Achtergrond en Doelstellingen
Te identificeren en valideren van N-glycan biomarkers bij maagkanker (GC) en hun onderliggende moleculaire werkingsmechanisme te ontrafelen.
In totaal 347 individuen, waaronder patiënten met GC (maagkanker) of atrofische gastritis en gezonde controles, werden willekeurig verdeeld in een trainingsgroep (n = 287) en een retrospectieve validatie groep (n = 60). Serum N-glycaan profilering werd bereikt met DNA-sequencer-geassisteerde /fluorofoor bijgestaan koolhydraten elektroforese (DSA-FACE). Twee diagnosemodellen werden geconstrueerd op basis van de N-glycaan-profielen middels logistische stapsgewijze regressie. De diagnostische prestaties van elk model werd onderzocht in retrospectief, prospectief (n = 60), en de follow-up (n = 40) cohorten. Lectine blotting werd uitgevoerd om de totale kern-fucosylatie bepalen, en de expressie van genen betrokken bij kern-fucosylatie GC geanalyseerd door omgekeerde transcriptase-polymerase kettingreactie.
We identificeerden minstens 9 N-glycaan structuren (pieken) en de hoogte van de kern fucose residuen en fucosyltransferase waren significant afgenomen GC. Twee diagnostische modellen, aangewezen GCglycoA en GCglycoB, werden geconstrueerd om GC te onderscheiden van de controle en atrofische gastritis. De gebieden onder de receiver operating characteristic (ROC) curves (AUC) voor zowel GCglycoA en GCglycoB waren hoger dan die voor CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4. Vergeleken met CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4, de gevoeligheid van GCglycoA steeg 29,66%, 37,28%, 56,78% en 61,86%, respectievelijk, en de nauwkeurigheid verhoogd 10,62%, 16,82%, 25,67% en 28,76%, respectievelijk . Voor GCglycoB de gevoeligheid verhoogd 27,97%, 35,59%, 55,09% en 60,17% en de nauwkeurigheid verhoogd 21,26%, 24,64%, 31,40% en 34,30% vergeleken met CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4, respectievelijk. Na curatieve operatie, de kern gefucosyleerde piek (piek 3) en de totale kern gefucosyleerde N-glycanen (sumfuc) werden teruggedraaid.
De resultaten gaven aan dat de diagnostische modellen op basis van N- glycan markers zijn waardevol en invasieve alternatieven voor het identificeren van GC. We concludeerden dat de kern-fucosylatie daalde in zowel weefsel en serum van GC patiënten kunnen het gevolg zijn van de verminderde expressie van fucosyltransferase
Visum:. Liu L, Yan B, Huang J, Q Gu, Wang L, M Fang, et al. (2013) de identificatie en karakterisering van nieuwe N-glycan-gebaseerde Biomarkers bij maagkanker. PLoS ONE 8 (10): e77821. doi: 10.1371 /journal.pone.0077821
Editor: Rakesh K. Srivastava, de Universiteit van Kansas Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika
Ontvangen: 14 mei 2013; Aanvaard: 4 september 2013; Gepubliceerd: 17 oktober 2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd
Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidies 81.102.693 en 81.102.565). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript
Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan
Introductie
Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende kanker en de derde belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde dood, met een incidentie van ongeveer 930.000; per jaar, is het verantwoordelijk voor meer dan 700.000 doden wereldwijd, en de vijf-jaars overleving is 20-30% [1]. Voor patiënten met GC is overleving bepaald door het pathologische stadium van de ziekte op het moment van diagnose. Helaas, de gemeenschappelijke symptomen van GC zijn niet specifiek voor de ziekte, en de aanloopfase GC mag niet merkbaar symptomen. Ondanks de toenemende kennis van de moleculaire mechanismen die maligne transformatie en metastase regelen, heeft de totale overleving van patiënten met GC niet significant verbeterd. Verscheidene moleculen aanbevolen als GC biomarkers, waaronder carcino-antigeen (CEA) voor postoperatieve opvolging, koolhydraat antigeen 19-9 (CA19-9), koolhydraten antigen 125 (CA125) en koolhydraat antigeen 72-4 (CA72-4) [2- 6]. Geen van deze tumormarkers voldoende gevoeligheid of specificiteit aangetoond voor de diagnose GC in een vroeg stadium. Als alternatief gastroscopie verhoogt de snelheid van de definitieve diagnose, maar de diagnostische waarde van gastroscopie wordt beperkt door de kosten, risico's en ongemak. Daarom is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling van niet-invasieve biomarkers die de vroege detectie van GC schakelen.
meer gegevens suggereren de verandering van N-gelinkte glycan als potentiële biomarkers voor de diagnose van kanker kunnen worden beschouwd. Eerdere studies waargenomen significante veranderingen van N-gelinkte glycan in verschillende kankers en kankercellijnen die pancreaskanker, borstkanker, prostaatkanker, eierstokkanker en leverkanker [7-11] omvat. Aanvullende analyse in GC ook ontdekt dat vrij complex-type N-glycanen verzameld in MKN7 en MKN45 cellijnen [12]. Echter, de fluctuatie en de variatie van de N-gebonden glycan in GC patiënten zijn nog grotendeels onbekend.
In onze eerdere studies met behulp van DNA-sequencer bijgestaan /fluorofoor bijgestaan capillaire elektroforese (DSA-FACE), hebben we aangetoond dat een vertakking α-1,3-gefucosyleerd triantennaire glycan en een biantennaire glycan waren zeer specifieke en gevoelige kandidaat HCC biomerkers [13]. In de huidige studie, benut we DSA-FACE achteraf profiel serum N-glycanen in monsters van patiënten met GC of atrofische gastritis en van gezonde individuen. We karakteriseerden de geïdentificeerde GC N-glycan markers met receiver operating characteristic (ROC) curves en gevalideerd de markers in prospectieve en follow-up cohorten. Ons doel was om een veelbelovende biomarker te identificeren voor het voorspellen en het detecteren van GC met een verbeterde specificiteit en gevoeligheid
Materialen en methoden
1.1. Retrospective cohort
De studie protocol werd goedgekeurd door de Chinese ethische commissie van Human Resources bij de Tweede Militaire Medische Universiteit. Schriftelijke toestemming is verkregen van de patiënten en de gezonde controles.
In totaal zijn 247 patiënten met GC (n = 138) of atrofische gastritis (n = 109) werden aangeworven tussen 2010 en 2012. De diagnoses voor alle de ingeschreven patiënten werden histopathologisch bevestigd door 2 pathologen bij Changhai Hospital, Tweede Militaire Medische Universiteit (Shanghai, China). In de controlegroep, 128 voor leeftijd en geslacht gematchte gezonde vrijwilligers (ziektevrije) namen deel in dezelfde periode. De gemiddelde leeftijd en de geslachtsverdeling werden gevonden in de 3 groepen. Een samenvatting van de patiënt worden geleverd in tabel 1. GC patiënten die preoperatieve radiotherapie, chemotherapie of chemoradiotherapie ontvangen werden uitgesloten van de studie.
Gemiddelde ± SD of Nee (%)
Kenmerk
control (n = 128)
atrofische gastritis (n = 109)
GC (n = 138)
Age, y50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.01Men75 (58,59) 60 ( 55.05) 70 (50,72) CEA-positieve 5 (3,91) 23 (21,10) 62 (44,93) CA19-9-positieve 11 (8,59) 20 (18,35) 53 (38,41) CA125-positieve 7 (5,47) 10 (9,17) 28 (20.29) CA72-4-positieve 8 (6,25) 12 (11,01) 22 (15,94) TNM stageI22 (15.94) II28 (20.29) III63 (45,65) IV25 (18.12) Tabel 1. Kenmerken van de trainingsgroep.
Afkortingen : GC, maagcarcinoom; SD, standaarddeviatie. Download CSV CSV
Een totaal van 60 patiënten (20 per groep) werden willekeurig gekozen uit de groepen 3 hierboven voor controle achteraf beschreven; de overige patiënten (n = 315) werden opgenomen in de verzameling om de diagnostische model op training. Gedurende de 2 jaar van de studie, 40 van de 138 patiënten met GC in de trainingsgroep werden gecontroleerd voor en na curatieve operatie, op basis van beschikbaarheid. De training groep omvatte 118 patiënten met GC, 89 patiënten met atrofische gastritis, en 108 gezonde controles.
Laboratorium en klinische gegevens voor alle deelnemers werden verkregen uit klinische medische dossiers, pathologie rapporten en persoonlijke interviews. De verzamelde gegevens opgenomen geslacht, leeftijd en maagkanker kenmerken (zoals tumor locatie, histologische graad, invasiediepte, en lymfeklier). Serummonsters werden verkregen vóór de chirurgische resectie; Deze monsters werden verzameld uit volbloed met behulp van een standaard protocol, gecentrifugeerd bij 10.000 x g gedurende 20 minuten, en opgeslagen bij -80 ° C. Progressie van de ziekte in het GC-patiënten werd geclassificeerd volgens de zevende editie van het Gemengd Comité Amerikaanse [14]: 20 patiënten (16,95%) hadden stadium I, 25 (21.17%) had stadium II, 54 (45,76%) hadden het podium ziekte III, en 19 (16,10%) had stadium IV ziekte
1.2. prospective cohort
Om de voorspellende waarde van de in de retrospectieve studie hierboven beschreven bestaande modellen te evalueren, we prospectief onderzoek een extra cohort (n = 60) van de patiënten met GC (n = 20) of atrofische gastritis (n = 20) en gezonde individuen (n = 20) van mei 2012 tot november 2012 in hetzelfde ziekenhuis. De procedures en strategieën waren dezelfde als hierboven beschreven
1,3. Weefselmonsters
weefselmonsters werden verkregen uit 20 van de 138 patiënten GC; 2 segmenten, een tumor en aangrenzend weefsel monster genomen. De weefselmonsters (ongeveer 1 cm 3) werden onmiddellijk ingevroren bij -80 ° C en onderworpen aan transcriptase-polymerasekettingreactie (RT-PCR) en lectine blotten keren. Alle weefsels werden gebruikt volgens de Institutional Review Board verordeningen van de tweede militaire Medical University of 1,4. Routinedetectie van tumormarkers Routine tumormarker werden uitgevoerd onder toepassing van standaard werkwijzen en reagentia . CEA en CA19-9 werden bepaald op Abbott I2000 en CA72-4 en CA125 niveaus werden gemeten met een Roche Cobas E601. De cut-off niveaus aanbevolen door de fabrikant voor CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4 waren 5,0 ug /l, 39 U /L, 40 U /ml en 9,8 U /ml, respectievelijk. De testen werden uitgevoerd bij de afdeling Laboratory Medicine, Changhai Ziekenhuis, de Tweede Militaire Medische Universiteit, Shanghai 1.5. Serum proteïne N-Glycan profilering Serum eiwit N-glycaan analyses werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [13]. Kort samengevat, de N-glycanen in 2 ui serum werden vrijgemaakt uit de eiwitten met peptide-N-glycosidase F (PNGase F) (New England Biolabs, Boston, MA) gemerkt met 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonzuur (Invitrogen, Carlsbad, CA). Siaalzuur werd verwijderd met Arthrobacter ureafaciens De weefsels werden gehomogeniseerd met behulp van een mortier en stamper en geresuspendeerd in lysisbuffer die een proteaseremmer cocktail (Roche Diagnostics, Meylan, Frankrijk). De gelyseerde fractie werd verwijderd door centrifugeren (tweemaal bij 12000xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C). De concentratie van oplosbaar eiwit werd bepaald met de BioRad assay (BioRad, Marnes-la-Coquette, Frankrijk), en de monsters werden opgeslagen bij -80 ° C. In totaal 25 ug serum eiwit of 50 ug eiwit geëxtraheerd uit bevroren weefsel werd gescheiden door 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese. De gels werden gekleurd met CBB G250 of de proteïnen in de gel werden overgebracht op een nitrocellulose membraan (Whatman /Schleicher &Schuell, Versailles, Frankrijk) naar kern gefucosyleerde eiwitten te detecteren. De membranen werden gedurende de nacht geblokkeerd bij 4 ° C met 5% runderserumalbumine in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS: 140 mM NaCl en 10 mM Tris-HCl) en vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 5 ug /ml gebiotinyleerd lens culinaris agglutinine A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) in TBS bevattende 0,05% Tween-20 (TBST). Na 4 wasbehandelingen van 10 minuten elk met TBST werden de membranen geïncubeerd met IRDye 800CW streptavidine (1: 10.000; LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, 4 keer gewassen met TBST en ontwikkeld met de Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). Gezuiverde albumine (Sigma, St. Louis, MO) werd gebruikt als een negatieve controle voor de lectine blot 1,7. Totaal RNA extractie uit weefsel en kwantitatieve real-time PCR RNA werd geëxtraheerd uit bevroren weefsels met behulp van een Qiagen RNeasy mini kit volgens de instructies van de fabrikant (QIAGEN GmbH, Hilden, Duitsland). De zuiverheid en concentratie van het RNA werden bepaald met een spectrofotometer (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). cDNA werd gesynthetiseerd van 2 ug totaal RNA met behulp van een reverse transcriptie reagens (Toyobo, Osaka, Japan). De primers werden ontworpen met behulp van Primer Express (Applied Biosystems), en de sequenties zijn weergegeven in tabel 2. De cDNA's werden geamplificeerd in een Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR machine in een totaal reactievolume van 20 ul dat bevatte 10 pl 2X Fast SYBR Green Master Mix (Applied biosystemen, omvat Fast-Start Taq DNA polymerase reactiebuffer), de deoxynucleotide trifosfaat mix (zoals deoxyuridine trifosfaat, SYBR Green I kleurstof, en MgCl2) en 2 pi van de primers voor elk gen (in een eindconcentratie van 0,5 μΜ elk) . Elke reactie werd uitgevoerd in drievoud. De PCR cycling condities waren als volgt: denaturatie bij 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 seconden, 59 ° C of 55 ° C gedurende 15 seconden en 72 ° C gedurende 45 seconden de relatieve expressie van α-1,6-fucosyltransferase (Fut8) en guanosinedifosfaat (GDP) -fucose transporter (GDP-Fuc-Tr) in elk monster werd genormaliseerd op de expressie van het GAPDH huishoud-gen door het aftrekken van de drempel cyclus (Ct) waarde van GAPDH van die van Fut8 of GDP-Tr (ACt). Het voudig verschil werd berekend door de ACt van het testmonster dat van het controlemonster om de ΔΔCt en vervolgens de 2 ^ -ΔΔCt verkrijgen. Drempel cyclus waarden boven 40 cycli werden onder het detecteerbaar niveau beschouwd. Smelten werden verkregen voor elke reactie te garanderen dat een enkel product werd geamplificeerd 1,8. Statistische analyse Alle kwantitatieve variabelen werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijking, tenzij anders aangegeven. De kwantitatieve variabelen werden vergeleken met behulp van t-toets, variantieanalyse of parametrische toetsen. Pearson correlatiecoëfficiënten en de bijbehorende kansen (P) gebruikt om de correlaties tussen de parameters te evalueren; Spearman correlatiecoëfficiënten werden berekend voor ordinale categorische variabelen. Novel glycan biomarkers werden geïdentificeerd en gekarakteriseerd op basis van een voorwaartse stapsgewijze logistische regressie-analyse. De diagnostische prestaties van individuele biomarkers en van de diagnostische modellen werd geëvalueerd met behulp van ROC-curve analyse. De sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde (PPV), negatieve voorspellende waarde (NPV), en nauwkeurigheid werden berekend met behulp van optimale cutoff waarden die op het ROC curves. Alle gerapporteerde P-waarden zijn 2 staart, en P-waarden < 0,05 werden beschouwd als statistisch significant. De statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS 18.0 voor Windows (SPSS Inc.) Resultaten 2.1. Verschillende N-Glycan profielen bij patiënten met GC of atrofische gastritis en bij gezonde controles gebruik DSA-FACE technologie, onderzochten wij de N-glycaan-profielen bij patiënten met GC (n = 118) of atrofische gastritis (n = 89) en bij gezonde individuen (n = 108). Wij gekwantificeerd en statistisch vergeleken de pieken in de 3 groepen. Minstens 9 N-glycaan structuren (pieken) werden in alle monsters (figuur 1). Callewaert et al en Liu et al eerder publiceerde een structurele analyse van deze N-glycanen [15,16]. De gemiddelde relatieve abundantie van deze N-glycaan structuren worden weergegeven in tabel 3. De overvloed van de structuren pieken 1, 2, 3, 5, 6, 7 en 9 was significant verschillend in de GC, atrofische gastritis en gezonde controle groepen, wat aangeeft dat de verschillende N-glycaanpatronen bestond onder verschillende pathofysiologische omstandigheden. In vergelijking met de gezonde controlegroep pieken 1, 2, 5 en 9 werden verhoogd (P < 0,05) en pieken 3, 6 en 7 waren verminderd in de GC (P < 0,001). De overvloed van de structuren in pieken 3, 5, 6, 7 en 9 significant verschillend in de GC-groep vergeleken met de atrofische gastritis groep (Figuur 2). 2,2: Constructie en evaluatie van een diagnostische model op basis van N-Glycan markers maagkankerpatienten onderscheiden van gezonde controles We evalueerden de GC-gerelateerde N-glycan veranderingen op basis van een logistische regressie analyse. Logistische regressie coëfficiënten werden gebruikt om de odds ratio schatten voor elk van de onafhankelijke variabelen. De GCglycoA wiskundige formule werd gebouwd om de GC-patiënten te onderscheiden van de gezonde controles (GCglycoA = -1,072 + 0,957 * peak4-0.331 * peak6 + 0,646 * peak9). Om het vermogen van GCglycoA, CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4 GC patiënten discrimineren beoordelen, we kenmerkten de oppervlakte onder de ROC curves (AUC). In vergelijking met CEA (AUC = 0,74), CA19-9 (AUC = 0,76), CA125 (AUC = 0,72) en CA72-4 (AUC = 0,67), GCglycoA effectiever onderscheiden GC patiënten uit normale controles (AUC = 0,88) in de trainingsgroep (figuur 3A). Tabel 4 vermeldt de sensitiviteit, specificiteit, PPV, NPV, en nauwkeurigheid van de voorspelling van GC van CEA, CA19-9, CA125, CA72-4 en GCglycoA. CEA bij de aanbevolen waarde van 5,0 ng /ml een gevoeligheid van 45,76% had, 37 U /ml CA19-9 een gevoeligheid van 38,14% had, 40 U /ml CA 125 had een gevoeligheid van 18,64%, en 9,8 U /ml CA72- 4 had een gevoeligheid van 13,56%. Een optimale afkapwaarde van -0,772 werd geselecteerd voor GCglycoA basis van de ROC-curve analyse. Dit cutoff waarde GCglycoA had een gevoeligheid van 75,42%, een stijging van de gevoeligheid van 29,66%, 37,28%, 56,78% en 61,86% vergeleken met CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4, respectievelijk. De diagnostische nauwkeurigheid van GCglycoA in het onderscheiden van GC patiënten van gezonde controles steeg met 10,62%, 16,82%, 25,67% en 28,76% ten opzichte van CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4, respectievelijk. Wanneer het model werd toegepast op de retrospectieve validatiegroep de gevoeligheid verhoogd 45,00%, 45,00%, 55,00% en 55,00% en de nauwkeurigheid verhoogd 15,00%, 17,50%, 20,00% en 20,00% vergeleken met CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4 respectievelijk (Tabel 5). De prospectieve evaluatie aangegeven dat de gevoeligheid verbeterd 65,00%, 65,00%, 85,00% en 80,00% en de nauwkeurigheid verbeterde 30,00%, 27,50%, 37,50% en 37,50% ten opzichte van CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4, respectievelijk (tabel 6). 2.3: Bouw en evaluatie van een diagnostische model om maagkanker te onderscheiden van atrofische gastritis Met behulp van een logistische regressie model, een andere diagnostische model (GCglycoB) is opgericht om onderscheid te maken tussen GC en atrofische gastritis: GCglycoB = 5,273-1,371 * peak2 + 0,781 * peak4-0.453 * peak6 + 0,221 * peak9. De optimale cutoff waarde voor GCglycoB (0,594) werd geselecteerd op basis van de ROC-curve analyse. In de trainingsgroep, de AUC voor GCglycoB was 0,82, terwijl de AUC voor CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4 waren 0,65, 0,63, 0,69 en 0,64, respectievelijk (Figuur 3B). De diagnostische nauwkeurigheid van GCglycoB in het onderscheiden van GC van atrofische gastritis steeg 21,26%, 24,64%, 31,40% en 34,30% en de sensitiviteit steeg 27,97%, 35,59%, 55,09% en 60,17% ten opzichte van CEA, CA19-9, CA125 en CA72- 4, respectievelijk (Tabel 7). In de validatiegroep de nauwkeurigheid van GCglycoB 85,00% een stijging van 40,00%, 45,00%, 65,00% en 55,00% en de gevoeligheid van 85,00% geeft een stijging van 22,50%, 22,50%, 30,00% en 30,00% ten opzichte van CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4 respectievelijk (Tabel 8). In de prospectieve groep GCglycoB was nauwkeuriger (85,00% versus 30,00%, 30,00%, 10,00% en 15,00%) en gevoelige (90,00% versus 62,50%, 62,50%, 55,00% en 55,00% ) dan CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4, respectievelijk (Tabel 9). 2.4: Verminderde niveaus van totaal-core gefucosyleerde eiwitten in maagkanker Het totale niveau van de kern α-1,6-fucose residuen (de som van de pieken 1, 2, 3, 4 , 6 en 7) was significant lager (P < 0,001; Tabel 2) GC patiënten dan bij atrofische gastritis patiënten en normale controles. Om dit resultaat te bevestigen, evalueerden we de concentratie van kern gefucosyleerde eiwitten in het serum en weefsels van patiënten met behulp van GC LCA omdat zij specifiek glycoproteïnen α-1,6-gefucosyleerd-N-acetyl-D-glucosamine-asparagine (GlcNAc- herkent Asp) in de trimannosyl kern. In serum, waren er minder LCA-bindende kernfucose residuen in de GC-groep dan in de atrofische gastritis en normale groepen (Figuur 4A). De totale kern fucose overvloed was lager in GC tumoren dan in gepaarde aangrenzend weefsel (Figuur 4B). Om te bepalen of de verandering van de totale kern fucosylatie GC tumoren gerelateerd aan veranderde glycosylering biosynthese, de overvloed van zoogdier α-1,6-fucosyltransferase (Fut8) en transporter guanosinedifosfaat (GDP-Tr) in GC tumoren en aangrenzend weefsel werd geanalyseerd door RT-PCR. Uit de resultaten bleek dat Fut8 mRNA expressie was lager dan in tumoren in aangrenzende weefsel (Figuur 4C). Er was echter geen significant verschil in guanosinedifosfaat (BBP) -fucose transporter (GDP-Fuc-Tr) genexpressie tussen tumoren en aangrenzend weefsel (figuur 4D) 2.5. Veranderingen in N-Glycan markers voor en na curatieve chirurgie de hoeveelheden van de structuren pieken 1, 4 en 9 was significant verschillend na operatie in vergelijking met voor de operatie (Tabel 10). De resultaten gaven aan dat de toename van de kern gefucosyleerde piek (piek 3) en de totale kern gefucosyleerde N-glycanen (sumfuc) teruggenomen na de operatie. Tien weken na de operatie werd de GCglycoA waarde negatief in 11 van de 40 patiënten met GC, evenals de GCglycoB waarde 22 van de 40 patiënten met GC. 2,6: correlaties tussen de diagnosemodellen en klinische parameters Momenteel is de tumor biomarkers CEA, CA19-9, CA125 en CA72-4 worden veel gebruikt voor het screenen en controle van GC. Daarom hebben we de correlaties tussen de verschillende N-glycaan markers (inclusief diagnostische modellen), de tumor biomarkers en TNM. De resultaten gaven aan dat alleen het TNM positief geassocieerd met GCglycoA (r = 0,355, P < 0,001) en GCglycoB (r = 0,345, P < 0,001) (tabel 11). De overvloed van de structuren in pieken 6 en 9 was significant verschillend tussen de TNM stadia (tabel 12).
sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, CA), en de verwerkte monsters werden geanalyseerd met DSA-FACE-technologie op een capillaire elektroforese gebaseerde ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City , CA). De 9 hoogste pieken die in alle monsters gedetecteerd (goed voor > 90% van de totale serum N-glycanen) werden geanalyseerd met GeneMapper (Applied Biosystems). Elke N-glycaan structuur numeriek beschreven door het normaliseren van de hoogte op de som van de hoogten van de pieken en analyseerden we de gegevens met SPSS 18.0 statistische software (SPSS Inc., Chicago, IL).
1,6 : weefsel eiwitextractie en lectine blotten
Gene
voorwaartse primer (5'-3 ')
Reverse Primer (5'-3')
Fut85'CCTGGCGTTGGATTATGCTCA 3'5'CCCTGATCAATAGGGCCTTCT 3'GDP-Tr5'CTGCCTCAAGTACGTCGGTG 3'5'CCGATGATGATACCGCAGGTG 3'GAPDH5'ATGGGGAAGGTGAAGGTCG 3'5'GGGGTCATTGATGGCAACAATA 3'Table 2. Polymerase kettingreactie primerpaar sequenties
Afkortingen: a. adenosine; C, cytidine; G, guanosine; T, thymidine; Fut8, fucosyltransferase; GDP-Tr, guanosinedifosfaat-fucose transporter CSV Download CSV
.
Gemiddelden ± SD
Variable
control (n = 128)
atrofische gastritis (n = 108)
GC (n = 138)
F
P
Age, y a50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.010.270.766Peak 1 a6.96 ± 1.677.64 ± 2.028.20 ± 2.7510.09 < 0.001Peak 2 a1.09 ± 0.341.20 ± 0.381.31 ± 0.493.120.045Peak 3 a6.28 ± 1.636.47 ± 1.385.76 ± 1.2810.48 < 0.001Peak 4 a5.76 ± 0.935.61 ± 0.815.75 ± 0.821.120.327Peak 5 a40.02 ± 3.7539.60 ± 3.7642.16 ± 4.3314.94 < 0.001Peak 6 a21.40 ± 2.6120.51 ± 2.8516.99 ± 2.9888.36 < 0.001Peak 7 a5.87 ± 1.416.02 ± 1.715.21 ± 1.2111.15 < 0.001Peak 8 a7.94 ± 1.587.59 ± 2.247.46 ± 1.822.240.108Peak 9a2.33±0.922.59±1.554.00±1.7748.12<0.001sumfucab47.37±4.4047.47±5.3043.21±5.9427.01<0.001Table 3. N-Glycan profilering door middel van DNA-sequencer bijgestaan /fluorofoor bijgestaan capillaire elektroforese
Afkortingen:. GC, maagcarcinoom; SD, standaarddeviatie. een variantieanalyse b Sumfuc vertegenwoordigt de totale abundantie van α-1,6-gefucosyleerd structuren (de som van pieken 1, 2, 3, 4, 6 en 7). Download CSV CSV
Cutoff waarde
Actuele status, aantal onderwerpen
Test
GC +
GC
Sensitivity,%
specificiteit%
PPV,%
NPV,%
Nauwkeurigheid,%
CEA (5 ng /ml) GC + 54545.7695.3791.5361.6869.47 GC-64103CA19-9 (37 U /ml) GC + 451038.1490.7481.8257.3163.27GC-7398CA125 (40 U /ml) GC + 22718.6493.5275.8651.2754.42GC-96101CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 16813.5692.5966.6749 .5151.33GC-102100GCglycoA (-0,77) GC + 891675.4285.1984.7676.0380.09GC-2992Table 4. het Diagnostisch Macht voor Differentiatie maagcarcinoom van de controles in de Training Groep Victoire Afkortingen: + positief;. - Negatief; GC, maagcarcinoom; GCglycoA, N-glycan-marker op basis van maagkanker diagnostische model A; NPV, negatief voorspellende waarde; PPV, positief voorspellende waarde. CSV Download CSV Cutoff waarde
Actuele status, aantal onderwerpen
Test
GC +
GC
gevoeligheid,%
specificiteit%
PPV,%
NPV,%
Nauwkeurigheid,%
CEA (5 ng /ml) GC + 8040.00100.00100.0062.5070.00GC-1220CA19-9 (37 U /mL ) GC + 8140.0095.0088.8961.2967.50GC-1219CA125 (40 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420GCglycoA (-0,77) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 5. het Diagnostisch Macht voor Differentiatie maagcarcinoom van de controles in de Retrospective Verification Groep Victoire Afkortingen:. + positieve; - Negatief; GC, maagcarcinoom; GCglycoA, N-glycan-marker op basis van maagkanker diagnostische model A; NPV, negatief voorspellende waarde; PPV, positief voorspellende waarde. CSV Download CSV
Cutoff waarde
Actuele status, aantal onderwerpen
Test
GC +
GC
gevoeligheid,%
specificiteit%
PPV,%
NPV,%
Nauwkeurigheid,%
CEA (5 ng /ml) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.50GC-1419CA19-9 (37 U /mL ) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoA -0.77GC + 19.295,0090 .0090.4894.7492.50GC-118Table 6. het Diagnostisch Macht voor Differentiatie maagcarcinoom van de controles in de Prospective Verification Groep Victoire Afkortingen:. + positieve; - Negatief; GC, maagcarcinoom; GCglycoA, N-glycan-marker op basis van maagkanker diagnostische model A; NPV, negatief voorspellende waarde; PPV, positief voorspellende waarde. CSV Download CSV
Cutoff waarde
Actuele status, aantal onderwerpen
Test
GC +
GC
Sensitivity,%
specificiteit%
PPV,%
NPV,%
Nauwkeurigheid,%
CEA (5 ng /ml) GC + 541945.7678.6573.9752.2459.90GC-6470CA19-9 (37 U /ml) GC + 451738.1480.9072.5849.6656.52GC-7372CA125 (40 U /ml) GC + 22818.6491.0173.3345.7649.76GC-9681CA72-4 (9,8 U /mL ) GC + 16813.5691.0166.6744.2646.86GC-10281GCglycoB (0,594) GC + 88873.7391.0191.5872.3281.16GC-3081Table 7. het Diagnostisch Macht voor Differentiatie maagcarcinoom van atrofische gastritis in de Training Groep Victoire Afkortingen:. + positieve; - Negatief; GC, maagcarcinoom; GCglycoB, N-glycan-marker op basis van maagkanker diagnostische model B; NPV, negatief voorspellende waarde; PPV, positief voorspellende waarde. CSV Download CSV Cutoff waarde
Actuele status, aantal onderwerpen
Test
GC +
GC
gevoeligheid,%
specificiteit%
PPV,%
NPV,%
Nauwkeurigheid,%
CEA (5 ng /ml) GC + 9445.0080.0069.2359.2662.50GC-1116CA19-9 (37 U /mL ) GC + 8340.0085.0072.7358.6262.50GC-1217CA125 (40 U /ml) GC + 4220.0090.0066.6752.9455.00GC-1618CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 6430.0080.0060.0053.3355.00GC-1416GCglycoB (0,594) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 8. het Diagnostisch Macht voor Differentiatie maagcarcinoom van atrofische gastritis in de Retrospective Verification Groep Victoire Afkortingen:. + positieve; - Negatief; GC, maagcarcinoom; GCglycoB, N-glycan-marker op basis van maagkanker diagnostische model B; NPV, negatief voorspellende waarde; PPV, positief voorspellende waarde. CSV Download CSV
Cutoff waarde
Actuele status, aantal onderwerpen
Test
GC +
GC
gevoeligheid,%
specificiteit%
PPV,%
NPV,%
Nauwkeurigheid,%
CEA (5 ng /ml) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA19-9 (37 U /mL ) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoB (0,594) GC + 17185.0095.0094.4486.3690.00GC-319Table 9. het Diagnostisch Macht voor Differentiatie maagcarcinoom van atrofische gastritis in de Prospective Verification Groep Victoire Afkortingen:. + positieve; - Negatief; GC, maagcarcinoom; GCglycoB, N-glycan-marker op basis van maagkanker diagnostische model B; NPV, negatief voorspellende waarde; PPV, positief voorspellende waarde. CSV Download CSV
Gemiddelde ± SD of Mediaan (interkwartielbereik)
T
-Test
Variable
Voor de operatie
Na de operatie een
T of Z
P
Peak 1 b8.92 ± 3.748.49 ± 3.342.0380.048Peak 2 b1.24 ± 0.591.52 ± 1.74-1.0510.300Peak 3 b5.96 ± 1.526.14 ± 1.33-0.6310.531Peak 4 b5.73 ± 0.695.21 ± 1.012.6020.013Peak 5 b40.81 ± 4.8742.27 ± 5.27-1.5130.138Peak 6 b16.74 ± 2.9817.30 ± 2.61-0.8090.423Peak 7 b5.28 ± 1.505.50 ± 1.14-0.7160.478Peak 8 b7.60 ± 2.077.82 ± 1.85-0.5860.562Peak 9b4.11±1.853.29±1.692.0470.047sumfucc43.88±7.7744.16±6.10-0.2170.830GCglycoAd1.07 (0,49, 3,12) 0,28 (-0,90, 1,14) -2.7820.005GCglycoB d1.31 (0,56, 2,41) 0,41 (-0,54, 1,19) -2.3790.017Table 10. N-Glycan Profiling bij patiënten met maagkanker Voor en na curatieve chirurgie
Afkortingen:. GCglycoA en GCglycoB, N-glycan-marker op basis van maagkanker diagnostische modellen A en B, respectievelijk; SD, standaard deviatie. een Tien weken na de operatie. b Gekoppelde-sample T Electronics Test c Sumfuc geeft het totale overvloed ofα-1,6-gefucosyleerde structuren. d rangtekentoets. Download CSV CSV
Correlatie
CEA
CA19-9
CA125
CA72-4
TNM Stage
GCglycoA
GCglycoB
Peak 1r
0.210a0.127a0.006a-0.023a0.088a0.250b0.055bP
0.0160.1480.9440.7930.3160.0040.532Peak 2r
0.009a0.038a0.011a-0.067a0.010a0.224b-0.099bP
0.9170.6670.9040.4450.9060.0100.258Peak 3r
0.083a0.094a0.066a0.039a-0.115a-0.216b-0.346bP
0.3480.2860.4550.6540.1930.013<0.001Peak 4r
-0.045a0.160a0.047a-0.006a-0.091a0.122b0.074bP
0.6130.0680.5940.9430.3010.1670.403Peak 5r
-0.029a-0.156a-0.020a0.097a0.108a0.299b0.478bP
0.7430.0760.8160.2700.2180.001<0.001Peak 6r
0.009a0.020a0.044a-0.114a-0.348a-0.757b-0.787bP
0.9210.8170.6180.197<0.001<0.001<0.001Peak 7r
-0.039a0.089a-0.075a-0.161a-0.245a-0.368b-0.517bP
0.6580.3110.3940.0660.005<0.001<0.001Peak 8r
-0.135a-0.058a0.002a-0.087a-0.035a-0.215b0.011bP
0.1240.5130.9840.3210.6920.0140.897Peak 9r
0.028a-0.072a-0.034a0.095a0.315a0.794b0.591bP
0.7510.4130.7030.280<0.001<0.001<0.001GCglycoAr
-0.033b-0.042b-0.012b0.046b0.355b10.869bP
0.7100.6370.8960.605<0.001<0.001GCglycoBr
-0.052b-0.045b0.027b0.105b0.345b0.869b1P
0.5580.6110.7600.232<0.001<0.001Sumfuccr
0.061a0.151a0.040a-0.108a-0.170