PLoS ONE: Identifisering og karakterisering av CXCR4-Positive Gastric Cancer Stem Cells

Abstract

Diffus-type faste tumorer er ofte sammensatt av en høy andel prolifererende sjelden (dvs. sovende) kreftceller, sterkt indikerer involveringen av kreft stamceller (cscs) Selv om diffus-type magekreft (GC) pasienter har en dårlig prognose på grunn av høy hyppig utvikling av peritoneal formidling (PD), er det begrenset kunnskap om at PD-assosiert cscs og effekt av CSC-targeting terapi i diffuse-type GC. I denne studien har vi etablert svært metastatiske GC cellelinjer av in vivo
utvalg utformet for anriking av PD-assosiert GC-celler. Ved microarray analyse, fant vi CXC chemokin reseptor type 4 (CXCR4) kan være en roman markør for høyt metastatisk cscs, siden CXCR4-positive celler kan vokse forankrings uavhengig, initiere svulster hos mus, være motstandsdyktig mot cellegift, og produsere differensiert datter celler. I kliniske prøver, ble disse CXCR4-positive celler funnet fra ikke bare sent stadium metastase (akkumulert ascites), men også tidligere stadium (peritoneale vaskinger). Videre behandling med transformerende vekstfaktor-β forbedret anti-kreft effekt av docetaxel via induksjon av celledifferensiering /asymmetrisk celledeling av de CXCR4-positive gastriske cscs selv i en sovende tilstand. Derfor differensiering indusere holde løftet for å oppnå maksimal terapeutisk utfall av tilgjengelige anti-kreft narkotika gjennom re-sykling av cscs

Citation. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) Identifisering og karakterisering av CXCR4-Positive Gastric Cancer Stem Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10,1371 /journal.pone.0130808

Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, JAPAN

mottatt: 18 februar 2015; Godkjent: 25 mai 2015; Publisert: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Alle microarray data har blitt deponert i en MIAME kompatibel database, GEO; sjonsnummer GSE53276

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institute of Biomedical Innovation (for Advanced Research for Medical Products Mining Programme ID10-41), Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan (for tredje Omfattende 10-år Strategi for Cancer kontroll H22-007), National Cancer Center Research and Development Fund (25-A-6, 26-A-3). Dr. T Fujita, M Tamaoki og T Nishimura er mottakerne av en forsknings Resident Fellowship fra Stiftelsen for Promotion of Cancer Research in Japan

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Histopathologically kan GCer deles inn i to hovedkategorier: intestinal-type og diffus-type. Intestinal-type GC dominerer i høyrisiko geografiske områder og utvikler gjennom noen sekvensielle stadier inkludert Helicobacter pylori product: ( H
. pylori
) -associated atrofisk gastritt, intestinal metaplasi (IM), og dysplasi. I motsetning diffus-type GC, som står for halvparten av alle GC pasienter, har en stor geografisk spredning og utvikler selv fra H
. pylori
-fri, morfologisk normal mageslimhinnen uten atrofisk gastritt eller IM, og diffuse-type GC kan avvike fra tarmtype både genetisk og fenotypisk [1-5]. I motsetning til den synkende forekomst av intestinal-type, er utbredelsen av den diffuse-type velig økende verdensomspennende [6]. Prognosen for avansert diffuse-type GC pasienter har vært dårlig de siste ti årene på grunn av en høy grad av peritoneal formidling (PD) (78%) sammenlignet med intestinal-type (45%) [7]. Spesielt pasienter med type IV Bormann GC har en svært dårlig prognose, selv om de mottok tverrfaglig behandling [8]. Derfor adressering PD er et presserende problem for forbedring i prognosen for diffuse-type GC pasienter.

Diffus-type GCer er vanligvis preget av en omfattende stromal fibrose med dårlig vaskularisering og sjeldne proliferativ ( i
. e
. hvil) kreftceller, noe som fører til en betydelig terapeutisk motstand. Fra synspunktet til kjemoterapi, transformerende vekstfaktor β (TGF-p) er antatt å bidra til den aggressive progresjon via epitelial-mesenchymale overgang og ved å fremkalle fibrose [9]. Imidlertid TGF-β også hemmer celleproliferasjon, induserer apoptose, og medierer differensiering i epitelceller, noe som tyder på at komponenter av TGF-β signalbaner som har tumor-undertrykkende aktivitet i epiteliale tumorer [10, 11]. Selv om akkumulerende bevis har demonstrert den viktige rollen av TGF-β i kreft stamcelle (CSC) biologi, er det begrenset informasjon vedrørende dens rolle i diffust-type GCer.

Det har blitt rapportert at hver populasjon av tumorceller viser funksjonell heterogenitet preget av tydelig spredning og differensiering kapasitet i ulike typer svulster [12]. For å ta høyde for en slik svulst heterogenitet, er foreslått to modeller: den klonal evolusjon modell [13] og CSC modell [14]. Den sistnevnte modell har fått stor oppmerksomhet, fordi det gir en rimelig forklaring for resistens mot konvensjonelle kjemo- og stråleterapi, hvor hvilende eller langsom-sykling cscs overleve, og resulterer i eventuell tumor tilbakefall [15-17]. Derfor terapeutiske strategier for å målrette cscs er viktig å utrydde restsykdom og for å hindre gjentakelse i ikke bare GC, men også andre kreftformer. Videre med dagens innsikt i de cellulære mekanismene for kreftutvikling, er metastatisk potensial av kreftceller tilskrives cscs, som clonally kan initiere svulstdannelse i fjerne områder [18 19]. Selv om en rekke celleoverflatemolekyler er foreslått som CSC markører i et stort utvalg av menneskelige kreftformer, har det ikke vært markør identifikasjon for PD-assosiert cscs i GCer [20-23]. For å identifisere slike markører, vi regnes som den oppfatningen at funksjonelt og genetisk heterogene svulster har felles og iboende mekanismer svulst vedlikehold i henhold til konteksten av en gitt mikromiljøet. Følgelig hypotese vi at cscs skal defineres funksjonelt av godt validerte analyser som in vivo
transplantasjon. I diffus-type GC, vi i første omgang fokusert på bukhinnen spesifikke kolonisering av celler og beriket PD-assosiert cscs ved gjentatte in vivo
valg [24, 25]. Her fant vi CXC chemokin reseptor type 4 (CXCR4) kan være en markør for PD-assosiert mage cscs og viste at TGF-β forbedrer effekten av anti-svulst narkotika via induksjon av celledifferensiering /asymmetrisk celledeling i CXCR4 ^{+ CSC befolkningen selv i en sovende tilstand.}

Materialer og metoder

Kliniske prøver

Kliniske prøver ble levert av National Cancer Center Hospital (Tokyo, Japan) etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke fra hver pasient og godkjenning av National Cancer Center Institutional Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og primærkulturer

Et menneske GC-cellelinje, HSC-60 ble etablert ved en samarbeidspartner ved å benytte prosedyren som er beskrevet tidligere [26]. En meget peritoneal-metastatisk cellelinje, 60As6 ble etablert fra HSC-60 ved hjelp av ortotopisk vev implantering i SCID /SCID-mus som kort på følgende måte: den xenopodet tumor av HSC-60-celler ble transplantert inn i den gastriske vegg av en mus. Vi gjentatt seks sykluser av høste ascitiske tumorceller og den ortotopisk inokulering av disse cellene. Disse to cellelinjer ble holdt i et RPMI-1640 medium supplementert med 10% føtalt kalveserum. Vi har også opprettet to luciferase-uttrykker cellelinjer (HSC-60Luc og 60As6Luc). Seks andre GC-avledede cellelinjer (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, og KATO III) ble også opprettholdt under de samme betingelser. Av disse seks, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, og 58As9 ble etablert ved den ovenfor angitte fremgangsmåte [27, 28], og KATO III ble oppnådd fra American Type Culture Collection. For primære kulturer, ble celler oppsamlet fra pasienter peritoneale vaskevæsker og ascites (NSC-16C, NSC-20C, og NSC-22C) og dyrket i et RPMI-1640 medium supplementert med 10% føtalt kalveserum.

mikromatriseanalyse

Total RNA fra 60As6, 60As6Luc, HSC-60, og HSC-60Luc-celler ble isolert ved å suspendere cellene i et ISOGEN lyseringsbuffer (Nippon Gene, Toyama, Japan) etterfulgt av isopropanol utfelling. Vi har utført mikromatriseanalyser to ganger ved hjelp av Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Prosedyrene ble gjennomført i henhold til leverandørenes protokoller. Arrays ble skannet med en Genechip Scanner 3000 (Affymetrix), og dataene ble analysert ved Mikromatrise Suite versjon 5.0 med analyse innstillinger Affymetrix standard og global skalering som normalisering metoden. Trimmet gjennomsnitt målintensitet av hver matrise ble vilkårlig satt til 1000. Alle microarray data har blitt deponert i en MIAME kompatibel database, GEO; sjonsnummer GSE53276. Ved en 2 ganger endring, ble 684 gener valgt som spesifikke gener for 60As6 og 60As6Luc celler, og 1150 gener ble valgt for HSC-60 og HSC-60Luc celler.

Dyreforsøk

Seks -week gammel kvinne C.B17 /ICR-SCID (SCID /SCID) mus (CLEA Japan, Japan) ble avlet ved romtemperatur med en 12 timers lys /mørk daglig syklus. Musene ble holdt under spesifikke patogenfrie forhold, og forutsatt sterile mat, vann, og merder. 1 x 10 ^{4 til 1 x 10 6 av kreftceller ble suspendert med 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter injisert inn i bukhulen ved bruk av en 26 1/2-gauge nål. Musene ble veid og målt ukentlig. Humane endepunktkriterier inkludert betydelig opphopning av mage ascites, dyspné, piloereksjon, anemi, eller vekttap overstiger 10% av opprinnelig vekt. Alle forsøkene ble utført i samsvar med de etiske retningslinjene til International Association for Study of Pain og ble godkjent av komiteen for etikk i forsøk med dyr av National Cancer Center. Anstrengelser ble gjort for å minimere antall og hvilken som helst lidelse av dyr anvendt i eksperimentene.}

RT-PCR

Total RNA ble isolert ved å suspendere cellene i et ISOGEN lyseringsbuffer, etterfulgt av isopropanol utfelling. Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført innenfor lineære området fra 25 til 30 sykluser for MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, LGR5
, TGFBR1
, TGFBR2
, og ACTB
bruker følgende primere: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'og 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 'for MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3' og 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 'for CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' og 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 'for CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'og 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' for CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'og 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' for LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'og 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' for TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'og 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' for TGFBR2
, og 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'og 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' for ACTB
.

immunocytochemistry

Indirekte fluorescerende immunocytochemistry ble utført for CXCR4, MUC5AC, og Smad2 /3 på celler dyrket i fire-brønns kammermusikk lysbilder. Celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 20 min. Etter tre ganger vasking i PBS (-), ble de inkubert med anti-humant CXCR4 monoklonalt antistoff (R &D Systems, Minneapolis, MN), anti-humant MUC5AC-antistoff (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz, CA), eller anti- human Smad2 /3-antistoff (BD Biosciences, Bedford, MA), etterfulgt av inkubering med en 1: 1000 fortynning av esel-anti-muse Alexa 488-konjugert serum (Invitrogen, Grand Island, NY) i 1 time ved romtemperatur. Cellekjerner ble farget med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). For celle-avstamning analyse, sortert enkelt CXCR4 ^{+ små celler ble farget av CellTracker Grønn (Invitrogen) for å spore de levedyktige celler.}

Flowcytometri og celle sortering

60As6 celler (en x 10 ^{6 celler) ble ko-inkubert i 30 min ved 4 ° C med følgende antistoffer: APC anti-human CD184 (CXCR4) (IgG2a, klon 12G5) eller APC mus IgG2a, k isotypekontroll oppnådd fra BioLegend ( San Diego, CA). Døde celler ble merket med propidiumjodid og ekskludert fra analysen. I celle sortering ble CXCR4-positive og CXCR4-negative delpopulasjoner renset ved hjelp av en JSAN celle sorter (Bay Bioscience, Kobe, Japan), og ble analysert av en programvare, FlowJo (Tre Star, Inc., Ashland, Oregon). For cellesyklusanalyse, ble cellene overført til et serumfritt medium i 5 dager, og deretter høstet med 0,05% trypsin-EDTA, og deretter suspendert i kald 80% etanol. Etter fiksering over natten ved -20 ° C, ble prøvene vasket i PBS (-) og inkubert i 500 ul av PI /RNase Farging Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA) per 1 x 10 6-celler i 30 minutter ved romtemperatur før analysering. Strømningscytometri ble utført ved bruk av FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), og analysert ved hjelp av en programvare, FlowJo.}

forankrings-uavhengig cellevekstanalyse

A bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen ble utført bruker CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, California) følge instruksjonene fra produsenten. I korte trekk ble 5 x 10 ^{3 CXCR4-positive eller CXCR4-negative små celler suspendert i DMEM inneholdende 0,4% lavtsmeltende agarose og 10% FBS og sådd ut på 1% lavtsmeltende agarose inneholdende DMEM og 10% FBS. Etter inkubering av cellene i 5 dager ved 37 ° C i 5% CO _{2, ble cellene lysert og detektert med CyQuant GR fargestoff. Fluorescensen av kolonidannende celler ble lest i Multifunksjonell mikroplateleser (Safire, Tecan, Mannedorf, Swizerland) ved eksitasjon /utslipp bølgelengder 485/520 nm.}}

Invasion analysen

Cell invasjon ble bestemt ved bruk av BD BioCoat Tumor Invasion analysesystem (BD Biosciences) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 4 x 10 ^{5 av 60As6 celler med serumfritt medium ble podet inn i det øvre kammer av systemet. Bottom brønner ble fylt med media med 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, California). Etter 24 timers inkubasjon ble cellene i det øvre kammer fjernet, og cellene som invaderte gjennom Matrigel membranen ble farget med Diff-Quick flekk (BD Biosciences) og tellet manuelt.}

Caspase assay

De 60As6 celler ble utarbeidet i en 96-brønns plate (5 × 10 ^{3 celler /brønn). Caspase 3/7 analysen ble utført ved anvendelse av caspase-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI), ved 24 timer etter tilsetningen av rekombinant TGF-β1 (240-B, R &D systemer) inn i cellekultur ved en konsentrasjon på 2 ng /ml.}

Cell vekstanalyser

for å bestemme IC _{50 verdier mot docetaxel (Doc), begge HSC-60 og 60As6 cellene ble dyrket i nærvær av 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokyo, Japan) i 4 dager ved 37 ° C i 5% CO 2 etterfulgt av den konvensjonelle MTT-analysen. For å validere kombinasjonsbehandling med Doc og TGF-β, ble alt av 60As6 celler og 2 primære kulturer (NSC-16C og -22C) fremstilt i en 6-brønns plate (1 x 10 ^{5-celler /brønn) fulgt av en behandling med Doc (2,5 nM) og TGF-β1 (0 eller 2 ng /ml) i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO 2. Celler ble farget med trypanblått og tellet med TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, Hercules, CA).}}

Statistisk analyse

Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE, og analysert ved hjelp den uparede t-test. Den aksepterte nivået av betydning var p
< 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) ble brukt for alle statistiske analyser.

Resultater

Fenotypiske forskjeller mellom foreldre HSC-60 celler og de svært tumorigent underlinjen 60As6 celler

Å adressere fenomenet diffuse-type GC-assosiert PD fra synspunktet av molekylær og cellulær biologi, vi etablert en meget peritoneal-metastatisk cellelinje, 60As6, fra en diffus-type GC-avledet cellelinje, HSC-60, gjennom in vivo
valg som består av en ortotopisk inokulasjon av tumorcellene og isolering av svært metastatiske seg fra ascites av immundefekte mus [25]. Selv om dobling tid av disse to cellelinjer var sammenlignbare (30 hr for HSC-60 og 31 timer for 60As6) in vitro
, 60As6 celler dannet flere tumornoduler raskere etter intraperitoneal inokulering inn i mus. Median overlevelsestid var 167 dager etter implantering av 5 x 10 ^{6 HSC-60-celler, mens implantasjon av det samme antall 60As6 celler resulterte i en bemerkelsesverdig dannelse av blodige ascites og den midlere overlevelsestid var bare 28 dager. Krings-uavhengighet kan være nødvendig for overlevelsen av frie kreftceller i bukhulen og for kolonisering. I kolonidannelsesbestemmelsen, 60As6 celler dannet mange flere kolonier sammenlignet med HSC-60-celler (S1) Fig som viser at 60As6 besitter en høy evne til forankrings-uavhengig vekst. Vi validert chemoresistance også kjent som en stor eiendom cscs. Cellene ble dyrket i nærvær av docetaxel (Doc), som er et hyppig anvendt anti-kreft legemiddel for behandling av GC pasienter. 60As6 viste en 6-ganger høyere IC _{50 verdi av Doc sammenlignet med HSC-60 (52 nM og 8,4 nM henholdsvis) (figur S2). Disse data indikerer at 60As6 har fått en høy kjemoresistent fenotype. Videre ble morfologi av HSC-60-celler karakterisert som flat og store, mens det av 60As6 celler var halvflytende og liten, som er lik den morfologi ofte observeres for cscs (S3) Fig. Vi neste undersøkte lipid flåter lokalisering ved hjelp av koleratoksin B underenhet (CtxB) som en lipid flåte markør, siden det har allerede blitt rapportert at lipid flåte klynger ble beriket i blodkreft stamceller [29]. En opphopning av fluorescerende CtxB ble observert for 60As6 celler, men ikke i HSC-60, noe som tyder på en annen CSC-lignende eiendom for den tidligere celler (S3 fig).}}

For å vurdere de biologiske forskjellene mellom HSC-60 og 60As6 celler, sammenlignet vi genuttrykk profiler av microarray analyse (S1 tabell). Nedregulering av tre gastrisk pit celle-differensieringsmarkører ( MUC5AC
, MUC1
, og TFF1
) og noen cytokeratins ble funnet i 60As6. Derimot, flere stamcellemarkører ( LY75
, CD44
, GPNMB
, og CXCR4
) ble oppregulert i denne cellelinjen. Uttrykket profil antyder at 60As6 har en sterk mesenchymale fenotype, noe som er karakteristisk for epitel-celle-stammer cscs.

Vi undersøkte mRNA-ekspresjon av både en typisk differensiering markør MUC5AC product: [3 ytterligere , 4] og et metastase-assosierte kjemokinreseptor CXCR4 product: [30] ved RT-PCR. I samsvar med microarray resultater, MUC5AC Hotell og CXCR4
mRNA viste en gjensidig utelukkende uttrykk i HSC-60 og 60As6 (fig 1A). En chemokine SDF-1 kodet av CXCL12
er kjent for å binde CXCR4 og kognatreseptoren CXCR7 [30]; Men mRNA av CXCL12 Hotell og CXCR7
ikke ble påvist i begge cellelinje. Ekspresjonen av både MUC5AC og CXCR4 ble også bekreftet ved en proteinnivå ved immunocytokjemisk farging (figur 1B). Følgelig antyder disse resultatene at HSC-60-celler havn mer differensierte celler enn de 60As6 celler, som for det meste består av udifferensierte celler. Tatt sammen, alle disse CSC-lignende karakteristikker av 60As6 indikerer at udifferensierte undergruppe med en høy tumorigenicity og resistens kan bli effektivt beriket fra foreldre cellene under in vivo
valg.

Identifisering og karakterisering av mage cscs i 60As6 og primære dyrkede celler

Vi neste undersøkt hvilken rolle CXCR4 i diffuse-type GC celler for PD. Som vist i figur 1A, reseptoren CXCR4
ble sterkt uttrykt i 60As6 sammenlignet med HSC-60, mens deres ligand CXCL12 /SDF1
var ikke i begge. Det er imidlertid verdt å merke seg at denne ligand er kjent for å bli uttrykt i peritoneale mesothelial celler [31], og til å fungere som et kjemokin til å indusere fjernmetastaser gjennom en interaksjon med CXCR4-uttrykkende kreftceller [30]. Derfor har vi undersøkt om CXCR4 kan tjene som en markør for å identifisere PD-assosiert cscs. Ekspresjonen av CXCR4 på 60As6-celler ble analysert ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) analyse. I henhold til CXCR4 uttrykk og forover spredning mønster, 60As6 celler oppviste en heterogenitet som består av tre forskjellige subpopulasjoner: I. CXCR4 ^{+ små celler (15%), II. CXCR4 - små celler (65%), og III. CXCR4 - store celler (20%) (fig 1Ci). Cellene ble deretter separert til hver undergruppe med en renhet på I: 97% II: 99%, og III: 54%, henholdsvis (fig 1Cii-1Civ). Den lave sortering renheten av CXCR4 - stor celle subpopulasjon III var knyttet til forurensning med aggregert CXCR4 - små celler (Fig 1Civ, svart-eske panel). Blant disse tre delpopulasjoner, bare en CXCR4 - stor celle subpopulasjon inneholdt MUC5AC + differensierte celler (Fig 1Civ, tre ytre paneler). Ved cellevekst overvåkning i en enkeltcelle-nivå, ble det funnet at CXCR4 - små celler proliferert, mens den CXCR4 - store celler har ikke gjennomgår celledeling, selv 3 dager etter kultur (figur 1D og S4 Fig). Disse funnene tyder på at CXCR4 - små celler er forbigående forsterker celler, mens CXCR4 - store celler er terminalt differensiert celler}

Etter sortering to undergruppe (I og II), vi analysere. en hvilken som helst forskyvning av cellepopulasjon (figur 2A); etter 7 dagers dyrking. CXCR4 ^{+ små celler som tilsvarer undergruppe jeg genererte seg selv, CXCR4 - små celler, og CXCR4 - store celler (11%, 62% og 21%, henholdsvis), mens CXCR4 - små celler som tilsvarer undergruppe II var i stand til å gi opphav hovedsakelig til seg selv (80%) med noen store celler (17%) og svært få CXCR4 + små celler (2%). Disse resultatene tyder på at CXCR4 + små celler har differensiering potensial og produsere CXCR4 - store celler muligens gjennom en fase av CXCR4 -. Små celler i ordningen av celledifferensiering}

Videre en CXCR4 ^{+ liten enkelt celle produsert en koloni med MUC5AC + differensierte celler etter 7 dager i kultur (figur 2B). Dette funnet ble støttet av en celle-avstamning analyse kombinert med levende cellefarging og farging av MUC5AC (Fig 2C). I tillegg har CXCR4 + små celler ble vist å uttrykke et høyt nivå av LGR5
, som er kjent som en markør av gastriske epitel-stamceller er plassert på kjertelen hos normal slimhinne [32] (fig 2D ).}

Deretter valideres vi anker uavhengighet og tumor-initiere evne til to liten celle subpopulasjon (i og II). I kolonidannelse analysen, CXCR4 ^{+ liten celler dannet mange flere kolonier enn gjorde CXCR4 - små celler (figur 3A). Seriefortynningsmetode eksperimenter av intraperitoneal inokulering i immunodeficient mus viste at CXCR4 + små celler også besatt et høyere tumorigen evne (tumor utvikling i 4/5 og 1/5 mus ved inokulering av 10 5 og 10 4 -celler, respektivt) sammenlignet med CXCR4 - små celler (1/10 og 0/10 mus etter 10 5 og 10 4-celler, henholdsvis) (figur 3BI). Spesielt, alle fem tumorbærende mus etter inokulering av CXCR4 + små celler hadde flere tumornoduler (Fig 3Bii), og begynte å utvikle blodig ascites innen 3 uker (Fig 3Biii).}

I tillegg til diffuse-type GC cellelinjer, vi også undersøkt hvilken rolle CXCR4 i en klinisk prøve (NSC-20C): en primær kultur etablert fra ascites av en diffus-type GC pasient med PD. I RT-PCR og farging eksperimenter ble det bekreftet at den primære kultur uttrykke CXCR4
men ikke CXCR7 plakater (figur 3C). Viktigere, CXCR4 ^{+ små celler sortert fra NSC-20C besatt både en repopulating evne (Fig 3Di og 3Dii) og en høy kolonidannelse evne (Fig 3Diii).}

Involvering av CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 akse i PD

i seks andre diffus-type GC-avledede cellelinjer (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, og KATO III), har vi undersøkt videre forholdet mellom uttrykket status for to CXCL12 /SDF-1-reseptorer (CXCR4 og CXCR7) og akkumulering av ascites i mus inokulert med kreftcellene intraperitonealt. RT-PCR eksperimenter viste at to GC cellelinjer (HSC-39 og KATO III) sterkt uttrykt CXCR4 plakater (figur 4A). Videre er begge disse xenopodet musene hadde flere tumorknuter og akkumulerte ascites (figur 4B). I motsetning til de to andre cellelinjer (HSC-44 og HSC-58) viste ingen eller ganske lav CXCR4 uttrykk, er en enkelt eller noen få peritoneal tumor nodul og ikke akkumuleres ascites (figur 4B). Vi har også bekreftet opphopning av ascites i en annen høyt peritoneal-metastatisk underlinjen 58As9 (avledet fra HSC-58) som uttrykte CXCR7
på et høyt nivå, men ikke CXCR4
. En eksepsjonell saken ble 44As3 avledet fra HSC44 som hadde flere tumornoduler og akkumulerte ascites uten uttrykk for både CXCR4 Hotell og CXCR7
. Total, vi fant en høy korrelasjon mellom uttrykket nivået av CXCR4
eller CXCR7 Hotell og aggressiv fenotyper i sju av de åtte cellelinjer unntatt 44As3.

I klinisk praksis , peritoneal lavage cytologi (CY) gir viktig prognostisk informasjon for GC pasienter, fordi det kan gjenkjenne "frø" av PD før sin makroskopisk manifestasjon. Selv i de tilfeller som ikke PD (P0), CY-positive pasienter har en dårlig prognose [33], hvilket antyder at mange metastatiske cscs er til stede i peritoneal lavage av disse pasientene. Derfor vi neste undersøkt tilstedeværelsen av CXCR4 ^{+ GC-celler i peritoneal vasker fra pasienter uten klinisk ascites. CXCR4
mRNA ble sjelden påvises i vaske i 9 av 10 CY-negative pasienter; imidlertid, ble mRNA påvist i vaskevæskene i 19 av 34 CY-positive pasienter (S5a Fig). Vi har også bekreftet tilstedeværelsen av CXCR4 og cytokeratin dobbel-positive små GC-celler på brostein-formede mesothelial celler festet til dyrkningsskålen flate i en kortvarig (7 dager) kultur av pasientens ascites (S5b Fig). I våre forsøk, peritoneal mesothelial celler vanligvis forsvant i langsiktig kultur etter ca en måned. I et slikt langsiktig kultur, også fant vi tilstedeværelsen av noen CXCR4- eller CXCR7-svært positive GC celler som viste et kjennetegn for epitel-mesenchymale overgang, vimentin (VIM) -positivt (pil hodet i S5C figur), men cytokeratin (PAN )-negativ. Derfor, CXCR4 + GC-celler er til stede i de ondartede ascites, ikke bare i den tidlige fasen av peritoneal spredning (P0 /CY +), men også i flere progressive stadier er kjennetegnet ved en åpen ascites opphopning. I sum, foreslår ovenfor eksperimentelle og kliniske bevis på at en del av CXCR4 + eller CXCR7 + GC-celler har et potensial for å utvikle peritoneal metastaser.}

Vi neste undersøkt den funksjonelle rollen til CXCR4 signalveien i PD. Uttrykket av CXCL12 Twitter / SDF-1
i den menneskelige og mus peritoneal mesothelium ble bekreftet ved RT-PCR (Fig 5A). Derfor ble involvering av CXCL12 /SDF-1 for celle invasjon undersøkt. Som vist i figur 5B, ble antallet av invasive 60As6 celler drastisk økning av SDF-1, noe som indikerer at disse cellene har evne til å kjemotaksis SDF-1. Lentiviral shRNA-indusert knockdown av CXCR4 i 60As6 dempes SDF-1-mediert invasjon, men ikke påvirket av tumor nodul dannelse i bukhulen til mus (ikke vist). Videre tvunget CXCR4 uttrykk i en foreldrecellelinje HSC-60 aldri økte tumorigenitet (ikke vist). Til sammen våre data tyder på at CXCR4 er involvert i vedlegg til bukhinnen, men ikke i svulsten nodule formasjonen.

Vi viste skjematisk prosesser direkte PD fra mageveggen i avanserte GC pasienter gjennom samspillet mellom CXCR4 ^{+ eller CXCR7 + cscs og SDF-1-uttrykke bukhinnen (fig 5C). Ved det første trinn av metastasering, ble den CXCR4 + cscs felle ut av den gastriske vegg i bukhulen. Deretter ble disse cellene feste til basalmembran (BM) av bukhinnen som reaksjon på mesothelium-avledede kjemotiltrekkende SDF-1 og kolonisere for å danne knuter. Disse hendelsene inntreffer på en rekke nettsteder over peritoneal overflaten, noe som resulterer i en blokade av pumpe-funksjonen og deretter i akkumulering av ascites.}

TGF-β fremmer celledifferensiering /asymmetrisk celledeling av CXCR4 + gastrisk cscs

TGF-β er blitt rapportert å redusere den side populasjon av enkelte diffus-type GC-cellelinjer [34]. Derfor, undersøkte vi hvorvidt TGF-β har et potensial til å endre egenskapene til CXCR4 ^{+ diffus-type GC-celler. Vi først undersøkt uttrykket nivåer av TGF-beta-reseptorer i 60As6 celler og GC primærkulturer som stammer fra to uavhengige pasienter (NSC-16C og -22C). RT-PCR-forsøk viste at begge to TGF-β reseptorgener ( TGFBR1
og TGFBR2
) uttrykt i alle disse celler (S6 Fig). Vi har også undersøkt for lokaliseringen av SMAD2 /3, siden disse transkripsjonelle faktorer er kjent for å akkumulere i kjernen som respons på aktivering av TGF-β signalering. Som vist i figur 6Ai, atom akkumulering av SMAD2 /3 ble påvist i 60As6 celler etter en 30 minutters behandling med 2 ng /ml TGF-β.}

neste undersøkt hvordan CXCR4 ^{+ GC-celler er påvirket ved aktivering av TGF-β signalering. RT-PCR-eksperiment viste en nedgang på CXCR4
mRNA i 60As6 av TGF-β behandling (Fig 6Aii). Flowcytometri analyser viser at TGF-β behandling redusere CXCR4 + små celler fra 6,3% til 0,4%, og for å øke CXCR4 - store celler fra 17,1% til 43,2% (fig 6B). I samsvar med en økning av terminalt differensierte celler, ble caspase 3/7 i hele cellepopulasjonen aktiveres av TGF-β behandling (figur 6C). Derfor kan TGF-β har et potensial til å indusere CXCR4 + cscs til døds differensierte celler. Vi undersøkte videre effekten av TGF-β på hvilende 60As6 celler, siden cscs antas å eksistere i en sovende tilstand under en hypovascular tilstand. Etter serum uttømming i 5 dager, CXCR4 + små celler økes opp til 42% (Fig 6Di). I tillegg er en betydelig andel av den 60As6 populasjonen var i G1 fase (Fig 6Dii).}

• PLoS ONE: SIRT3 Forbedrer glykolyse og spredning i SIRT3-Uttrykke magekreft Cells
• PLoS ONE: mikroRNA-137 Bidrar til Dempet tumorigenesis i Human Gastric Cancer av målretting AKT2