa. Skratka, zgoraj eksperimentalni in klinični podatki kažejo, da je del CXCR4 + ali CXCR7 + GC celice imajo potencial za razvoj peritonealno metastaze.}

Naslednja raziskovali funkcionalno vlogo CXCR4 signalne poti v PD. Izraz CXCL12
/ SDF-1
v peritonealni mesothelium ljudi in miške je bila potrjena z RT-PCR (slika 5A). Zato smo raziskali vključenost CXCL12 /SDF-1 za celično invazijo. Kot je prikazano na sliki 5B, je število invazivnih 60As6 celice drastično povečajo za SDF-1, kar pomeni, da imajo te celice kemotakso sposobnost SDF-1. Lentivirusni shRNA inducirano rasklapanje od CXCR4 v 60As6 oslabljen SDF-1-posredovane invazije, vendar ne vplivajo na tvorbo tumor vozlov v peritonealno votlino miših (ni prikazano). Poleg tega prisiljen CXCR4 v celični liniji starševski HSC-60 ni povečala tumorogenosti (ni prikazana). Skupaj, naši podatki kažejo, da je CXCR4 vključen v dodatku k potrebušnice, vendar ne v oblikovanju na tumor vozlički.

shematsko pokazala procese neposredno PD iz želodca steni pri bolnikih z napredovalim GC skozi interakcijo med CXCR4 ^{+ ali CXCR7 + FT in SDF-1-izražanje peritonej (slika 5C). Na prvem koraku metastaz, bila CXCR4 + CSCS odcepi od želodčne stene v peritonealno votlino. Nato te celice pripisujejo bazalne membrane (BM) na peritonej v odziv na-mesothelium pridobljeni chemoattractant SDF-1 in kolonizira da se tvori gomoljev. Ti dogodki se pojavljajo na številnih mestih nad peritonealno površini, kar ima za posledico blokado črpalke-funkcijo in nato v akumulaciji na ascites.}

TGF-β spodbuja diferenciacijo celic /delitev asimetrična celična CXCR4 + želodčnih CSCS

TGF-β poročali so, da zmanjša stranske populacije nekaterih difuzna tipa GC celičnih linijah [34]. Zato smo raziskovali, ali ima TGF-β potencial, da spremeni značilnosti CXCR4 ^{+ difuzna tipa GC celic. Najprej smo preučila raven izražanja TGF-beta receptorjev v 60As6 celic in GC primarnih kultur, ki izhajajo iz dveh neodvisnih bolnikov (NSC-16C in -22C). RT-PCR poskusi so pokazali, da sta dva receptorja genov TGF-β ( TGFBR1
in TGFBR2
), izražena v vseh teh celic (S6 Sl). Smo pregledali tudi lokalizacija SMAD2 /3, saj so ti transkripcijski faktorji splošno znano, da se kopičijo v jedra v odgovor na aktivacijo TGF-P signalizacijo. Kot je prikazano na sliki 6Ai, jedrsko kopičenje SMAD2 /3 je bila odkrita v 60As6 celic po zdravljenju 30 min z 2 ng /ml TGF-ß.}

Naslednja raziskovali, kako so CXCR4 ^{+ GC celice vplivalo aktiviranje TGF-P signalizacijo. RT-PCR eksperiment je pokazala zmanjšanje CXCR4
mRNA v 60As6 z obdelavo TGF-beta (slika 6Aii). Citometrija analize kažejo, da je zdravljenje TGF-β zmanjšuje CXCR4 + majhne celice iz 6,3% na 0,4% in povečanje CXCR4 - velike celice s 17,1% na 43,2% (slika 6B). V skladu s povečanjem terminalno diferencirane celice, je kaspaza 3/7 v populaciji celotne celične aktivira TGF-beta zdravljenja (slika 6C). Zato se lahko TGF-β imajo potencial, da povzroči CXCR4 + FT na končno diferenciranih celic. Nadaljevali smo raziskovali vpliv TGF-ß na mirnih 60As6 celic, saj so CSCS mislili, da obstajajo v mirujočem stanju, pod hipovaskularnih stanju. Po izčrpanju serum za 5 dni je CXCR4 + majhne celice, poveča na 42% (slika 6Di).}

• Plos ONE: SIRT3 izboljša glikolize in širjenju in-SIRT3 Izražanje želodca raka celic
• Plos ONE: MicroRNA-137 Prispeva k zavirala tumorigeneze v humani želodca raka, ki ga ciljanje Akt2