Résumé
Contexte et Objectifs
Pour identifier et valider des biomarqueurs N-glycanes dans le cancer gastrique (GC ) et d'élucider leur mécanisme moléculaire sous-jacent de l'action.
Méthodes
au total, 347 personnes, y compris les patients avec GC (cancer gastrique) ou la gastrite atrophique et des contrôles sains, ont été répartis au hasard en un groupe d'entraînement (n = 287) et un groupe de validation rétrospectif (n = 60). Sérum profilage N-glycanes a été réalisé avec séquenceur d'ADN assistée /électrophorèse glucide assistée fluorophore (DSA-FACE). Deux modèles de diagnostic ont été construits sur la base des profils N-glycanes utilisant une régression progressive logistique. Les performances diagnostiques de chaque modèle a été évalué en rétrospective, prospective (n = 60), et le suivi (n = 40) cohortes. Lectine blot a été effectuée pour déterminer core-fucosylation totale, et l'expression de gènes impliqués dans le noyau-fucosylation en GC a été analysé par réaction en chaîne transcriptase-polymerase inverse.
Nous avons identifié au moins 9 structures N-glycanes (pics) et les niveaux de résidus de fucose de base et fucosyltransférase ont été significativement diminué en GC. Deux modèles de diagnostic, GCglycoA désigné et GCglycoB, ont été construits pour différencier GC du contrôle et de la gastrite atrophique. Les zones sous le récepteur d'exploitation (ROC) courbes caractéristiques (AUC) pour les deux GCglycoA et GCglycoB étaient plus élevés que ceux pour le CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4. Comparé avec le CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4, la sensibilité des GCglycoA a augmenté 29,66%, 37,28%, 56,78% et 61,86%, respectivement, et la précision a augmenté de 10,62%, 16,82%, 25,67% et 28,76%, respectivement . Pour GCglycoB, la sensibilité a augmenté 27,97%, 35,59%, 55,09% et 60,17% et la précision a augmenté 21,26%, 24,64%, 31,40% et 34,30% par rapport à l'ACE, CA19-9, CA125 et CA72-4, respectivement. Après la chirurgie curative, le noyau fucosylé pic (pic 3) et le noyau totale fucosylées-glycanes N (sumfuc) était inversée.
Les résultats indiquent que les modèles de diagnostic basés sur N- marqueurs glycanes sont des alternatives valables et non invasifs pour identifier GC. Nous avons conclu que la diminution de base-fucosylation dans le tissu et le sérum de patients atteints de GC peut résulter de l'expression réduite de fucosyltransférase
Citation:. Liu L, Yan B, Huang J, Gu Q, Wang L, Fang M, et al. (2013) L'identification et la caractérisation du Biomarkers N-glycane à base-Novel dans le cancer gastrique. PLoS ONE 8 (10): e77821. doi: 10.1371 /journal.pone.0077821
Editeur: Rakesh K. Srivastava, L'Université du Kansas centre médical, États-Unis d'Amérique
Reçu: 14 mai 2013; Accepté: 4 Septembre 2013; Publié le 17 Octobre, 2013 |
Droit d'auteur: © 2013 Liu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités
Financement:. Ce travail a été soutenu par la national science Foundation naturelles de Chine (subventions 81102693 et 81102565). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit
Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent
Introduction
le cancer gastrique (GC) est le quatrième cancer le plus répandu et la troisième principale cause de décès lié au cancer, avec une incidence d'environ 930.000; chaque année, il est responsable de plus de 700.000 décès dans le monde, et le taux de survie à cinq ans est de 20-30% [1]. Pour les patients atteints de GC, la survie est dictée par le stade pathologique de la maladie au moment du diagnostic. Malheureusement, les symptômes communs de GC ne sont pas spécifiques à la maladie, et GC à un stade précoce peuvent ne pas causer de symptômes visibles. Malgré l'amélioration des connaissances des mécanismes moléculaires qui régulent la transformation maligne et les métastases, le taux de survie globale des patients atteints de GC n'a pas amélioré de manière significative. Plusieurs molécules ont été recommandées comme biomarqueurs du GC, y compris l'antigène carcinoembryonnaire (CEA) pour la surveillance post-opératoire, hydrate de carbone antigène 19-9 (CA19-9), hydrate de carbone antigène 125 (CA125) et de l'antigène glucidique 72-4 (CA72-4) [2- 6]. Cependant, aucun de ces marqueurs tumoraux a démontré une sensibilité ou une spécificité suffisante pour le diagnostic de GC à un stade précoce. Alternativement, gastroscopie augmente le taux de diagnostics définitifs, mais la valeur diagnostique de la gastroscopie est limitée par le coût, les risques et les inconvénients. Par conséquent, il existe un besoin urgent pour le développement de biomarqueurs non invasives qui permettent la détection précoce du GC.
augmentation de la preuve suggère la modification des glycanes liés à N peut être considéré comme un des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic du cancer. Des études antérieures ont observé un changement significatif de glycanes liés à N dans différents cancers et des lignées cellulaires du cancer qui comprend le cancer du pancréas, le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer de l'ovaire et le cancer du foie [7-11]. Une analyse supplémentaire en GC a également découvert que de type complexe libre N-glycanes accumulés dans des lignées cellulaires MKN7 et MKN45 [12]. Cependant, la fluctuation et de variation des glycanes N-liés chez les patients du GC sont encore largement inconnus.
Dans nos études précédentes en utilisant l'aide séquenceur /électrophorèse capillaire assistée fluorophore-ADN (DSA-FACE), nous avons démontré qu'une ramification α-1,3-fucosylées triantennés glycane et un glycane biantennées étaient très spécifiques et candidats sensibles biomarqueurs CHC [13]. Dans l'étude actuelle, nous avons utilisé DSA-FACE à sérum rétrospectivement profil N-glycanes dans des échantillons provenant de patients avec GC ou gastrite atrophique et d'individus sains. Nous avons caractérisé les marqueurs GC N-glycanes identifiés avec le récepteur d'exploitation (ROC) courbes et validé les marqueurs dans des cohortes prospectives et le suivi. Notre objectif était d'identifier un biomarqueur prometteur pour la prévision et la détection de GC avec une meilleure spécificité et une sensibilité
Matériel et méthodes
1.1:. Retrospective cohorte
Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'éthique chinois des Ressources humaines à la deuxième université médicale militaire. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir des patients et des témoins en bonne santé.
Au total, 247 patients avec GC (n = 138) ou gastrite atrophique (n = 109) ont été recrutés entre 2010 et 2012. Les diagnostics pour tous les les patients inscrits ont été histopathologique confirmés par 2 pathologistes à l'hôpital Changhai, Deuxième université médicale militaire (Shanghai, Chine). Dans le groupe témoin, 128 volontaires sains d'âge et le sexe (sans maladie) ont été inscrits au cours de la même période. L'âge moyen et la répartition par sexe ont été appariés dans les 3 groupes. Un résumé des données du patient est fourni dans le tableau 1. patients du GC qui ont reçu une radiothérapie préopératoire, chimiothérapie ou radiochimiothérapie ont été exclus de l'étude.
Moyenne ± écart-type ou No. (%)
Caractéristique
contrôle (n = 128)
atrophique Gastrite (n = 109)
GC (n = 138)
Âge, y50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.01Men75 (58.59) 60 ( 55.05) 70 (50.72) CEA-positif 5 (3,91) 23 (21.10) 62 (44.93) CA19-9 positif 11 (8,59) 20 (18.35) 53 (38.41) CA125 positif 7 (5,47) 10 (9,17) 28 (20.29) CA72-4 positif 8 (6,25) 12 (11.01) 22 (15,94) TNM stageI22 (15,94) II28 (20.29) III63 (45.65) IV25 (18.12) Tableau 1. Caractéristiques du groupe de formation.
abréviations MGC, un carcinome gastrique; SD, écart-type. CSV Télécharger CSV
Un total de 60 patients (20 dans chaque groupe) ont été choisis au hasard parmi les 3 groupes décrits ci-dessus pour la vérification rétrospective; les autres patients (n = 315) ont été inclus dans l'ensemble d'apprentissage pour construire le modèle de diagnostic. Au cours des 2 années de l'étude, 40 des 138 patients avec GC dans le groupe de formation ont été suivis avant et après la chirurgie curative, selon la disponibilité. Le groupe de formation inclus 118 patients avec GC, 89 patients atteints de gastrite atrophique, et 108 témoins sains.
Laboratoire et les données cliniques pour tous les participants ont été obtenus à partir des dossiers cliniques médicales, les rapports de pathologie et d'entrevues personnelles. Les données recueillies comprenaient le sexe, l'âge, et les caractéristiques de cancer gastrique (comme l'emplacement de la tumeur, le grade histologique, la profondeur de l'invasion et métastases ganglionnaires). Des échantillons de sérum ont été obtenus avant résections chirurgicales; ces échantillons ont été prélevés dans le sang entier en utilisant un protocole standard, on centrifuge à 10.000 x pendant 20 minutes et stockés à -80 ° C. progression de la maladie chez les patients du GC a été classé en fonction de la septième édition de l'American Joint Committee [14]: 20 patients (16,95%) avaient une maladie I stade, 25 (21,17%) avait la maladie II, 54 (45,76%) stade eu étape III de la maladie, et 19 (16,10%) avaient une maladie de stade IV
1.2:. prospective cohorte
Pour évaluer la valeur prédictive des modèles établis dans l'étude rétrospective décrit ci-dessus, nous prospectivement étudié un cohorte additionnelle (n = 60) des patients avec GC (n = 20) ou gastrite atrophique (n = 20) et des individus en bonne santé (n = 20) de mai 2012 à Novembre 2012 au même hôpital. Les procédures et les stratégies sont les mêmes que celles décrites ci-dessus
1,3.
Les échantillons de tissu du tissu Des échantillons ont été obtenus à partir de 20 des 138 patients atteints de GC; 2 tranches, une tumeur et un échantillon de tissu adjacent, ont été prises. Les échantillons de tissu (environ 1 cm 3) ont été immédiatement congelés à -80 ° C et on les soumet à inverser la réaction en chaîne par polymérase-transcriptase (RT-PCR) et la lectine Blot. Tous les tissus ont été utilisés conformément au Règlement de la Seconde Université médicale militaire Institutional Review Board 1.4:. La détection systématique des marqueurs tumoraux Routine dosages des marqueurs tumoraux ont été effectuées en utilisant des méthodes et des réactifs standards . niveaux CEA et CA19-9 ont été déterminés sur un I2000 Abbott, et les niveaux CA72-4 et CA125 ont été mesurées en utilisant un Roche Cobas E601. Les niveaux de coupure recommandés par le fabricant pour le CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4 étaient 5,0 pg /L, 39 U /L, 40 U /ml et 9,8 U /ml, respectivement. Les essais ont été réalisés au sein du Département de médecine de laboratoire, Hôpital Changhai, la deuxième université médicale militaire, Shanghai 1.5:. Profilage protéines sériques N-Glycan protéines sériques analyses N-glycanes ont été réalisées comme décrit précédemment [13]. En bref, les N-glycanes dans 2 ul de sérum ont été libérés à partir des protéines avec le peptide-N-glycosidase F (PNGase F) (New England Biolabs, Boston, MA) marqués avec l'acide 8-aminonaphtalène-1,3,6-trisulfonique (Invitrogen, Carlsbad, CA). L'acide sialique a été éliminé en utilisant la sialidase de Arthrobacter ureafaciens (Roche Bioscience, Palo Alto, CA), et les échantillons traités ont été analysés en utilisant la technologie DSA-FACE sur un analyseur à base d'électrophorèse capillaire ABI3130 génétique (Applied Biosystems, Foster City , CALIFORNIE). Les 9 plus hauts sommets qui ont été détectés dans tous les échantillons (représentant > 90% du sérum total de N-glycanes) ont été analysées à l'aide GeneMapper (Applied Biosystems). Chaque structure N-glycanes a été décrite numériquement en normalisant sa hauteur à la somme des hauteurs de tous les sommets, et nous avons analysé ces données en utilisant SPSS 18.0 logiciel statistique (SPSS Inc., Chicago, IL). Les tissus ont été homogénéisés en utilisant un mortier et un pilon et remises en suspension dans un tampon de lyse contenant un cocktail d'inhibiteurs de la protéase (Roche Diagnostics, Meylan, France). La fraction non lysé a été éliminé par centrifugation (deux fois à 12000xg pendant 10 minutes à 4 ° C). La concentration de la protéine soluble a été déterminée en utilisant l'essai BioRad (BioRad, Marnes-la-Coquette, France), et les échantillons ont été conservés à -80 ° C. Au total, 25 pg de protéine de sérum ou de 50 ug de protéines extraites à partir de tissu congelé a été séparé par électrophorèse sur polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium à 10% de gel. Les gels ont été colorés avec du CBB G250 ou les protéines dans le gel ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (Whatman /Schleicher &Schuell, Versailles, France) pour détecter les protéines de noyau fucosylé. Les membranes ont été bloquées pendant une nuit à 4 ° C avec 5% de sérum albumine bovine dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS: NaCl 140 mM et du Tris-HCl 10 mM) et ensuite mis en incubation pendant 1 heure à température ambiante avec 5 ug /mL de lentille biotinylé culinaris agglutinine A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) dans du TBS contenant 0,05% de Tween-20 (TBST). Après 4 lavages de 10 minutes chacune avec TBST, les membranes ont été incubées avec IRDye 800CW streptavidine (1: 10.000; LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) pendant 1 heure à température ambiante, lavé 4 fois avec TBST, et développé à l'aide de l'Odyssée système d'imagerie infrarouge (LI-COR Biosciences). albumine purifiée (Sigma, St. Louis, MO) a été utilisé comme témoin négatif pour le transfert de lectine 1.7:. extraction de l'ARN total à partir de tissus et quantitative en temps réel ARN a été extrait à partir de tissus congelés en utilisant un kit Qiagen RNeasy selon les instructions du fabricant (QIAGEN GmbH, Hilden, Allemagne). La pureté et la concentration de l'ARN ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre (Eppendorf, Hambourg, Allemagne). L'ADNc a été synthétisé à partir de 2 pg d'ARN total en utilisant un réactif de transcription inverse (Toyobo, Osaka, Japon). Les amorces ont été conçues en utilisant Primer Express (Applied Biosystems), et les séquences sont présentées dans le tableau 2. Les ADNc ont été amplifiés dans une 7300 machine de PCR Applied Biosystems en temps réel dans un volume total de réaction de 20 ul contenant 10 pi de 2X rapide SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, comprend fast-Start Taq DNA tampon de réaction de polymerase), le mélange désoxynucléotide triphosphate (y compris désoxyuridine triphosphate, colorant SYBR Green I, et MgCl2) et 2 ul d'amorces pour chaque gène (à une concentration finale de 0,5 μΜ chacun) . Chaque réaction a été réalisée en triple. Les conditions de cycle de PCR étaient les suivantes: dénaturation à 95 ° C pendant 5 minutes, suivi de 40 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes, 59 ° C ou 55 ° C pendant 15 secondes et 72 ° C pendant 45 secondes l'expression relative de α-1,6-fucosyltransférase (FUT8) et guanosine diphosphate (PIB) transporteur -fucose (PIB-fuc-Tr) dans chaque échantillon a été normalisé à l'expression du gène GAPDH de ménage en soustrayant le seuil le cycle (Ct) valeur de GAPDH de celle de FUT8 ou GDP-Tr (ACt). La différence pliure a été calculé en soustrayant le ACt de l'échantillon de test à partir de celle de l'échantillon témoin afin d'obtenir le ΔΔCt, puis le 2 ^ -ΔΔCt. Les valeurs de cycle de seuil au-delà de 40 cycles ont été considérés en dessous du niveau détectable. Faire fondre les courbes ont été obtenues pour chaque réaction de garantir qu'un seul produit a été amplifié 1.8. L'analyse statistique Toutes les variables quantitatives ont été exprimés en moyenne ± écart-type, sauf indication contraire. Les variables quantitatives ont été comparées en utilisant le test t de Student, analyse de la variance, ou tests non paramétriques. Les coefficients de corrélation de Pearson et les probabilités associées (P) ont été utilisés pour évaluer les corrélations entre les paramètres; Les coefficients de corrélation de Spearman ont été calculées pour les variables ordinales. biomarqueurs glycanes nouveaux ont été identifiés et caractérisés basés sur une analyse prospective de régression logistique. Les performances diagnostiques de biomarqueurs individuels et des modèles de diagnostic a été évaluée en utilisant ROC analyse de la courbe. La sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive (VPP), la valeur prédictive négative (VPN), et la précision ont été calculées en utilisant les valeurs de coupure optimales sélectionnées à partir des courbes ROC. Toutes les valeurs de p rapportées sont 2 à queue, et P valeurs < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant SPSS 18.0 pour Windows (SPSS Inc.) Résultats 2.1:. Profils de N-glycanes différents chez les patients avec GC ou gastrite atrophique et dans les contrôles sains en utilisant la technologie DSA-FACE, nous avons examiné les profils N-glycanes chez les patients avec GC (n = 118) ou gastrite atrophique (n = 89) et chez les sujets sains (n = 108). Nous avons quantifié et statistiquement comparé les pics dans les 3 groupes. Au moins 9 structures N-glycanes (pics) ont été identifiés dans tous les échantillons (figure 1). Callewaert et al et Liu et al précédemment publié une analyse structurelle de ces N-glycanes [15,16]. L'abondance relative moyenne de ces structures de N-glycane est présenté dans le tableau 3. L'abondance des structures de pics 1, 2, 3, 5, 6, 7 et 9 était significativement différente dans la GC, gastrite atrophique, et le contrôle en bonne santé groupes, indiquant que les différents modèles de N-glycane existaient dans diverses conditions physiopathologiques. Par rapport au groupe témoin sain, pics 1, 2, 5 et 9 ont été augmentés (P < 0,05) et les pics 3, 6 et 7 ont été réduites dans le groupe GC (P < 0,001). L'abondance des structures des pics 3, 5, 6, 7 et 9 était significativement différente dans le groupe GC par rapport au groupe de gastrite atrophique (Figure 2). 2.2: Construction et évaluation d'un modèle de diagnostic basé sur les marqueurs N-glycanes pour différencier les patients atteints de cancer gastrique de témoins sains Nous avons évalué les modifications N-glycanes liés GC basée sur une régression logistique une analyse. Les coefficients de régression logistique ont été utilisés pour estimer les rapports de cotes pour chacune des variables indépendantes. La formule mathématique GCglycoA a été construit pour différencier les patients du GC à partir des témoins sains (GCglycoA = -1,072 + 0,957 * peak4-0.331 * PEAK6 + 0,646 * peak9). Pour évaluer la capacité de GCglycoA, CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4 à discriminer les patients du GC, nous avons caractérisé la zone sous la courbe ROC (AUC). Comparé avec le CEA (AUC = 0,74), CA19-9 (AUC = 0,76), CA125 (AUC = 0,72) et CA72-4 (AUC = 0,67), GCglycoA plus efficacement distingués patients du GC de contrôles normaux (AUC = 0,88) dans le groupe de formation (figure 3A). Le tableau 4 présente la sensibilité, la spécificité, VPP, VPN, et la précision de la prédiction de la GC par le CEA, CA19-9, CA125, CA72-4 et GCglycoA. CEA à la valeur recommandée de 5,0 ng /ml a une sensibilité de 45,76%, 37 U /ml CA19-9 avait une sensibilité de 38,14%, 40 U /ml CA125 avait une sensibilité de 18,64%, et 9,8 U /mL CA72- 4 avaient une sensibilité de 13,56%. Une valeur de seuil optimale de -0,772 a été sélectionné pour GCglycoA basé sur l'analyse de la courbe ROC. A cette valeur de coupure, GCglycoA avait une sensibilité de 75,42%, ce qui est une augmentation de la sensibilité de 29,66%, 37,28%, 56,78% et 61,86% par rapport à l'ACE, CA19-9, CA125 et CA72-4, respectivement. La précision diagnostique de GCglycoA pour différencier les patients du GC de contrôles sains ont augmenté de 10,62%, 16,82%, 25,67% et 28,76% par rapport à l'ACE, CA19-9, CA125 et CA72-4, respectivement. Lorsque le modèle a été appliqué au groupe de validation a posteriori, la sensibilité accrue 45,00%, 45,00%, 55,00% et 55,00% et la précision accrue 15,00%, 17,50%, 20,00% et 20,00% par rapport au CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4, respectivement (Tableau 5). la valeur de Cutoff L'évaluation prospective a indiqué que la sensibilité améliorée 65.00%, 65.00%, 85.00% et 80.00% et la précision améliorée 30,00%, 27,50%, 37,50% et 37,50% par rapport à l'ACE, CA19-9, CA125 et CA72-4, respectivement (tableau 6). valeur 2.3: Construction et évaluation d'un modèle de diagnostic pour différencier le cancer gastrique de gastrite atrophique L'utilisation d'un modèle de régression logistique, un autre modèle de diagnostic (GCglycoB) a été créé pour la différence entre GC et gastrite atrophique: GCglycoB = 5,273 à 1,371 * + 0,781 * pointe 2 peak4-0.453 * PEAK6 + 0,221 * peak9. La valeur de coupure optimale pour GCglycoB (0,594) a été choisi en fonction de l'analyse ROC de la courbe. Dans le groupe de formation, l'AUC pour GCglycoB était de 0,82, alors que les AUC pour le CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4 étaient 0,65, 0,63, 0,69 et 0,64, respectivement (figure 3B). La précision diagnostique de GCglycoB dans la différenciation GC de gastrite atrophique a augmenté 21,26%, 24,64%, 31,40% et 34,30% et la sensibilité a augmenté 27,97%, 35,59%, 55,09% et 60,17% par rapport à l'ACE, CA19-9, CA125 et CA72- 4, respectivement (Tableau 7). Dans le groupe de validation, l'exactitude 85.00% du GCglycoB représente une augmentation de 40,00%, 45,00%, 65,00% et 55,00% et la sensibilité 85,00% ont indiqué une augmentation de 22,50%, 22,50%, 30,00% et 30,00% par rapport avec le CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4, respectivement (tableau 8). la valeur de Cutoff Dans le groupe prospective, GCglycoB était plus précis (85,00% contre 30,00%, 30,00%, 10,00% et 15,00%) et sensible (90,00% contre 62,50%, 62,50%, 55,00% et 55,00% ) que le CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4, respectivement (tableau 9). valeur 2.4: niveaux de protéines de base-fucosylé total a diminué dans le cancer gastrique Le niveau total de base α-1,6-fucose résidus (la somme des pics 1, 2, 3, 4 , 6 et 7) était significativement plus faible (P < 0,001; Tableau 2) chez les patients atteints de GC que chez les patients atteints de gastrite atrophique et les contrôles normaux. Pour confirmer cette conclusion, nous avons évalué la concentration du noyau fucosylé protéines dans le sérum et les tissus des patients atteints de GC en utilisant l'ACV, car il reconnaît spécifiquement des glycoprotéines avec des α-1,6-fucosylé-N-acétyl-D-glucosamine-asparagine (GlcNAc- Asp) dans le noyau trimannosyle. Dans le sérum, il y avait moins de résidus de fucose base LCA liaison dans le groupe GC que dans la gastrite atrophique et groupes normaux (Figure 4A). L'abondance totale noyau de fucose était plus faible dans les tumeurs du GC que dans les tissus adjacents appariés (figure 4B). Pour déterminer si le changement de fucosylation de base total dans les tumeurs du GC a été liée à altérée glycosylation biosynthèse, l'abondance des mammifères α-1,6-fucosyltransférase (FUT8) et guanosine diphosphate transporteur (PIB-Tr) dans les tumeurs du GC et les tissus adjacents ont été analysées par RT-PCR. Les résultats ont révélé que l'expression de l'ARNm FUT8 était plus faible dans les tumeurs que dans les tissus adjacents (figure 4C). Cependant, il n'y avait pas de différence significative dans la guanosine diphosphate (PIB) transporteur -fucose (PIB-fuc-Tr) l'expression génique entre les tumeurs et les tissus adjacents (figure 4D) 2.5. Évolution des marqueurs N-Glycan avant et après chirurgie curative L'abondance des structures de pics 1, 4 et 9 était significativement différente après la chirurgie par rapport à avant la chirurgie (tableau 10). Les résultats indiquent que les augmentations dans le noyau fucosylé pic (pic 3) et un total de base fucosylé N-glycanes (sumfuc) ont été inversés après la chirurgie. Dix semaines après la chirurgie, la valeur GCglycoA est devenue négative dans 11 des 40 patients avec GC, comme l'a fait la valeur de GCglycoB dans 22 des 40 patients avec GC. 2.6: Corrélation entre les modèles de diagnostic et les paramètres cliniques Actuellement, les biomarqueurs de tumeur CEA, CA19-9, CA125 et CA72-4 sont largement utilisés pour le dépistage et le suivi du GC. Par conséquent, nous avons déterminé les corrélations entre les marqueurs individuels N-glycane (y compris les modèles de diagnostic), les biomarqueurs de la tumeur et le stade TNM. Les résultats indiquent que seul le stade TNM était positivement associée à GCglycoA (r = 0,355, P < 0,001) et GCglycoB (r = 0,345, P < 0,001) (tableau 11). L'abondance des structures de pics 6 et 9 était significativement différente entre les stades TNM (tableau 12).
1.6 :
extraction de la protéine tissulaire et lectine buvard
PCR
Gene
Forward Primer (5'-3 ')
inverse Primer (5'-3')
Fut85'CCTGGCGTTGGATTATGCTCA 3'5'CCCTGATCAATAGGGCCTTCT 3'GDP-Tr5'CTGCCTCAAGTACGTCGGTG 3'5'CCGATGATGATACCGCAGGTG 3'GAPDH5'ATGGGGAAGGTGAAGGTCG 3'5'GGGGTCATTGATGGCAACAATA 3'Table 2. Polymerase chain reaction amorces séquences de paires
abréviations:. A adénosine; C, de la cytidine; G, la guanosine; T, de la thymidine; FUT8, fucosyltransférase; PIB-Tr, guanosine diphosphate-fucose transporteur CSV Télécharger CSV
.
Moyens ± SD
contrôle variable (n = 128)
atrophique Gastrite (n = 108)
GC (n = 138)
F
P
Âge, y a50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.010.270.766Peak 1 a6.96 ± 1.677.64 ± 2.028.20 ± 2.7510.09 < 0.001Peak 2 a1.09 ± 0.341.20 ± 0.381.31 ± 0.493.120.045Peak 3 a6.28 ± 1.636.47 ± 1.385.76 ± 1.2810.48 < 0.001Peak 4 a5.76 ± 0.935.61 ± 0.815.75 ± 0.821.120.327Peak 5 a40.02 ± 3.7539.60 ± 3.7642.16 ± 4.3314.94 < 0.001Peak 6 a21.40 ± 2.6120.51 ± 2.8516.99 ± 2.9888.36 < 0.001Peak 7 a5.87 ± 1.416.02 ± 1.715.21 ± 1.2111.15 < 0.001Peak 8 a7.94 ± 1.587.59 ± 2.247.46 ± 1.822.240.108Peak 9a2.33±0.922.59±1.554.00±1.7748.12<0.001sumfucab47.37±4.4047.47±5.3043.21±5.9427.01<0.001Table 3. profilage N-glycanes par /électrophorèse capillaire ADN assisté séquenceur assistée fluorophore
Abréviations:. GC, cancer de l'estomac; SD, écart-type. une analyse de variance b Sumfuc représente l'abondance totale des structures α-1,6-fucosylées (la somme des pics 1, 2, 3, 4, 6, et 7). CSV Télécharger CSV
Etat actuel, Nombre de sujets
GC + de test
GC-
Sensibilité,%
Spécificité,%
PPV,%
VAN,% s Précision,%
CEA (5 ng /mL) GC + 54545.7695.3791.5361.6869.47 GC-64103CA19-9 (37 U /ml) GC + 451038.1490.7481.8257.3163.27GC-7398CA125 (40 U /ml) GC + 22718.6493.5275.8651.2754.42GC-96101CA72-4 (9,8 U /mL) GC + 16813.5692.5966.6749 .5151.33GC-102100GCglycoA (-0.77) GC + 891675.4285.1984.7676.0380.09GC-2992Table 4. la puissance de diagnostic pour Différencier gastrique Carcinome des contrôles au sein du groupe de formation
abréviations: + positif;. - négatif; GC, un carcinome gastrique; GCglycoA, N-glycane basée sur les marqueurs du cancer gastrique modèle de diagnostic A; VAN, valeur prédictive négative; PPV, valeur prédictive positive. CSV Télécharger CSV valeur Cutoff
Etat actuel, Nombre de sujets
test
GC +
GC-
Sensibilité,%
Spécificité,%
PPV,%
VAN,% s Précision,%
CEA (5 ng /mL) GC + 8040.00100.00100.0062.5070.00GC-1220CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8140.0095.0088.8961.2967.50GC-1219CA125 (40 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA72-4 (9,8 U /mL) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420GCglycoA (-0.77) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 5. la puissance de diagnostic pour Différencier gastrique Carcinome des contrôles au sein du groupe de vérification rétrospective
les abréviations:. + positif; - négatif; GC, un carcinome gastrique; GCglycoA, N-glycane basée sur les marqueurs du cancer gastrique modèle de diagnostic A; VAN, valeur prédictive négative; PPV, valeur prédictive positive. CSV Télécharger CSV
Cutoff
Etat actuel, Nombre de sujets
test
GC +
GC-
Sensibilité,%
Spécificité,%
PPV,%
VAN,% s Précision,%
CEA (5 ng /mL) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.50GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /mL) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoA -0.77GC + 19.295,0090 .0090.4894.7492.50GC-118Table 6. la puissance de diagnostic pour Différencier gastrique Carcinome des contrôles au sein du groupe de vérification prospective
abréviations:. + positif; - négatif; GC, un carcinome gastrique; GCglycoA, N-glycane basée sur les marqueurs du cancer gastrique modèle de diagnostic A; VAN, valeur prédictive négative; PPV, valeur prédictive positive. CSV Télécharger CSV
Etat actuel, Nombre de sujets
test
GC +
GC-
Sensibilité,%
Spécificité,%
PPV,%
VAN,% s Précision,%
CEA (5 ng /mL) GC + 541945.7678.6573.9752.2459.90GC-6470CA19-9 (37 U /ml) GC + 451738.1480.9072.5849.6656.52GC-7372CA125 (40 U /ml) GC + 22818.6491.0173.3345.7649.76GC-9681CA72-4 (9,8 U /ml ) GC + 16813.5691.0166.6744.2646.86GC-10281GCglycoB (0,594) GC + 88873.7391.0191.5872.3281.16GC-3081Table 7. la puissance de diagnostic pour Différencier gastrique Carcinome de atrophique Gastrite dans le groupe de formation
abréviations:. + positif; - négatif; GC, un carcinome gastrique; GCglycoB, N-glycane basée sur les marqueurs du cancer gastrique modèle de diagnostic B; VAN, valeur prédictive négative; PPV, valeur prédictive positive. CSV Télécharger CSV valeur Cutoff
Etat actuel, Nombre de sujets
test
GC +
GC-
Sensibilité,%
Spécificité,%
PPV,%
VAN,% s Précision,%
CEA (5 ng /mL) GC + 9445.0080.0069.2359.2662.50GC-1116CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8340.0085.0072.7358.6262.50GC-1217CA125 (40 U /ml) GC + 4220.0090.0066.6752.9455.00GC-1618CA72-4 (9,8 U /mL) GC + 6430.0080.0060.0053.3355.00GC-1416GCglycoB (0,594) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 8. la puissance de diagnostic pour Différencier gastrique Carcinome de atrophique Gastrite dans le groupe de vérification rétrospective
abréviations:. + positif; - négatif; GC, un carcinome gastrique; GCglycoB, N-glycane basée sur les marqueurs du cancer gastrique modèle de diagnostic B; VAN, valeur prédictive négative; PPV, valeur prédictive positive. CSV Télécharger CSV
Cutoff
Etat actuel, Nombre de sujets
test
GC +
GC-
Sensibilité,%
Spécificité,%
PPV,%
VAN,% s Précision,%
CEA (5 ng /mL) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /mL) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoB (0,594) GC + 17185.0095.0094.4486.3690.00GC-319Table 9. la puissance de diagnostic pour Différencier gastrique Carcinome de atrophique Gastrite dans le groupe de vérification prospective
abréviations:. + positif; - négatif; GC, un carcinome gastrique; GCglycoB, N-glycane basée sur les marqueurs du cancer gastrique modèle de diagnostic B; VAN, valeur prédictive négative; PPV, valeur prédictive positive. CSV Télécharger CSV
Moyenne ± écart-type ou médian (intervalle interquartile)
T
-Test
variable Avant la chirurgie
Après la chirurgie a
T ou Z
P pic 1
b8.92 ± 3.748.49 ± 3.342.0380.048Peak 2 b1.24 ± 0.591.52 ± 1.74-1.0510.300Peak 3 b5.96 ± 1.526.14 ± 1.33-0.6310.531Peak 4 b5.73 ± 0.695.21 ± 1.012.6020.013Peak 5 b40.81 ± 4.8742.27 ± 5.27-1.5130.138Peak 6 b16.74 ± 2.9817.30 ± 2.61-0.8090.423Peak 7 b5.28 ± 1.505.50 ± 1.14-0.7160.478Peak 8 B7.60 ± 2.077.82 ± 1.85-0.5860.562Peak 9b4.11±1.853.29±1.692.0470.047sumfucc43.88±7.7744.16±6.10-0.2170.830GCglycoAd1.07 (0,49, 3,12) 0,28 (-0,90, 1,14) -2.7820.005GCglycoB d1.31 (0,56, 2,41) 0,41 (-0,54, 1,19) -2.3790.017Table 10. Profilage N-Glycan chez les patients atteints cancer gastrique avant et après chirurgie curative
abréviations:. GCglycoA et GCglycoB, N-glycane basée sur les marqueurs de cancer gastrique modèles de diagnostic A et B, respectivement; SD, écart-type. a Dix semaines après la chirurgie. b-échantillon Jumelé T
test c Sumfuc indique l'abondance totale des structures ofα-1,6-fucosylé. d Wilcoxon test signé rang. CSV Télécharger CSV
Corrélation
CEA
CA19-9
CA125
CA72-4
TNM Stade
GCglycoA
GCglycoB
pic 1r
0.210a0.127a0.006a-0.023a0.088a0.250b0.055bP
0.0160.1480.9440.7930.3160.0040.532Peak 2r
0.009a0.038a0.011a-0.067a0.010a0.224b-0.099bP
0.9170.6670.9040.4450.9060.0100.258Peak 3r
0.083a0.094a0.066a0.039a-0.115a-0.216b-0.346bP
0.3480.2860.4550.6540.1930.013<0.001Peak 4r
-0.045a0.160a0.047a-0.006a-0.091a0.122b0.074bP
0.6130.0680.5940.9430.3010.1670.403Peak 5r
-0.029a-0.156a-0.020a0.097a0.108a0.299b0.478bP
0.7430.0760.8160.2700.2180.001<0.001Peak 6r
0.009a0.020a0.044a-0.114a-0.348a-0.757b-0.787bP
0.9210.8170.6180.197<0.001<0.001<0.001Peak 7r
-0.039a0.089a-0.075a-0.161a-0.245a-0.368b-0.517bP
0.6580.3110.3940.0660.005<0.001<0.001Peak 8r
-0.135a-0.058a0.002a-0.087a-0.035a-0.215b0.011bP
0.1240.5130.9840.3210.6920.0140.897Peak 9r
0.028a-0.072a-0.034a0.095a0.315a0.794b0.591bP
0.7510.4130.7030.280<0.001<0.001<0.001GCglycoAr
-0.033b-0.042b-0.012b0.046b0.355b10.869bP
0.7100.6370.8960.605<0.001<0.001GCglycoBr
-0.052b-0.045b0.027b0.105b0.345b0.869b1P
0.5580.6110.7600.232<0.001<0.001Sumfuccr
0.061a0.151a0.040a-0.108a-0.170