tiivistelmä
Tausta ja Tavoitteet
Tunnistaa ja vahvistaa N-glykaanin biomarkkerit mahasyövän (GC ) ja selvittää niiden taustalla molekyylitason vaikutusmekanismi.
Methods
yhteensä 347 ihmisellä, joista potilaat GC (mahalaukun syöpä) tai atrofinen gastriitti ja terveillä verrokeilla, jaettiin satunnaisesti jaettu koulutus ryhmä (n = 287) ja retrospektiivinen validointi ryhmä (n = 60). Seerumin N-glykaanin profiloinnin saavutettiin DNA sekvensseri-syöttäjänä /fluoroforileimattuja avustaa hiilihydraatti elektroforeesi (DSA-FACE). Kaksi diagnostisia mallia rakennettiin perustuu N-glykaanin profiileihin logistista portaittain regressio. Diagnostinen suorituskyky kunkin mallin arvioitiin retrospektiivinen, mahdollisille (n = 60), ja seuranta (n = 40) ikäryhmät. Lektiini-blottaus suoritettiin sen määrittämiseksi, yhteensä ydin-fukosyloitu-, ja liittyvien geenien ekspressiota ydin-fukosyloitu- GC analysoitiin käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiolla.
tunnistettu ainakin 9 N-glykaanirakenteet (piikit) ja tasot ydinfukoosin jäämien ja fukosyylitransferaasi- merkittävästi vähentynyt GC. Kaksi diagnostinen mallia, nimetyt GCglycoA ja GCglycoB, rakennettiin erottaa GC kontrollista ja atrofinen gastriitti. Kuuluvilla alueilla vastaanotin toimii (ROC) käyrät (AUC) sekä GCglycoA ja GCglycoB olivat korkeammat kuin CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4. Verrattuna CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4, herkkyys GCglycoA kasvoi 29,66%, 37,28%, 56,78% ja 61,86%: lla, ja tarkkuus kasvoi 10,62%, 16,82%, 25,67% ja 28,76%: lla . Sillä GCglycoB, herkkyys kasvoi 27,97%, 35,59%, 55,09% ja 60,17% ja tarkkuus kasvoi 21,26%, 24,64%, 31,40% ja 34,30% verrattuna CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4, vastaavasti. Sen jälkeen parantava leikkaus, ydin fukosyloitu huippu (huippu 3) ja koko ydinfukosyloitujen N-glykaanien (sumfuc) on päinvastainen.
Tulokset osoittivat, että diagnostiset perustuvat mallit N- glykaanirakenteessa markkereita ovat arvokkaita ja noninvasive vaihtoehtoja tunnistaa GC. Olemme päätellä, että vähentynyt core-fukosyloitu- sekä kudosten ja seerumin GC potilaat saattavat johtua vähentynyt ilmentyminen fukosyylitransferaasin.
Citation: Liu L, Yan B, Huang J, Gu Q, Wang L, Fang M, et ai. (2013) tunnistaminen ja karakterisointi Novel N-glykaanin-pohjainen biomarkkerit mahasyövän. PLoS ONE 8 (10): e77821. doi: 10,1371 /journal.pone.0077821
Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat
vastaanotettu: toukokuu 14, 2013; Hyväksytty: 04 syyskuu 2013; Julkaistu 17. lokakuuta 2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (Avustukset 81102693 ja 81102565). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat, joiden esiintyvyys on noin 930000; vuosittain, se on vastuussa yli 700000 kuolemantapausta maailmanlaajuisesti, ja viiden vuoden eloonjäämisaste on 20-30% [1]. Potilaille, joilla on GC, selviytymisen sanelee patologisen vaiheessa taudin diagnoosia tehtäessä. Valitettavasti yleisimpiä oireita GC eivät koske erityisesti taudin, ja alkuvaiheessa GC saa aiheuttaa havaittavia oireita. Huolimatta lisätä tietoa molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät pahanlaatuisiksi ja etäpesäkkeiden, yleinen eloonjäämisaste potilaiden GC ei ole merkittävästi parantunut. Useita molekyylejä on suositeltu GC biomarkkereita, kuten syöpä -antigeeni (CEA) leikkauksen jälkeisen seurannan, hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9), hiilihydraattiantigeeniä 125 (CA125) ja hiilihydraattiantigeeniä 72-4 (CA72-4) [2- 6]. Kuitenkaan mikään näistä kasvainmerkkiaineet on osoittanut riittävästi herkkyys tai spesifisyys diagnosoimiseksi GC varhaisessa vaiheessa. Vaihtoehtoisesti gastroskopia kasvattaa Lopullisen diagnoosin, mutta diagnostinen arvo gastroskopialla rajoittavat kustannukset, riskit ja vaivaa. Siksi on kiireellinen tarve kehittää invasiivisen biomarkkereita, jotka mahdollistavat varhaisen havaitsemisen GC.
Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että muutos N-sitoutuneiden glykaanin voitaisiin pitää mahdollisena biomarkkereita syövän diagnosoimiseksi. Aiemmat tutkimukset havaittu merkittäviä muutoksia N-sidottu glykaanin eri syöpien ja syöpäsolulinjoissa, joka sisältää haimasyöpä, rintasyöpä, eturauhassyöpä, munasarjasyöpä ja maksasyöpä [7-11]. Muita analyysi GC paljasti myös, että vapaa kompleksi-N-glykaaneja kertynyt MKN7 ja MKN45 solulinjat [12]. Kuitenkin vaihtelu ja vaihtelu N-sidottu glykaanin GC potilaat ovat yhä suurelta osin tuntemattomia.
Aiemmissa tutkimuksissa käyttämällä DNA sekvensseri-avusteinen /fluoroforileimattuja avustaa kapillaarielektroforeesissa (DSA-FACE), osoitimme, että haarautuvia α-1,3-fukosyloituja triantennaariset glykaani ja kaksiantennisella glykaanitähteen olivat erittäin spesifisiä ja herkkiä ehdokas HCC biomarkkerit [13]. Nykyisessä tutkimuksessa käytimme DSA-FACE takautuvasti profiili seerumin N-glykaanien näytteissä potilailta GC tai atrofinen gastriitti ja terveistä yksilöistä. Olemme tunnettu tunnistettu GC N-glykaanin markkereita vastaanotin toimii (ROC) käyriä ja validoitu markkereita prospektiivisissa ja seurantaan ikäryhmät. Tavoitteena oli löytää lupaava biomarkkereiden ennustamiseksi ja havaitsemiseksi GC parantunut spesifisyys ja herkkyys.
1,1: Retrospective kohortti
tutkimusprotokolla hyväksyi kiinalainen eettinen komitea henkilöstöjohtaja toisessa Military Medical University. Kirjallinen suostumus saatiin potilaiden ja terveillä verrokeilla.
Kaikkiaan 247 potilasta GC (n = 138) tai atrofinen gastriitti (n = 109) rekrytoitiin vuosina 2010 ja 2012. diagnoosit kaikille osallistuneista potilaista oli histopatologisesti vahvistettiin 2 patologit klo Changhai sairaala, toinen Military Medical University (Shanghai, Kiina). Kontrolliryhmässä, 128 ikään ja sukupuoleen sovitettu terveillä vapaaehtoisilla (tautivapaa) otettiin samana ajanjaksona. Keskimääräinen ikä ja sukupuoli jakelu sovitettiin vuonna 3 ryhmään. Yhteenveto potilastietoja annetaan taulukossa 1. GC saaneilla potilailla ennen leikkausta sädehoitoa, kemoterapiaa tai sädehoitoa jätettiin pois tutkimuksesta.
Keskiarvo ± SD tai Ei (%) B Tyypillinen
Ohjaus (n = 128) B atrofinen gastriitti (n = 109) B GC (n = 138) B ikä, y50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.01Men75 (58,59) 60 ( 55.05) 70 (50,72) CEA-positiiviset 5 (3,91) 23 (21,10) 62 (44.93) CA19-9-positiivisia 11 (8,59) 20 (18,35) 53 (38.41) CA125-positiivisia 7 (5,47) 10 (9.17) 28 (20.29) CA72-4-positiivisia 8 (6,25) 12 (11,01) 22 (15,94) TNM stageI22 (15,94) II28 (20,29) III63 (45.65) IV25 (18,12) Taulukko 1. Ominaisuudet koulutuksen ryhmä.
lyhenteet GC, mahasyöpä; SD, keskihajonta. CSV Lataa CSV
Yhteensä 60 potilasta (20 kussakin ryhmässä) valittiin satunnaisesti 3 ryhmään kuvattu yllä jälkitarkastuksesta; muut potilaat (n = 315) on sisällytetty koulutukseen asetettu rakentaa diagnostisen mallin. Aikana 2 vuoden tutkimuksessa, 40 138 potilasta, joilla GC koulutukseen ryhmässä seurattiin ennen ja jälkeen parantava leikkaus, saatavuuden mukaan. Koulutuksen ryhmässä 118 potilasta GC, 89 potilaalla on atrofinen gastriitti, ja 108 tervettä verrokkia.
Laboratorio ja kliiniset tiedot kaikille osallistujille saatiin kliinisistä potilastiedot, patologiaraporteista, ja henkilökohtaisilla haastatteluilla. Kerätyt tiedot sisältyvät sukupuoli, ikä, ja mahasyövän ominaisuuksia (kuten kasvain sijainti, histologinen, syvyys hyökkäystä, ja imusolmuke etäpesäke). Seeruminäytteet saatiin ennen kirurgista resektion; nämä näytteet kerättiin kokoverestä käyttäen standardia protokollaa, sentrifugoitiin 10000 G: ssä 20 minuutin ajan ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Taudin etenemistä GC potilailla oli luokiteltu seitsemännen painoksen American sekakomitealle [14]: 20 potilasta (16,95%) oli vaiheen I tauti, 25 (21,17%) oli vaiheen II tauti, 54 (45.76%) oli vaiheen III tauti, ja 19 (16.10%) oli vaiheen IV tauti.
1,2: Prospective kohortti
arvioimiseksi ennustearvo mallien perustettu retrospektiivinen tutkimus edellä kuvatun takautuvasti selvitellään ylimääräisiä kohortti (n = 60) potilaista GC (n = 20) tai atrofinen gastriitti (n = 20) ja terveiden yksilöiden (n = 20) toukokuusta 2012 marraskuu 2012 at samassa sairaalassa. Menettelyt ja strategiat olivat samat kuin edellä on kuvattu.
Kudosnäytteet saatiin 20 138 GC potilaille; 2 viipaletta, kasvain ja viereisen kudoksen näyte, otettiin. Kudosnäytteet (noin 1 cm: 3) jäädytettiin välittömästi -80 ° C: ssa ja alistettiin käänteiskopioijaentsyymin-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) ja lektiini-blottauksella. Kaikki kudokset käytettiin mukaisesti Institutional Review Board sovellettavat toisen Military Medical University. Säännöllinen tuumorimarkkeri analyysit suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä ja reagenssit . CEA ja CA19-9 tasot määritettiin Abbott I2000, ja CA72-4 ja CA125 mitattiin käyttäen Roche Cobas E601. Raja-tasot valmistajan suosittelemia CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4 olivat 5,0 ug /L, 39 U /L, 40 U /ml ja 9,8 U /ml. Kokeet suoritettiin laitoksella laboratoriolääketieteen, Changhai sairaala, toinen Military Medical University, Shanghai. Seerumin proteiini N-glykaanin analyysit tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [13]. Lyhyesti, N-glykaanien in 2 ui seerumia vapautettiin proteiinien peptidi-N-glykosidaasi F (PNGaasi F) (New England Biolabs, Boston, MA), joissa on 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulphonic happo (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sialihappo poistettiin käyttäen Arthrobacter ureafaciens kudokset homogenoidaan laastin ja survin ja suspendoitiin lyysipuskuriin sisältää proteaasiestäjäseostabletit (Roche Diagnostics, Meylan, Ranska). Hajoamattomat fraktio poistettiin sentrifugoimalla (kahdesti 12000xg 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa). Pitoisuus liukoinen proteiini määritettiin käyttämällä BioRad (Biorad, Marnes-la-Coquette, Ranska), ja näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa. Yhteensä 25 ug seerumin proteiinin tai 50 ug proteiinia uutetaan jäädytetty kudos erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Geelit värjättiin CBB G250, tai proteiinit geelin siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Whatman /Schleicher &Schuell, Versailles, Ranska) havaitsemiseksi ydinfukosyloituja proteiineja. Membraanit blokattiin yön yli 4 ° C: ssa 5% naudan seerumin albumiinia Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS: 140 mM NaCl ja 10 mM Tris-HCl), ja sitten inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä, jossa 5 ug /ml biotinyloitua linssin culinaris agglutiniini A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) TBS: ssä, joka sisälsi 0,05% Tween-20 (TBST). Kun 4 pesua 10 minuutin TBST-liuoksella, membraaneja inkuboitiin IRDye 800CW streptavidiini (1: 10000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin 4 kertaa TBST: llä, ja kehitettiin käyttäen Odyssey infrapuna Imaging System (LI-COR Biosciences). Puhdistettu albumiinia (Sigma, St. Louis, MO) käytettiin negatiivisena kontrollina lektiinimääri- blot. RNA eristettiin jäädytetystä kudoksista käyttäen Qiagen RNeasy mini kit mukaan valmistajan ohjeiden (QIAGEN GmbH, Hilden, Saksa). Puhtaus ja pitoisuus RNA määritettiin käyttämällä spektrofotometriä (Eppendorf, Hampuri, Saksa). cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä käänteisen transkription reagenssia (Toyobo, Osaka, Japani). Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Express (Applied Biosystems), ja sekvenssit on esitetty taulukossa 2. cDNA monistettiin Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR-laitetta käytetään reaktion kokonaistilavuus 20 ui, joka sisälsi 10 ui 2X Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, sisältää Fast Start Taq DNA-polymeraasia reaktiopuskuria), The deoksinukleotiditrifosfaatti yhdistelmä (mukaan lukien deoksiuridiini trifosfaatti, SYBR Green I väriaine, ja MgCI 2), ja 2 ui alukkeet kunkin geenin (lopullisessa pitoisuudessa 0,5 μΜ kunkin) . Jokainen reaktio suoritettiin kolmena kappaleena. PCR pyöräily-olosuhteet olivat seuraavat: denaturointi 95 ° C: ssa 5 minuuttia, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 59 ° C: ssa tai 55 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 45 sekunnin ajan. suhteellinen ilmentyminen α-1,6-fukosyylitransferaasin (Fut8) ja guanosiinidifosfaatti (BKT) -fucose transporter (GDP-Fuc-Tr) kussakin näytteessä normalisoitiin ilmentymisen GAPDH taloudenhoito geeni vähentämällä kynnyksen (Ct) arvo GAPDH kyseisestä of Fut8 tai GDP-Tr (ACt). Kansi ero laskettiin vähentämällä ACt testinäytteen kuin vertailunäytteen saamiseksi ΔΔCt ja sen jälkeen 2 ^ -ΔΔCt. Kynnyssyklistä arvot yli 40 sykliä pidettiin alle havaittavan tason. Sulata käyrät saatiin kussakin reaktiossa sen varmistamiseksi, että yhden tuotteen monistettiin. Kaikki määrälliset muuttujat ilmaistaan keskiarvona ± keskihajonta, ellei toisin ole mainittu. Määrällinen muuttujat verrattiin käyttäen Studentin t-testiä, analyysit variaation tai nonparametric testejä. Pearsonin korrelaatiokertoimet ja niihin liittyvät todennäköisyydet (P) käytettiin arvioimaan korrelaatioita parametrit; Spearmanin korrelaatiokertoimet laskettiin järjestysluku kategorisen muuttujia. Novel glykaanirakenteessa biomarkkerit tunnistettiin ja karakterisoitiin perustuvat eteenpäin askelittain regressioanalyysimme. Diagnostinen suorituskyky yksittäisten biomarkkereiden ja diagnostisten malleja arvioitiin käyttäen ROC käyräanalyysi. Herkkyys, spesifisyys, positiivinen ennustearvo (PPV), negatiivinen ennustearvo (NPV), ja tarkkuus laskettiin optimaaliset raja-arvot valitaan ROC käyrät. Kaikki raportoidut P-arvot ovat 2-tailed, ja P-arvot < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 18.0 for Windows (SPSS Inc.). 2.1: Eri N-Glycan profiilit potilailla GC tai atrofinen gastriitti ja myös terveiden Käyttämällä DSA-FACE tekniikka, selvitimme N-glykaanin profiilit potilailla, joilla on GC (n = 118) tai atrofinen gastriitti (n = 89) ja terveillä henkilöillä (n = 108). Me määrällisesti ja tilastollisesti vertasi huiput 3 ryhmään. Vähintään 9 N-glykaanin rakenteet (piikit) tunnistettiin kaikissa näytteissä (kuvio 1). Callewaert et al ja Liu et al aiemmin julkaistu rakenteellinen analyysi näistä N-glykaanien [15,16]. Keskimääräinen suhteellinen runsaus näiden N-glykaanirakenteet on esitetty taulukossa 3. runsaus rakenteiden huiput 1, 2, 3, 5, 6, 7, ja 9 oli merkittävästi erilainen GC, atrofinen gastriitti, ja terveisiin ryhmiä, mikä osoittaa, että eri N-glykaanin kuviot olemassa erilaisissa patofysiologisissa tiloissa. Verrattuna terveisiin ryhmä, piikit 1, 2, 5 ja 9 lisättiin (P < 0,05) ja huiput 3, 6, ja 7 määrä väheni GC ryhmässä (P < 0,001). Runsaasti rakenteet huiput 3, 5, 6, 7, ja 9 oli merkittävästi erilainen GC ryhmässä verrattuna atrofinen gastriitti ryhmään (kuva 2). 2.2: Rakentaminen ja arviointi diagnostisen mallin, joka perustuu N-Glycan markkereita erottamaan mahasyövän potilaita terveisiin kontrolleihin Arvioimme GC liittyvät N-glykaani muutokset perustuvat logistinen regressio analyysi. Logistinen regressio kertoimet käytettiin arvioimaan kertoimet suhde kunkin riippumattomia muuttujia. GCglycoA matemaattinen kaava rakennettiin erottamaan GC potilaiden terveillä verrokeilla (GCglycoA = -1,072 + 0,957 * peak4-0.331 * peak6 + 0,646 * peak9). Arvioida kykyä GCglycoA, CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4 syrjiä GC potilaille, me tunnettu alue alle ROC käyrät (AUC). Verrattuna CEA (AUC = 0,74), CA19-9 (AUC = 0,76), CA125 (AUC = 0,72) ja CA72-4 (AUC = 0,67), GCglycoA tehokkaammin erottaa GC potilaita terveillä (AUC = 0,88) että koulutus ryhmä (kuvio 3A). Taulukossa 4 herkkyys, spesifisyys, PPV, NPV, ja tarkkuus ennustamiseen GC CEA, CA19-9, CA125, CA72-4 ja GCglycoA. CEA suositellulla arvoon 5,0 ng /ml herkkyys oli 45,76%, 37 U /ml CA19-9 herkkyys oli 38,14%, 40 U /ml CA125 herkkyys oli 18.64% ja 9,8 U /ml CA72- 4 herkkyys oli 13,56%. Optimaalinen raja-arvo -0,772 valittiin GCglycoA perusteella ROC-käyrän analyysi. Tällä raja-arvon, GCglycoA herkkyys oli 75,42%, mikä on lisääntynyt herkkyys 29.66%, 37.28%, 56,78% ja 61,86% verrattuna CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4, vastaavasti. Diagnostinen tarkkuus GCglycoA erottamaan GC potilaiden terveiden verrokkien kasvoi 10,62%, 16,82%, 25,67% ja 28,76% verrattuna CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4, vastaavasti. Kun mallia sovellettiin takautuva validointi ryhmä, herkkyys kasvoi 45,00%, 45,00%, 55,00% ja 55,00% ja tarkkuus kasvoi 15,00%, 17,50%, 20,00% ja 20,00% verrattuna CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4, vastaavasti (taulukko 5). Ennakoiva arviointi osoitti, että herkkyys parani 65.00%, 65.00%, 85.00% ja 80.00% ja tarkkuus parani 30,00%, 27,50%, 37,50% ja 37,50% verrattuna CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4, vastaavasti (taulukko 6). 2.3: Rakentaminen ja arviointi diagnostisen mallin erottaa mahalaukun syövän atrofinen gastriitti Käyttämällä logistinen regressiomalli, toinen diagnostinen malli (GCglycoB) perustettiin erottamaan GC ja atrofinen gastriitti: GCglycoB = 5,273-1,371 * peak2 + 0,781 * peak4-0.453 * peak6 + 0,221 * peak9. Optimaalinen raja-arvo GCglycoB (0,594) valittiin perustuen ROC käyräanalyysi. Koulutuksessa ryhmässä, AUC GCglycoB oli 0,82, kun taas AUC CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4 olivat 0,65, 0,63, 0,69 ja 0,64, vastaavasti (kuvio 3B). Diagnostinen tarkkuus GCglycoB erottamaan GC atrofista gastriittia kasvoi 21,26%, 24,64%, 31,40% ja 34,30% ja herkkyys lisääntyi 27,97%, 35,59%, 55,09% ja 60,17% verrattuna CEA, CA19-9, CA125 ja CA72- 4, vastaavasti (taulukko 7). Validoinnissa ryhmässä 85.00% tarkkuus GCglycoB eli lisäystä 40,00%, 45,00%, 65,00% ja 55,00% ja 85,00% herkkyys osoitti kasvua 22.50%, 22.50%, 30.00% ja 30,00% verrattuna CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4, vastaavasti (taulukko 8). mahdollinen ryhmä, GCglycoB oli tarkempi (85,00% vs. 30,00%, 30,00%, 10,00% ja 15,00%) ja herkkä (90,00% vs. 62,50%, 62.50%, 55.00% ja 55.00% ) kuin CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4, vastaavasti (taulukko 9). 2.4: Vähentynyt veren kokonaiskolesterolia ydinfukosyloituja proteiinien mahasyövässä kokonaistaso core α-1,6-fukoositähteitä (summa huiput 1, 2, 3, 4 , 6, ja 7) oli merkitsevästi pienempi (P < 0,001; taulukko 2) GC potilailla kuin atrofinen gastriitti potilaiden ja normaalit kontrollit. Vahvistaa tämän havainnon, arvioimme pitoisuus ydinfukosyloitujen proteiinien seerumissa ja kudoksissa potilailla, joilla on GC LCA, koska se tunnistaa spesifisesti glykoproteiinien α-1,6-fukosyloituja-N-asetyyli-D-glukosamiini-asparagiini (GlcNAc- Asp) on trimannosyl ydin. Seerumin, oli vähemmän LCA-sitova ydinfukoosin jäämiä GC-ryhmässä kuin atrofinen gastriitti ja normaaliryhmää (kuvio 4A). Yhteenlaskettu ydinfukoosin runsaus oli alhaisempi GC kasvaimia kuin pariksi viereiseen kudokseen (kuva 4B). Sen ratkaisemiseksi, onko muutos koko ydin fukosyloitu- GC kasvaimissa liittyi muuttuneisiin glykosylaation biosynteesin, runsaasti nisäkkäiden α-1,6-fukosyylitransferaasin (Fut8) ja guanosiinidifosfaatti kuljettaja (GDP-Tr) GC kasvaimia ja viereiseen kudokseen analysoitiin RT-PCR: llä. Tulokset paljastivat, että Fut8 mRNA ilmentyminen oli matalampi kasvaimissa kuin viereiseen kudokseen (kuvio 4C). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa guanosiinidifosfaatti (BKT) -fucose transporter (GDP-Fuc-Tr) geenin ilmentymisen välillä kasvainten ja viereisten kudosten (kuvio 4D). runsaasti rakenteet huiput 1, 4, ja 9 oli merkittävästi erilainen leikkauksen jälkeen verrattuna ennen leikkausta (taulukko 10). Tulokset osoittivat, että korotukset ydinfukosyloitujen huippu (huippu 3) ja yhteensä ydinfukosyloitujen N-glykaanien (sumfuc) on päinvastainen leikkauksen jälkeen. Kymmenen viikkoa leikkauksen jälkeen GCglycoA arvo muuttui negatiiviseksi 11 potilasta 40 GC, samoin kuin GCglycoB arvo 22 40 potilasta GC. 2,6: väliset korrelaatiot diagnostisten mallien ja kliinisten parametrien Tällä hetkellä, kasvain biomarkkerit CEA, CA19-9, CA125 ja CA72-4 käytetään laajalti seulontaa ja seurantaa GC. Niinpä määritettiin väliset korrelaatiot yksittäisten N-glykaanin markkereita (mukaan lukien diagnostiset malleissa), kasvain biomarkkereita ja TNM-luokitus. Tulokset osoittivat, että vain TNM positiivisesti liittyy GCglycoA (r = 0,355, P < 0,001) ja GCglycoB (r = 0,345, P < 0,001) (taulukko 11). Runsaasti rakenteiden huiput 6 ja 9 oli merkitsevästi erilainen TNM vaiheiden (taulukko 12).
1.4: Säännöllinen havaitseminen kasvainmerkkiaineet
1,5: Seerumin proteiini N-Glycan profilointi
sialidaasia (Roche Bioscience, Palo Alto, CA), ja käsitellyistä näytteistä analysoitiin DSA-kasvot teknologiaa kapillaarielektroforeesimenetelmä-pohjainen ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City , CA). 9 korkeimmat huiput, jotka havaittiin kaikissa näytteissä (osuus > 90%: n seerumin kokonais-N-glykaanien) analysoitiin käyttämällä GeneMapper (Applied Biosystems). Jokainen N-glykaanirakenteeseen kuvattiin numeerisesti normalisoimalla sen korkeus summaan korkeudet kaikki huiput, ja analysoimme näitä tietoja käyttämällä SPSS 18.0 tilasto-ohjelmalla (SPSS Inc., Chicago, IL).
1.6 : Tissue proteiiniuutto ja lektiini blotting
1.7: Total RNA uuttamalla kudoksesta ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR
Gene
Forward Primer (5'-3 ')
Reverse Primer (5'-3')
Fut85'CCTGGCGTTGGATTATGCTCA 3'5'CCCTGATCAATAGGGCCTTCT 3'GDP-Tr5'CTGCCTCAAGTACGTCGGTG 3'5'CCGATGATGATACCGCAGGTG 3'GAPDH5'ATGGGGAAGGTGAAGGTCG 3'5'GGGGTCATTGATGGCAACAATA 3'Table 2. Polymeraasiketjureaktio alukeparia sekvenssit.
lyhenteet A , adenosiini; C, sytidiini; G, guanosiini; T, tymidiini; Fut8, fukosyylitransferaasi; GDP-Tr, guanosiinidifosfaatti-fukoosin transporter CSV Lataa CSV
1,8: Tilastollinen analyysi
Tulokset
Keinot ± SD
Variable
ohjaus (n = 128) B atrofinen gastriitti (n = 108) B GC (n = 138) B F
P
ikä, y a50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.010.270.766Peak 1 a6.96 ± 1.677.64 ± 2.028.20 ± 2.7510.09 < 0.001Peak 2 a1.09 ± 0.341.20 ± 0.381.31 ± 0.493.120.045Peak 3 a6.28 ± 1.636.47 ± 1.385.76 ± 1.2810.48 < 0.001Peak 4 a5.76 ± 0.935.61 ± 0.815.75 ± 0.821.120.327Peak 5 a40.02 ± 3.7539.60 ± 3.7642.16 ± 4.3314.94 < 0.001Peak 6 a21.40 ± 2.6120.51 ± 2.8516.99 ± 2.9888.36 < 0.001Peak 7 a5.87 ± 1.416.02 ± 1.715.21 ± 1.2111.15 < 0.001Peak 8 a7.94 ± 1.587.59 ± 2.247.46 ± 1.822.240.108Peak 9a2.33±0.922.59±1.554.00±1.7748.12<0.001sumfucab47.37±4.4047.47±5.3043.21±5.9427.01<0.001Table 3. N-Glycan profilointi DNA-sekvensseri-avusteinen /fluorofori-avusteisen kapillaarielektroforeesi.
Lyhenteet: GC, mahasyöpä; SD, keskihajonta. analyyseihin varianssi b Sumfuc edustaa koko runsaasti α-1,6-fukosyloituja rakenteiden (summa huiput 1, 2, 3, 4, 6, ja 7). CSV Lataa CSV
Sulku arvo
hetkellinen tila, No. aiheista
Test
GC +
GC-
Herkkyys,%
spesifisyys,%
PPV,%
NPV,%
Tarkkuus,%
CEA (5 ng /ml) GC + 54545.7695.3791.5361.6869.47 GC-64103CA19-9 (37 U /ml), GC + 451038.1490.7481.8257.3163.27GC-7398CA125 (40 U /ml), GC + 22718.6493.5275.8651.2754.42GC-96101CA72-4 (9,8 U /ml), GC + 16813.5692.5966.6749 .5151.33GC-102100GCglycoA (-0,77) GC + 891675.4285.1984.7676.0380.09GC-2992Table 4. Diagnostic Virta Differentioimalla mahakarsinoo- päässä Controls Training Group.
lyhenteet: + positiivinen; - Negatiivinen; GC, mahasyöpä; GCglycoA, N-glykaanin markkeri-pohjainen mahasyövän diagnostisia malli A; NPV, negatiivinen ennustearvo; PPV, positiivinen ennustearvo. CSV Lataa CSV Sulku arvo
hetkellinen tila, No. aiheista
Test
GC +
GC-
Herkkyys,%
Spesifisyys,%
PPV,%
NPV,%
Tarkkuus,%
CEA (5 ng /ml) GC + 8040.00100.00100.0062.5070.00GC-1220CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8140.0095.0088.8961.2967.50GC-1219CA125 (40 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420GCglycoA (-0,77) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 5. Diagnostic Virta Differentioimalla mahakarsinoo- päässä Controls jälkitarkastuksesta ryhmä.
lyhenteet: + positiivinen; - Negatiivinen; GC, mahasyöpä; GCglycoA, N-glykaanin markkeri-pohjainen mahasyövän diagnostisia malli A; NPV, negatiivinen ennustearvo; PPV, positiivinen ennustearvo. CSV Lataa CSV
Sulku arvo
hetkellinen tila, No. aiheista
Test
GC +
GC-
Herkkyys,%
Spesifisyys,%
PPV,%
NPV,%
Tarkkuus,%
CEA (5 ng /ml) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.50GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA125 (40 U /ml), GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /ml), GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoA -0.77GC + 19295,0090 .0090.4894.7492.50GC-118Table 6. Diagnostic Virta Differentioimalla mahakarsinoo- päässä Controls Prospective Verification ryhmä.
lyhenteet: + positiivinen; - Negatiivinen; GC, mahasyöpä; GCglycoA, N-glykaanin markkeri-pohjainen mahasyövän diagnostisia malli A; NPV, negatiivinen ennustearvo; PPV, positiivinen ennustearvo. CSV Lataa CSV
Sulku arvo
hetkellinen tila, No. aiheista
Test
GC +
GC-
Herkkyys,%
spesifisyys,%
PPV,%
NPV,%
Tarkkuus,%
CEA (5 ng /ml) GC + 541945.7678.6573.9752.2459.90GC-6470CA19-9 (37 U /ml), GC + 451738.1480.9072.5849.6656.52GC-7372CA125 (40 U /ml), GC + 22818.6491.0173.3345.7649.76GC-9681CA72-4 (9,8 U /ml ) GC + 16813.5691.0166.6744.2646.86GC-10281GCglycoB (0,594) GC + 88873.7391.0191.5872.3281.16GC-3081Table 7. Diagnostic Virta Differentioimalla mahakarsinoo- alkaen atrofinen gastriitti Training Group.
lyhenteet: + positiivinen; - Negatiivinen; GC, mahasyöpä; GCglycoB, N-glykaanin markkeri-pohjainen mahasyövän diagnostisia malli B; NPV, negatiivinen ennustearvo; PPV, positiivinen ennustearvo. CSV Lataa CSV Sulku arvo
hetkellinen tila, No. aiheista
Test
GC +
GC-
Herkkyys,%
Spesifisyys,%
PPV,%
NPV,%
Tarkkuus,%
CEA (5 ng /ml) GC + 9445.0080.0069.2359.2662.50GC-1116CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8340.0085.0072.7358.6262.50GC-1217CA125 (40 U /ml) GC + 4220.0090.0066.6752.9455.00GC-1618CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 6430.0080.0060.0053.3355.00GC-1416GCglycoB (0,594) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 8. Diagnostic Virta Differentioimalla mahakarsinoo- alkaen atrofinen gastriitti jälkitarkastuksesta ryhmä.
lyhenteet: + positiivinen; - Negatiivinen; GC, mahasyöpä; GCglycoB, N-glykaanin markkeri-pohjainen mahasyövän diagnostisia malli B; NPV, negatiivinen ennustearvo; PPV, positiivinen ennustearvo. CSV Lataa CSV
Sulku arvo
hetkellinen tila, No. aiheista
Test
GC +
GC-
Herkkyys,%
Spesifisyys,%
PPV,%
NPV,%
Tarkkuus,%
CEA (5 ng /ml) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoB (0,594) GC + 17185.0095.0094.4486.3690.00GC-319Table 9. Diagnostic Virta Differentioimalla mahakarsinoo- alkaen atrofinen gastriitti Prospective Verification ryhmä.
lyhenteet: + positiivinen; - Negatiivinen; GC, mahasyöpä; GCglycoB, N-glykaanin markkeri-pohjainen mahasyövän diagnostisia malli B; NPV, negatiivinen ennustearvo; PPV, positiivinen ennustearvo. CSV Lataa CSV
2.5: Muutoksia N-Glycan markkereita ennen ja sen jälkeen parantava leikkauksen
Keskiarvo ± SD tai mediaani (kvartiiliväli)
T
-testi
Variable
Ennen Surgery
leikkauksen jälkeen
T tai Z
P
Peak 1 b8.92 ± 3.748.49 ± 3.342.0380.048Peak 2 b1.24 ± 0.591.52 ± 1.74-1.0510.300Peak 3 b5.96 ± 1.526.14 ± 1.33-0.6310.531Peak 4 b5.73 ± 0.695.21 ± 1.012.6020.013Peak 5 b40.81 ± 4.8742.27 ± 5.27-1.5130.138Peak 6 b16.74 ± 2.9817.30 ± 2.61-0.8090.423Peak 7 b5.28 ± 1.505.50 ± 1.14-0.7160.478Peak 8 b7.60 ± 2.077.82 ± 1.85-0.5860.562Peak 9b4.11±1.853.29±1.692.0470.047sumfucc43.88±7.7744.16±6.10-0.2170.830GCglycoAd1.07 (0,49, 3,12) 0,28 (-0,90, 1,14) -2.7820.005GCglycoB d1.31 (0,56, 2,41) 0,41 (-0,54, 1,19) -2.3790.017Table 10. N-Glycan Profilointi potilailla, joilla mahasyövän Ennen ja jälkeen Parantava Surgery.
lyhenteet: GCglycoA ja GCglycoB, N-glykaanin markkeri-pohjainen mahasyövän diagnostisia mallit A ja B, vastaavasti; SD, keskihajonta. Ten viikkoa leikkauksen jälkeen. b Parilliset-näyte T
testi c Sumfuc ilmaisee koko runsaus ofα-1,6-fukosyloituja rakenteita. d Wilcoxonin-rank-testi. CSV Lataa CSV
Korrelaatio
CEA
CA19-9
CA125
CA72-4
TNM Stage
GCglycoA
GCglycoB
Peak 1r
0.210a0.127a0.006a-0.023a0.088a0.250b0.055bP
0.0160.1480.9440.7930.3160.0040.532Peak 2r
0.009a0.038a0.011a-0.067a0.010a0.224b-0.099bP
0.9170.6670.9040.4450.9060.0100.258Peak 3r
0.083a0.094a0.066a0.039a-0.115a-0.216b-0.346bP
0.3480.2860.4550.6540.1930.013<0.001Peak 4r
-0.045a0.160a0.047a-0.006a-0.091a0.122b0.074bP
0.6130.0680.5940.9430.3010.1670.403Peak 5r
-0.029a-0.156a-0.020a0.097a0.108a0.299b0.478bP
0.7430.0760.8160.2700.2180.001<0.001Peak 6r
0.009a0.020a0.044a-0.114a-0.348a-0.757b-0.787bP
0.9210.8170.6180.197<0.001<0.001<0.001Peak 7r
-0.039a0.089a-0.075a-0.161a-0.245a-0.368b-0.517bP
0.6580.3110.3940.0660.005<0.001<0.001Peak 8r
-0.135a-0.058a0.002a-0.087a-0.035a-0.215b0.011bP
0.1240.5130.9840.3210.6920.0140.897Peak 9r
0.028a-0.072a-0.034a0.095a0.315a0.794b0.591bP
0.7510.4130.7030.280<0.001<0.001<0.001GCglycoAr
-0.033b-0.042b-0.012b0.046b0.355b10.869bP
0.7100.6370.8960.605<0.001<0.001GCglycoBr
-0.052b-0.045b0.027b0.105b0.345b0.869b1P
0.5580.6110.7600.232<0.001<0.001Sumfuccr
0.061a0.151a0.040a-0.108a-0.170