PLoS ONE: Die Identifizierung und Charakterisierung neuer N-Glycan-basierten Biomarkern in Gastric Cancer

Abstrakt

Hintergrund und Ziele

N-Glycan Biomarker bei Magenkrebs (GC zur Identifizierung und Validierung ) und deren zugrunde liegenden molekularen Wirkmechanismus aufzuklären.

Methoden

insgesamt 347 Personen, mit GC (Magenkrebs) oder atrophische Gastritis und gesunden Kontrollen einschließlich Patienten wurden randomisiert in eine geteilte Trainingsgruppe (n = 287) und eine retrospektive Validierung Gruppe (n = 60). Serum-N-Glycan Profilierung wurde mit DNA-Sequenzierer-assistierte /Fluorophor-unterstützte Kohlenhydrat-Elektrophorese (DSA-FACE) erreicht. Zwei Diagnosemodelle wurden basierend auf den N-Glycan-Profile mittels logistischer Regressions schrittweise aufgebaut. Die diagnostische Leistung jedes Modell wurde in retrospektiven, prospektive bewertet (n = 60), und Follow-up (n = 40) Kohorten. Lectin-Blotting wurde durchgeführt Gesamtkern-Fucosylierung zu bestimmen, und die Expression von Genen in Kern-Fucosylierung in GC beteiligt wurde durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion analysiert.

Ergebnisse |

Wir identifizierten mindestens 9 N-Glykanstrukturen (Peaks) und die Niveaus der Kern Fucoseresten und Fucosyltransferase wurden signifikant verringert in GC. Zwei Diagnose-Modelle, bezeichnet GCglycoA und GCglycoB wurden konstruiert GC zu unterscheiden von der Kontrolle und atrophische Gastritis. Die Flächen unter den Receiver in Betrieb nehmen für beide Charakteristik (ROC) Kurven (AUC) GCglycoA und GCglycoB waren höher als die für CEA, CA19-9, CA125 und CA72-4. Verglichen mit CEA, CA19-9, CA125 und CA72-4, erhöht die Empfindlichkeit der GCglycoA 29,66%, 37,28%, 56,78% und 61,86%, bzw., und die Genauigkeit erhöht 10,62%, 16,82%, 25,67% und 28,76%, respectively . Für GCglycoB erhöhte sich die Empfindlichkeit 27,97%, 35,59%, 55,09% und 60,17% und die Genauigkeit erhöht 21,26%, 24,64%, 31,40% und 34,30% im Vergleich mit CEA, CA19-9, CA125 und CA72-4 sind. Nach kurativer Operation, wobei der Kern fukosylierte Spitze (Peak 3) und der gesamten Kern fukosylierte N-Glykane (sumfuc) rückgängig gemacht wurden.

Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse zeigten, dass die diagnostischen Modelle auf N- Basis Glycan Marker sind wertvoll und nicht-invasive Alternativen für die GC zu identifizieren. Wir schließen daraus, dass die Kern-Fukosylierung sowohl in Gewebe und Serum von GC-Patienten verringerte sich von der verminderten Expression von Fucosyltransferase führen kann

Citation:. Liu L, Yan B, Huang J, Gu Q, Wang L, Fang M, et al. (2013) Die Identifizierung und Charakterisierung neuer N-Glycan-basierten Biomarkern in Magenkrebs. PLoS ONE 8 (10): e77821. doi: 10.1371 /journal.pone.0077821

Editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 14. Mai 2013; Akzeptiert: 4. September 2013; Veröffentlicht: 17. Oktober 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grants 81102693 und 81102565) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die dritthäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Tod, mit einer Inzidenz von etwa 930.000; jährlich, ist es weltweit mehr als 700.000 Todesfälle verantwortlich, und die Fünf-Jahres-Überlebensrate beträgt 20 bis 30% [1]. Für Patienten mit GC, Überleben wird durch die pathologischen Stadium der Krankheit bei der Diagnose bestimmt. Leider sind die häufigsten Symptome von GC auf die Krankheit nicht spezifisch, und frühzeitig GC kann nicht erkennbaren Symptome verursachen. Trotz zunehmender Kenntnis der molekularen Mechanismen, die maligne Transformation und Metastasierung regulieren, die Gesamtüberlebensrate von Patienten mit GC hat sich nicht wesentlich verbessert. Verschiedene Moleküle wurden als GC Biomarkern, einschließlich carcinoembryonales Antigen (CEA) zur postoperativen Überwachung, Kohlenhydrat-Antigen 19-9 (CA 19-9), Kohlenhydrat-Antigen 125 (CA125) und Kohlenhydrat-Antigen 72-4 (CA72-4) empfohlen worden [2- 6]. Jedoch keines dieser Tumormarker wurde in einem frühen Stadium zu diagnostizieren GC ausreichende Empfindlichkeit oder Spezifität nachgewiesen. Alternativ erhöht Gastros die Rate der endgültigen Diagnosen, sondern der diagnostische Wert der Gastroskopie wird von Kosten, Risiken und Unannehmlichkeiten beschränkt. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung von nicht-invasive Biomarker, die die Früherkennung von GC ermöglichen.

Zunehmende Hinweise darauf, die Änderung von N-gebundenen Glycane als potentielle Biomarker für die Diagnose von Krebs angesehen werden könnten. Frühere Studien beobachteten eine signifikante Veränderungen von N-verknüpften Glycan in verschiedenen Krebserkrankungen und Krebszelllinien, die Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs und Leberkrebs [7-11] enthält. Eine zusätzliche Analyse in GC auch aufgedeckt, dass der freie Komplex-Typ-N-Glykane akkumuliert in MKN7 und MKN45 Zelllinien [12]. Jedoch sind die Schwankungen und Variation von N-linked glycan in GC Patienten noch weitgehend unbekannt.

In unseren früheren Studien unter Verwendung von DNA-Sequenzer-assisted /Fluorophor-assisted Kapillarelektrophorese (DSA-FACE), haben wir gezeigt, dass eine Verzweigungs α-1,3-fucosyliertes triantennäre Glykan und eine biantennären Glykan waren sehr spezifisch und sensitiv Kandidaten HCC Biomarkern [13]. In der aktuellen Studie verwendeten wir die DSA-FACE N-Glykane Serum-Proben von Patienten retrospektiv Profil mit GC oder atrophische Gastritis und von gesunden Personen. Wir charakterisiert die identifizierten GC N-Glycan Marker mit receiver operating characteristic (ROC) Kurven und validiert die Markierungen in prospektiven und Follow-up-Kohorten. Unser Ziel war es, ein vielversprechender Biomarker für die Vorhersage und den Nachweis GC mit verbesserter Sensitivität und Spezifität zu identifizieren

Materialien und Methoden

. 1.1: retrospektive Kohorten

Das Studienprotokoll durch genehmigt wurde die chinesische Ethikkommission für Humanressourcen auf der Zweiten Military Medical University. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von den Patienten und den gesunden Kontrollen erhalten.

Insgesamt 247 Patienten mit GC (n = 138) oder atrophische Gastritis (n = 109) wurden zwischen 2010 und 2012 rekrutiert Die Diagnosen für alle die teilnehmenden Patienten wurden histologisch durch zwei Pathologen Changhai Hospital, Second Military Medical University (Shanghai, China) bestätigt. In der Kontrollgruppe, 128 alters- und geschlechts gleichaltrigen gesunden Probanden (krankheitsfreie) wurden im gleichen Zeitraum eingeschrieben. Das mittlere Alter und die Geschlechtsverteilung wurden in den drei Gruppen abgestimmt. Eine Zusammenfassung der Patientendaten ist in Tabelle 1 GC Patienten zur Verfügung gestellt, die von der Studie ausgeschlossen präoperative Strahlentherapie, Chemotherapie oder Radiochemotherapie empfangen wurden.
Mittelwert ± SD oder Nein (%)
Charakteristisch
Control (n = 128)
atrophische Gastritis (n = 109)
GC (n = 138)
Alter, y50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.01Men75 (58.59) 60 ( 55.05) 70 (50.72) CEA-positiv 5 (3,91) 23 (21.10) 62 (44.93) CA19-9-positive 11 (8,59) 20 (18.35) 53 (38.41) CA125-positive 7 (5,47) 10 (9,17) 28 (20.29) CA72-4-positiv 8 (6,25) 12 (11.01) 22 (15.94) TNM stageI22 (15.94) II28 (20,29) III63 (45,65) IV25 (18,12) Tabelle 1. Eigenschaften der Trainingsgruppe.
Abkürzungen GC, Magenkarzinom; SD, Standardabweichung. Download CSV CSV

Insgesamt 60 Patienten (20 in jeder Gruppe) wurden aus den drei Gruppen zufällig ausgewählten oben für die nachträgliche Überprüfung beschrieben; Die übrigen Patienten (n = 315) wurden in der Ausbildung gesetzt zu konstruieren, das Diagnosemodell enthalten. Während der 2 Jahre der Studie, 40 der 138 Patienten mit GC in der Trainingsgruppe wurden vor überwacht und nach kurativer Operation, je nach Verfügbarkeit. Die Trainingsgruppe enthalten 118 Patienten mit GC, 89 Patienten mit atrophischen Gastritis und 108 gesunden Kontrollpersonen.

Labor- und klinische Daten für alle Teilnehmer aus der klinischen medizinischen Aufzeichnungen erhalten wurden, Pathologie Berichte und persönliche Interviews. Die gesammelten Daten enthalten Geschlecht, Alter, und Magenkrebs-Features (wie zB Tumorlokalisation, histologische Grad, Tiefe der Invasion und Lymphknotenmetastasen). Serumproben wurden vor der chirurgischen Resektion erhalten wird; Diese Proben wurden aus Vollblut gesammelt, um ein Standardprotokoll, für 20 Minuten bei 10.000 zentrifugiert und bei -80 ° C gelagert. Der Verlauf der Erkrankung in den GC-Patienten wurde klassifiziert nach der siebten Ausgabe des American Joint Committee [14]: 20 Patienten (16,95%) hatten Stadium I, 25 (21,17%) hatte Stadium II, 54 (45,76%) hatte Bühne III Krankheit, und 19 (16,10%) hatten Stadium IV

. 1.2: Prospektive Kohorten

Um den prädiktiven Wert der oben beschriebenen in der retrospektiven Studie etablierten Modelle zu bewerten, wir prospektiv untersucht ein zusätzliche Kohorte (n = 60) der Patienten mit GC (n = 20) oder atrophische Gastritis (n = 20) und von gesunden Personen (n = 20) ab Mai 2012 bis November 2012 im selben Krankenhaus. Die Verfahren und Strategien waren die gleichen wie die oben beschriebenen

1.3. Gewebeproben

Gewebeproben von 20 der 138 GC-Patienten erhalten wurden; 2 Scheiben, ein Tumor und eine benachbarte Gewebeprobe wurden entnommen. Die Gewebeproben (ungefähr 1 cm ^{3) wurden sofort bei -80 ° C eingefroren und einer Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und Lectin-Blotting kehren. Alle Gewebe wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Review Board Ordnung der Zweiten Military Medical University verwendet}

1.4. Routine Nachweis von Tumormarkern

Routine Tumormarker Assays wurden unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt und Reagenzien . CEA und CA 19-9-Spiegel wurden auf einem Abbott I2000 bestimmt und CA72-4 und CA125-Spiegel wurden mit einem Roche Cobas E601 gemessen. Die abgeschnittenen Stufen vom Hersteller empfohlenen für CEA, CA19-9, CA125 und CA72-4 waren 5,0 &mgr; g /L, 39 U /L, 40 U /ml und 9,8 U /ml. Die Tests wurden in der Abteilung für Laboratoriumsmedizin, Changhai Hospital, dem Zweiten Military Medical University, Shanghai durchgeführt

1.5. Serumprotein N-Glycan Profilierungs

Serumprotein N-Glycan Analysen wurden durchgeführt wie zuvor beschrieben [13]. Kurz gesagt, mit 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonsäure aus den Proteinen mit Peptid-N-Glykosidase F (PNGase F) (New England Biolabs, Boston, MA) markiert freigegeben die N-Glycane in 2 &mgr; l Serum wurden (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sialinsäure wurde mit entfernt Arthrobacter ureafaciens
Sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, CA), und die verarbeiteten Proben wurden DSA-FACE-Technologie analysiert auf einer Kapillarelektrophorese-basierten ABI3

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