abstraktné
Pozadie a ciele
Ak chcete zistiť a overiť N-glykanových biomarkerov u rakoviny žalúdka (GC ) a objasniť ich základné molekulárnej mechanizmus účinku.
Metódy
V celkom 347 jedincov, vrátane pacientov s GC (rakovina žalúdka) alebo atrofickej gastritídy a zdravých kontrol, boli náhodne rozdelení do výcvik skupina (n = 287) a retrospektívna validácia skupina (n = 60). Sérum N-glykánov profilovanie bolo dosiahnuté s DNA sekvenceru asistovaných /fluorofor-assisted sacharidov elektroforézy (DSA-FACE). Dva diagnostické modely boli konštruované na základe N-glykanových profilov s použitím logistickej regresie postupné. Diagnostický výkon každého modelu bola stanovená u (n = 40) kohorty retrospektívnej, prospektívna (n = 60), a následných opatrení. Lektín blotting sa vykonáva na stanovenie celkového jadro-fukosylaci, a expresiu génov podieľajúcich sa na jadro-fukosylace v GC bola analyzovaná pomocou reverznej transkriptázy-PCR.
Zistili sme, že najmenej 9 N-glykanové štruktúry (píky) a úrovne jadrových fukosových zvyškov a fukosyltransferázy boli významne znížené v GC. Dva diagnostické modely, určený GCglycoA a GCglycoB, boli konštruované tak, aby odlíšiť od GC kontroly a atrofickú gastritídu. Plochy pod prijímačom prevádzkové charakteristiky (ROC) krivky (AUC) pre oba GCglycoA a GCglycoB boli vyššie ako tie, pre CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4. V porovnaní s CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4, citlivosť GCglycoA vzrástol 29,66%, 37,28%, 56,78% a 61,86%, v uvedenom poradí, a presnosť zvýšila 10,62%, 16,82%, 25,67% a 28,76%, v uvedenom poradí , Pre GCglycoB, citlivosť zvýšená 27,97%, 35,59%, 55,09% a 60,17% a presnosť vzrástol 21,26%, 24,64%, 31,40% a 34,30% v porovnaní s CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4, resp. Po kuratívny operácii, jadro fukosylované vrchol (peak 3) a celková jadro fukosylované N-glykány (sumfuc) bol obrátený.
Výsledky ukázali, že diagnostické modely založené na N- glykanových markery sú cenné a neinvazívne alternatívy pre identifikáciu GC. Došli sme k záveru, že sa znížil jadro-fukosylaci ako v tkanivách a v sére pacientov GC môže mať za následok zníženú expresiou fukosyltransferázy
Citácia :. Liu L, Yan B, Huang J, Q Gu, Wang L, M Fang, et al. (2013) Identifikácia a charakterizácia biomarkerov Novel N-glykan so sídlom v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (10): e77821. doi: 10,1371 /journal.pone.0077821
Editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Spojené štáty |
prijatá: May 14, 2013; Prijaté: 04.09.2013; Uverejnené: 17.října 2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané
Financovanie :. Toto dielo bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny (granty 81102693 a 81102565). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu
Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú
Úvod
rakovina žalúdka (GC) je štvrté najčastejšou rakovinou a treťou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia, s výskytom približne 930000; ročne, je zodpovedný za viac ako 700.000 úmrtí na celom svete, a miera prežitia päť rokov je 20 až 30% [1]. U pacientov s GC, prežitie je daná tým, patologického stavu ochorenia v čase diagnózy. Bohužiaľ, bežné príznaky GC nie sú špecifické pre ochorenie a ranej fáze GC nemôže spôsobiť znateľné príznaky. Aj napriek rastúcej informovanosti o molekulárnych mechanizmov, ktoré regulujú malígny transformáciu a metastáz, celková miera prežitia pacientov s GC výrazne nezlepšila. Niekoľko molekúl boli odporučené ako GC biomarkerov, vrátane karcinoembryonálneho antigénu (CEA) pre pooperačné dohľadu, sacharidov antigénu 19-9 (CA19-9), sacharidy antigén 125 (CA125) a sacharidov antigénu 72-4 (CA72-4) [2- 6]. Avšak, žiadny z týchto nádorových markerov preukázal dostatočnú citlivosť alebo špecifickosť pre diagnostiku GC v ranej fáze. Prípadne gastroskopia zvyšuje rýchlosť konečných diagnóz, ale diagnostická hodnota gastroskopia je obmedzená náklady, riziká a nepríjemnosti. Preto existuje naliehavá potreba pre vývoj neinvazívnych biomarkerov, ktoré umožňujú včasnú detekciu GC.
čoraz viac dôkazov naznačuje zmenu N-viazaných glykánov by mohol byť považovaný za potenciálny biomarkerov pre diagnostiku rakoviny. Predchádzajúce štúdie zaznamenané významné zmeny N-viazaných glykánov v rôznych nádorov a nádorových bunkových línií, ktorá zahŕňa rakovinu pankreasu, rakoviny prsníka, rakoviny prostaty, rakoviny vaječníkov a rakoviny pečene [7-11]. Dodatočná analýza v GC tiež odhalilo, že bez komplexného typu N-glykány akumuluje v MKN7 a MKN45 bunkových línií [12]. Avšak, fluktuácia a variácie N-viazaných glykánov u pacientov GC sú stále do značnej miery neznámy.
V predchádzajúcich štúdiách s použitím sekvenátoru DNA-pomáhal /fluorofor asistovanej kapilárnej elektroforézy (DSA-FACE) sme ukázali, že vetvenia a-1,3-fukosylovaných triantenární glykan a a biantenární glykánov boli vysoko špecifické a citlivé kandidátske HCC biomarkery [13]. V súčasnej štúdii sme použili DSA-face spätne profil sérum N-glykány vo vzorkách od pacientov s GC alebo atrofickej gastritídy a od zdravých jedincov. vyznačujúci sa budeme zistených GC N-glykanových markery s prijímačom prevádzkové charakteristiky (ROC) krivky a overí značky v perspektívnych a nadväzujúcich kohorty. Naším cieľom bolo určiť sľubné biomarker na predpovedanie a detekciu GC s vylepšenou špecifickosti a citlivosti
Materiály a metódy
1,1 :. Retrospective kohorta
Protokol štúdie bol schválený Etická komisia čínsky ľudských zdrojov na druhej vojenskej lekárskej univerzity. Písomný informovaný súhlas bol získaný od pacientov a zdravých kontrol.
Celkom 247 pacientov s GC (n = 138) alebo atrofická gastritída (n = 109) boli prijatí v rokoch 2010 až 2012. diagnóz pre všetkých zúčastnených pacientov boli potvrdené histopatologicky 2 patológov v Changhai nemocnice, druhé vojenské lekárskej univerzity (Shanghai, Čína). V kontrolnej skupine, 128 rovnakého pohlavia a veku uzavreté zdravých dobrovoľníkov (bez príznakov ochorenia) bolo zaradených počas rovnakého časového obdobia. Priemerný vek a pohlavie boli vyrovnané rozdelenie do 3 skupín. Súhrn údajov o pacientovi sú uvedené v tabuľke 1. Pacienti, ktorí dostávali GC predoperačnej rádioterapii, chemoterapii alebo chemorádioterapiu boli vylúčení zo štúdie.
Priemer ± SD alebo Nie (%)
Charakteristika
Control (n = 128)
atrofická gastritída (n = 109)
GC (n = 138)
vek, y50.10 ± 5.9552.11 6.2951.01 ± ± 6.01Men75 (58.59) 60 ( 55,05), 70 (50,72) CEA-pozitívnych 5 (3,91) 23 (21,10), 62 (44,93) CA19-9-pozitívnych 11 (8,59) 20 (18,35), 53 (38,41) CA125-pozitívna 7 (5,47) 10 (9,17) 28 (20.29) CA72-4-pozitívna 8 (6,25) 12 (11,01), 22 (15,94) TNM stageI22 (15,94) II28 (20,29) III63 (45,65) IV25 (18,12) Tabuľka 1. Charakteristika tréningovej skupiny.
Skratky : GC, karcinóm žalúdka; SD, štandardná odchýlka. Automaticky CSV CSV
Celkom 60 pacientov (20 v každej skupine) bolo náhodne vybrané zo 3 skupín opísaných vyššie pre dodatočné kontroly; zostávajúcich pacientov (n = 315) boli zahrnuté do prípravy nastavená na konštrukciu diagnostického modelu. V priebehu 2 rokov od štúdie 40 zo 138 pacientov s GC v tréningovej skupine boli sledované pred a po operácii kuratívnu, na základe dostupnosti. Výcvik skupina zahŕňala 118 pacientov s GC, 89 pacientov s atrofickú gastritídu a 108 zdravých kontrol.
Laboratórne a klinické údaje pre všetkých účastníkov boli získané z klinických lekárskych záznamov, patológie správ a osobných pohovorov. Zhromaždené údaje zahrnuté pohlavie, vek, a funkcia rakovinou žalúdka (ako je umiestnenie nádoru, histologického stupňa, hĺbkou invázie, a lymfatických uzlín). Vzorky séra boli získané pred chirurgickými resekcia; Tieto vzorky boli odobraté z plnej krvi s použitím štandardného protokolu, centrifugovány pri 10,000xg po dobu 20 minút, a skladované pri -80 ° C. progresie ochorenia u pacientov GC bola klasifikovaná podľa siedmeho ročníka spoločného výboru amerického [14]: 20 pacientov (16,95%) malo štádium choroby I, 25 (21,17%) malo štádium II ochorení, 54 (45,76%) malo štádium III choroba, a 19 (16,10%) malo štádiu choroby IV
1,2 :. prospektívnej kohorty
Ak chcete zhodnotiť prediktívnu hodnotu vzory stanovenými v retrospektívnej štúdii je popísaný vyššie, sme perspektívne skúmaná ďalšie kohorta (n = 60) u pacientov s GC (n = 20), alebo na liečenie atrofickej gastritída (n = 20) a zdravých jedincov (n = 20) od mája 2012 do novembra 2012 v rovnakej nemocnici. Postupy a stratégie boli rovnaké ako tie popísané vyššie
1.3 :. Vzorky tkaniva
Vzorky tkaniva boli získané od 20 pacientov GC 138; 2 plátky, nádor a priľahlá vzorka tkaniva, boli nadobudnuté. Vzorky tkaniva (približne 1 cm 3) boli okamžite zmrazené na -80 ° C a podrobí sa reverznej transkriptázy-PCR (RT-PCR) a lektín blotting. Všetky tkanivá boli použité v súlade s nariadeniami rady Institutional Review of Second Military Medical University 1,4 :. Rutinné detekcie nádorových markerov Rutinné nádorových markerov Testy boli uskutočňované pomocou štandardných metód a činidiel , CEA a CA19-9 hladiny boli stanovené na Abbott I2000, a CA72-4 a CA 125 úrovne boli merané za použitia Roche COBAS E601. Hladiny cut-off odporúčané výrobcom pre CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4 boli 5,0 ng /L, 39 U /L, 40 U /ml a 9,8 U /ml, resp. Testy boli vykonávané v Oddelenie laboratórnej medicíny, Changhai nemocnice, druhý Vojenské lekárskej univerzity, Shanghai 1,5 :. Serum proteín N-glykan profilovanie Srvátka proteín analýza N-glykánov boli vykonané ako bolo opísané skôr [13]. Stručne, N-glykány vo 2 ul séra boli uvoľnené z proteínov s peptid-N-glykosidázou F (PNGáza F) (New England Biolabs, Boston, MA), ktoré majú 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfónová kyselina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kyselina sialovej bola odstránená pomocou Arthrobacter ureafaciens tkanivá boli homogenizované za použitia trecej misky a kladivka a resuspendované v lyzačním pufri obsahujúcom kokteilu inhibítora proteázy (Roche Diagnostics, Meylan, Francúzsko). Unlysed frakcie sa odstráni odstredením (dvakrát pri 12000 g počas 10 minút pri teplote 4 ° C). Koncentrácia rozpustného proteínu bola stanovená použitím testu BIORADE (BIORADE, Marnes-la-Coquette, Francúzsko), a vzorky boli skladované pri -80 ° C. celkom 25 ug proteínu v sére alebo 50 ug bielkoviny extrahované z mrazené tkaniva sa oddelí 10% dodecylsulfát sodným elektroforézy sulfátu-polyakrylamidovom gélu. Gély boli zafarbené CBB G250, alebo proteíny v géle boli prenesené na nitrocelulózové membránu (Whatman /Schleicher &Schuell, Versailles, Francúzsko) na detekciu typu jadro-fukosylována proteíny. Membrány boli blokované cez noc pri 4 ° C s 5% hovädzím sérovým albumínom v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (TBS: 140 mM NaCl a 10 mM Tris-HCl), a potom inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti s 5 ug /ml biotinylovaného šošovky culinaris aglutiníny A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) v TBS obsahujúcom 0,05% Tween-20 (TBST). Po 4 premytí, z ktorých každá sa TBST 10 minút, boli membrány inkubované s IRDye 800CW streptavidínu (1: 10000; LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, premyje 4 krát s TBST a vyvolané s použitím Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). Čistený albumín (Sigma, St. Louis, MO) bol použitý ako negatívna kontrola pre lektínovú blot 1.7 :. Celková Extrakcia RNA z tkaniva a kvantitatívnej real-time PCR RNA bola extrahovaná zo zmrazených tkanív s použitím súpravy Qiagen RNeasy mini podľa inštrukcií výrobcu (QIAGEN GmbH, Hilden, Nemecko). Čistota a koncentrácia RNA sa stanoví za použitia spektrofotometra (Eppendorf, Hamburg, Nemecko). cDNA bola syntetizovaná z 2 ug celkovej RNA za použitia reverznej transkripcie činidlo (Toyobo, Osaka, Japonsko). Primery boli navrhnuté za použitia Primer Express (Applied Biosystems), a sekvencie sú uvedené v tabuľke 2. cDNA boli amplifikované v Applied Biosystems 7300 real-time PCR zariadení v celkovom reakčnom objeme 20 ul, ktorá obsahovala 10 ul 2X Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, zahŕňa rýchly štart Taq DNA polymerázu reakčnej pufor) sa deoxynukleotidtrifosfátu mix (vrátane deoxyuridín trifosfátu, SYBR Green aj farbivá a MgCl2) a 2 ul primeru pre každý gén (v konečnej koncentrácii 0,5 μΜ každého) , Každá reakcia bola vykonávaná v triplikátech. Tieto Podmienky cyklovania PCR boli nasledujúce: denaturácia pri teplote 95 ° C počas 5 minút, potom nasleduje 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd, 59 ° C alebo 55 ° C počas 15 sekúnd, a 72 ° C počas 45 sekúnd relatívnej expresie a-1,6-fukosyltransferázy (Fut8) a guanozín difosfát (GDP) -fucose transporter (GDP-fuč-Tr) v každej vzorke bola normalizovaná k expresii génu GAPDH housekeeping odčítaním prahu cyklus (Ct) hodnota GAPDH od toho Fut8 alebo GDP-Tr (ΔCt). Prehyb rozdiel bol vypočítaný odpočítaním ΔCt skúšobnej vzorky od kontrolnej vzorky pre získanie ΔΔCt a následne 2 ^ -ΔΔCt. Prahové hodnoty cyklu presahujúce 40 cyklov bol považovaný pod detekovateľné úrovni. Taví krivky boli získané pre každú reakciu bolo zaručené, že jeden produkt bol amplifikovaný 1,8 :. Štatistická analýza Všetky kvantitatívne premenné boli vyjadrené ako priemer ± smerodajná odchýlka, pokiaľ nie je uvedené inak. Kvantitatívne premenné sa porovnali za použitia Studentovho t-testu, analýzy rozptylu, alebo Neparametrické testy. Pearsonov korelačné koeficienty a príslušné pravdepodobnosti (P) boli použité pre vyhodnotenie korelácia medzi parametrami; Spearmanův korelačné koeficienty boli vypočítané pre poradovými kategorické premenné. boli identifikované nové glykanové biomarkery a vyznačujúci sa vychádza z prednej regresnej analýze. Diagnostický výkon jednotlivých biomarkerov a diagnostických modelov bola hodnotená pomocou analýzy ROC krivky. Senzitivita, špecificita, pozitívna prediktívna hodnota (PPV), negatívne prediktívne hodnota (NPV), a presnosť boli vypočítané s použitím optimálne hodnoty cutoff vybrané z kriviek ROC. Všetky uvádzané hodnoty P sú 2-sledoval a P hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou SPSS 18.0 pre Windows (SPSS Inc.) Výsledky 2.1 :. Rôzne N-glykan profily u pacientov s GC alebo atrofickej gastritídy, a zdravých kontrol Použitie DSA-face technológiu, sme sa zaoberali N-glykanové profily u pacientov s GC (n = 118) alebo na liečenie atrofickej gastritída (n = 89) a u zdravých jedincov (n = 108). kvantifikované sme a štatisticky porovnané vrcholy v 3 skupinách. Aspoň 9 N-glykanové štruktúry (píky), boli zistené vo všetkých vzorkách (obrázok 1). Callewaert kolies a Liu et al zablokovaný štrukturálne analýzu týchto N-glykánov [15,16]. Priemerná relatívna zastúpenie týchto N-glykanové štruktúry sú uvedené v tabuľke 3. hojnosti štruktúr v píky 1, 2, 3, 5, 6, 7, a 9 bol významne odlišný v GC, atrofickej gastritídy, a zdravé kontrolné skupiny, čo naznačuje, že rôzne N-glykan vzory existovali v rôznych patofyziologických podmienok. V porovnaní so zdravou kontrolnou skupinou, vrcholy 1, 2, 5 a 9 boli zvýšené (P 0,05) a vrcholy 3, 6, a 7 boli v skupine GC (P 0,001) sa znížil. Hojnosť štruktúr v vrcholy 3, 5, 6, 7, a 9 bol významne odlišný v skupine GC v porovnaní s atrofickú gastritídou skupine (obrázok 2). 2.2: Stavba a vyhodnotenie diagnostického modelu založeného na N-glykanových markerov rozlíšiť pacientov s rakovinou žalúdka od zdravých kontrol Hodnotili sme GC súvisiace s N-glykanových zmeny založené na logistickej regresie analýza. Logistické regresné koeficienty boli použité pre odhad pomery stávky pre každú z nezávislých premenných. GCglycoA matematický vzorec bol postavený rozlíšiť pacientov GC od zdravých kontrol (GCglycoA = -1,072 + 0,957 * peak4-0.331 * peak6 + 0,646 * peak9). Aby bolo možné posúdiť schopnosti GCglycoA, CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4 diskriminovať pacientov GC sme charakterizovali plochu pod krivkou ROC (AUC). V porovnaní s CEA (AUC = 0,74), CA19-9 (AUC = 0,76), CA125 (AUC = 0,72) a CA72-4 (AUC = 0,67), GCglycoA efektívnejšie významní pacienti GC od normálnych kontrol (AUC = 0,88) u výcvik skupina (obrázok 3A). Tabuľka 4 senzitivita, špecificita, PPV, NPV, a presnosť pre predikciu GC CEA, CA19-9, CA125, CA72-4 a GCglycoA. CEA na odporúčanú hodnotu 5,0 ng /ml mala citlivosť 45.76%, 37 U /ml CA19-9 mal citlivosť 38.14%, 40 U /ml CA125 mal citlivosť 18,64%, a 9,8 U /ml CA72- 4 mal citlivosť 13,56%. Optimálna hodnota cut-off o -0.772 bol vybraný pre GCglycoA na základe analýzy ROC krivky. V tejto limitnej hodnoty, GCglycoA mal senzitivitu 75.42%, čo je zvýšenie citlivosti 29,66%, 37,28%, 56,78% a 61,86% v porovnaní s CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4, v danom poradí. Diagnostická presnosť GCglycoA kritériom pre odlíšenie pacientov GC od zdravých kontrol v porovnaní s CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4, respektíve sa zvýšil o 10,62%, 16,82%, 25,67% a 28,76%. Keď bol model aplikovaný na retrospektívnej validačnej skupine, citlivosť zvýšená 45,00%, 45,00%, 55,00% a 55,00% a presnosť zvýšila 15,00%, 17,50%, 20,00% a 20,00% v porovnaní s CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4, v uvedenom poradí (tabuľka 5). Vo výhľadové vyhodnotenie vyplynulo, že citlivosť zlepšila 65.00%, 65,00%, 85.00% a 80.00% a presnosť zlepšila 30.00%, 27.50%, 37,50% a 37,50% v porovnaní s CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4, v danom poradí (tabuľka 6). 2.3: Stavba a vyhodnotenie diagnostického modelu rozlišovať rakovinu žalúdka od atrofickú gastritídu Použitie logistického regresného modelu, vznikla ďalšia diagnostický model (GCglycoB) rozlišovať medzi GC a atrofickú gastritídou: GCglycoB = 5,273-1,371 * pík2 + 0,781 * peak4-0.453 * peak6 + 0,221 * peak9. Optimálna hodnota cut-off pre GCglycoB (0,594) bol vybraný na základe analýzy ROC krivky. V tréningovej skupine, AUC GCglycoB bola 0,82, zatiaľ čo AUC pre CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4 boli 0,65, 0,63, 0,69 a 0,64, respektíve (obrázok 3B). Diagnostická presnosť GCglycoB v rozlišovaní GC od atrofickej gastritídy vzrástol 21,26%, 24,64%, 31,40% a 34,30% a citlivosť zvýšená 27,97%, 35,59%, 55,09% a 60,17% v porovnaní s CEA, CA19-9, CA125 a CA72- 4, v danom poradí (tabuľka 7). V skupine validačný 85,00% Presnosť z GCglycoB predstavuje nárast o 40,00%, 45,00%, 65,00% a 55,00% a citlivosť 85,00% uviedlo v porovnaní s CEA čo predstavuje nárast o 22.50%, 22.50%, 30,00% a 30,00%, CA19-9, CA125 a CA72-4, v uvedenom poradí (tabuľka 8). V prospektívnej skupine, GCglycoB bol presnejší (85,00% oproti 30,00%, 30,00%, 10,00% a 15,00%) a citlivé (90,00% oproti 62,50%, 62,50%, 55,00% a 55,00% ) než CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4, v danom poradí (tabuľka 9). 2,4: zníženie hladiny celkového kľúčového-fukosylované proteínov karcinómu žalúdka Celková úroveň základných a-1,6-fukosových zvyškov (súčet píky 1, 2, 3, 4, , 6, a 7) bol významne nižší (P 0,001, tabuľka 2), u pacientov, GC, než v atrofickej gastritídy u pacientov a normálnych kontrol. Na potvrdenie tohto zistenia sme vyhodnotili koncentráciu hlavných fukosylované proteínov v sére a tkanivách pacientov s GC za použitia LCA, pretože špecificky rozpoznáva glykoproteíny s alfa-1,6-fukosylovaných-N-acetyl-D-glukosamín-asparagínu (GlcNAc- asp) v trimanosylového jadra. V sére, tam bolo menej LCA viažuci jadro fukosa zvyšky zo skupiny GC než v atrofickej gastritídy a normálne skupín (obr 4A). Celkové množstvo jadra fukosa bola v GC nádorov nižšie ako v párových susednej tkaniva (obrázok 4B). Na určenie, či je zmena celkového fukosylace jadra v GC nádorov súvisiacich s biosyntézou zmenené glykozylácie bola analyzovaná hojnosť cicavčie alfa-1,6-fukosyltransferasy (Fut8) a guanozín difosfát transporter (GDP-Tr) v GC nádorov a susedné tkaniva pomocou RT-PCR. Výsledky ukázali, že expresia mRNA bola Fut8 u nádorov nižšie ako v susednej tkaniva (obrázok 4C). Avšak, neexistuje žiadny významný rozdiel v guanosindifosfát (GDP) -fucose transporter (GDP-fuč-Tr) génovej expresie medzi nádormi a susedné tkaniva (obrázok 4D) 2,5 :. Zmeny v N-glykanové markerov pred a po liečebné chirurgia hojnosť štruktúr v špičkách 1, 4 a 9 bol po operácii významne odlišné v porovnaní s pred operáciou (Tabuľka 10). Výsledky ukázali, že sa zvyšuje v jadre fukosylované vrchole (vrchol 3) a celkového základného fukosylované N-glykánov (sumfuc) boli obrátené po operácii. Desať týždňov po operácii, je hodnota GCglycoA stala negatívne u 11 zo 40 pacientov s GC, rovnako ako hodnotu GCglycoB v 22 zo 40 pacientov s GC. 2.6: Korelácia medzi diagnostických modelov a klinických parametrov V súčasnej dobe sú nádorové markery CEA, CA19-9, CA125 a CA72-4 sú široko používané na skríning a monitorovanie GC. Preto sme dospeli k záveru korelácia medzi jednotlivými N-glykan markerov (vrátane diagnostických modeloch), nádorových biomarkerov a fázy TNM. Výsledky ukázali, že iba fáza TNM pozitívne spojená s GCglycoA (r = 0,355, P 0,001) a GCglycoB (r = 0,345, P 0,001) (tabuľka 11). Hojnosť štruktúr v špičkách 6 a 9 bola významne odlišná medzi fázou TNM (tabuľka 12).
sialidasou (Roche Bioscience, Palo Alto, CA), a spracované vzorky boli analyzované pomocou DSA-face technológiu na kapilárnej elektroforézy na báze ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City , CA). 9. najvyššie vrcholy, ktoré boli detekované vo všetkých vzorkách (čo predstavuje viac ako 90% z celkových sérových N-glykánov) boli analyzované s použitím GeneMapper (Applied Biosystems). Každý N-glykánov štruktúra bola popísaná numericky normalizáciou jeho výšky na súčet výšok všetkých píkov, a my sme analyzovali týchto dát pomocou SPSS 18.0 štatistického software (SPSS Inc., Chicago, IL).
1.6 : extrakcia bielkovín tkanív a lektín savý
Gene
dopredný primer (5'-3 ')
reverznej primer (5'-3'),
Fut85'CCTGGCGTTGGATTATGCTCA 3'5'CCCTGATCAATAGGGCCTTCT 3'GDP-Tr5'CTGCCTCAAGTACGTCGGTG 3'5'CCGATGATGATACCGCAGGTG 3'GAPDH5'ATGGGGAAGGTGAAGGTCG 3'5'GGGGTCATTGATGGCAACAATA 3'Table 2. polymerázová reťazová reakcia pár priméru sekvencie
Skratky: a. , adenozín; C, cytidín; G, guanozín; T, tymidínu; Fut8, fukosyltransferáza; GDP-Tr, guanozín difosfát-fukosa transportér CSV stiahnutie CSV
.
Prostriedky ± SD
Variabilný
Control (n = 128)
atrofická gastritída (n = 108)
GC (n = 138)
F
P
Age, y a50.10 ± 5.9552.11 6.2951.01 ± ± 6.010.270.766Peak 1 a6.96 ± 1.677.64 2.028.20 ± ± 2.7510.09 < 0.001Peak 2 a1.09 ± 0.341.20 0.381.31 ± ± 0.493.120.045Peak 3 a6.28 ± 1.636.47 1.385.76 ± ± 1.2810.48 < 0.001Peak 4 a5.76 ± 0.935.61 0.815.75 ± ± 0.821.120.327Peak 5 a40.02 ± 3.7539.60 3.7642.16 ± ± 4.3314.94 < 0.001Peak 6 a21.40 ± 2.6120.51 2.8516.99 ± ± 2.9888.36 < 0.001Peak 7 a5.87 ± 1.416.02 1.715.21 ± ± 1.2111.15 < 0.001Peak 8 a7.94 ± 1.587.59 2.247.46 ± ± 1.822.240.108Peak 9a2.33±0.922.59±1.554.00±1.7748.12<0.001sumfucab47.37±4.4047.47±5.3043.21±5.9427.01<0.001Table 3. N-glykan profilovanie DNA sekvenceru asistovaných /fluorofor-assisted kapilárnej elektroforézy
Skratky :. GC, karcinóm žalúdka; SD, štandardná odchýlka. a analýzy variance b Sumfuc predstavuje celkový hojnosť α-1,6-fukosylovaných štruktúr (súčet vrcholy 1, 2, 3, 4, 6, a 7). CSV na stiahnutie vo formáte CSV
Cutoff hodnota
Aktuálny stav, Počet subjektov
test
GC +
GC
citlivosť,%
Špecifickosť,%
PPV,%
NPV,%
Presnosť%
CEA (5 ng /ml) GC + 54545.7695.3791.5361.6869.47 GC-64103CA19-9 (37 U /ml), GC + 451038.1490.7481.8257.3163.27GC-7398CA125 (40 U /ml), GC + 22718.6493.5275.8651.2754.42GC-96101CA72-4 (9,8 U /ml), GC + 16813.5692.5966.6749 .5151.33GC-102100GCglycoA (-0,77) GC + 891675.4285.1984.7676.0380.09GC-2992Table 4. Diagnostic Power pre rozlišovanie žalúdočného karcinómu z kontrol v skupine Training
skratky: + pozitívny;. - negatívna; GC, karcinóm žalúdka; GCglycoA, N-glykánov markeru na báze rakovina žalúdka diagnostický model A; NPV, negatívne prediktívne hodnota; PPV pozitívnu prediktívnu hodnotu. CSV k stiahnutiu CSV Cutoff hodnotu
Aktuálny stav, Počet subjektov
test
GC +
GC-
citlivosť,%
Špecifickosť,%
PPV,%
NPV,%
presnosť,%
CEA (5 ng /ml), GC + 8040.00100.00100.0062.5070.00GC-1220CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8140.0095.0088.8961.2967.50GC-1219CA125 (40 U /ml), GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA72-4 (9,8 U /ml), GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420GCglycoA (-0,77), GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 5. Diagnostic Power pre rozlišovanie žalúdočného karcinómu z kontrol v dodatočné kontroly Skupina
Skratky :. + pozitívne; - negatívna; GC, karcinóm žalúdka; GCglycoA, N-glykánov markeru na báze rakovina žalúdka diagnostický model A; NPV, negatívne prediktívne hodnota; PPV pozitívnu prediktívnu hodnotu. CSV na stiahnutie vo formáte CSV
Cutoff hodnota
Aktuálny stav, Počet subjektov
test
GC +
GC-
citlivosť,%
Špecifickosť,%
PPV,%
NPV,%
presnosť,%
CEA (5 ng /ml), GC + 6130.0095.0085.7157.5862.50GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA125 (40 U /ml), GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /ml), GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoA -0.77GC + 19295,0090 .0090.4894.7492.50GC-118Table 6. Diagnostic Power pre rozlišovanie žalúdočného karcinómu z ovládacie prvky v perspektívnych skupine Kontrolné
skratiek :. + pozitívne; - negatívna; GC, karcinóm žalúdka; GCglycoA, N-glykánov markeru na báze rakovina žalúdka diagnostický model A; NPV, negatívne prediktívne hodnota; PPV pozitívnu prediktívnu hodnotu. CSV na stiahnutie vo formáte CSV
Cutoff hodnota
Aktuálny stav, Počet subjektov
test
GC +
GC-
citlivosť,%
Špecifickosť,%
PPV,%
NPV,%
Presnosť%
CEA (5 ng /ml) GC + 541945.7678.6573.9752.2459.90GC-6470CA19-9 (37 U /ml), GC + 451738.1480.9072.5849.6656.52GC-7372CA125 (40 U /ml), GC + 22818.6491.0173.3345.7649.76GC-9681CA72-4 (9,8 U /ml ) GC + 16813.5691.0166.6744.2646.86GC-10281GCglycoB (0,594) GC + 88873.7391.0191.5872.3281.16GC-3081Table 7. Diagnostic Power pre rozlišovanie žalúdočného karcinómu z atrofickú gastritídou v skupine Training
Skratky :. + pozitívne; - negatívna; GC, karcinóm žalúdka; GCglycoB, N-glykánov markeru na báze rakovina žalúdka diagnostický model, B; NPV, negatívne prediktívne hodnota; PPV pozitívnu prediktívnu hodnotu. CSV k stiahnutiu CSV Cutoff hodnotu
Aktuálny stav, Počet subjektov
test
GC +
GC-
citlivosť,%
Špecifickosť,%
PPV,%
NPV,%
presnosť,%
CEA (5 ng /ml), GC + 9445.0080.0069.2359.2662.50GC-1116CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8340.0085.0072.7358.6262.50GC-1217CA125 (40 U /ml), GC + 4220.0090.0066.6752.9455.00GC-1618CA72-4 (9,8 U /ml), GC + 6430.0080.0060.0053.3355.00GC-1416GCglycoB (0,594) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 8. Diagnostic Power pre rozlišovanie žalúdočného karcinómu z atrofickú gastritídou v dodatočné kontroly Skupina
skratiek :. + pozitívne; - negatívna; GC, karcinóm žalúdka; GCglycoB, N-glykánov markeru na báze rakovina žalúdka diagnostický model, B; NPV, negatívne prediktívne hodnota; PPV pozitívnu prediktívnu hodnotu. CSV na stiahnutie vo formáte CSV
Cutoff hodnota
Aktuálny stav, Počet subjektov
test
GC +
GC-
citlivosť,%
Špecifickosť,%
PPV,%
NPV,%
presnosť,%
CEA (5 ng /ml), GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA125 (40 U /ml), GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /ml), GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoB (0,594) GC + 17185.0095.0094.4486.3690.00GC-319Table 9. Diagnostic Power pre rozlišovanie žalúdočného karcinómu z atrofickú gastritídou v perspektívnych skupine Kontrolné
skratiek :. + pozitívne; - negatívna; GC, karcinóm žalúdka; GCglycoB, N-glykánov markeru na báze rakovina žalúdka diagnostický model, B; NPV, negatívne prediktívne hodnota; PPV pozitívnu prediktívnu hodnotu. Automaticky CSV CSV
Priemer ± SD alebo Median (rozmedzie medzi kvartily)
T-test
Variable
pred chirurgickým zákrokom
po operácii a
T alebo Z
P
spoločnosťou Peak 1 b8.92 ± 3.748.49 ± 3.342.0380.048Peak 2 b1.24 ± 0.591.52 ± 1.74-1.0510.300Peak 3 b5.96 ± 1.526.14 ± 1.33-0.6310.531Peak 4 b5.73 ± 0.695.21 ± 1.012.6020.013Peak 5 b40.81 ± 4.8742.27 ± 5.27-1.5130.138Peak 6 b16.74 ± 2.9817.30 ± 2.61-0.8090.423Peak 7 b5.28 ± 1.505.50 ± 1.14-0.7160.478Peak 8 b7.60 ± 2.077.82 ± 1.85-0.5860.562Peak 9b4.11±1.853.29±1.692.0470.047sumfucc43.88±7.7744.16±6.10-0.2170.830GCglycoAd1.07 (0,49, 3,12) 0,28 (-0,90, 1,14) -2.7820.005GCglycoB D1.31 (0,56, 2,41) 0,41 (-0,54, 1,19) -2.3790.017Table 10. N-glykan profilovanie u pacientov s rakovina žalúdka pred a po kuratívnu chirurgia
Skratky :. GCglycoA a GCglycoB, N-glykánov markeru na báze rakovina žalúdka diagnostické vzor a a B, v uvedenom poradí; SD, štandardná odchýlka. A Desať týždňov po operácii. b Párové-vzorky T
Test c Sumfuc udáva celkovú hojnosť ofα-1,6-fukosylována štruktúr. d Wilcoxonův párový test. CSV na stiahnutie vo formáte CSV
Korelácia
CEA
CA19-9
CA125
CA72-4
TNM Stage
GCglycoA
GCglycoB
Peak 1r
0.210a0.127a0.006a-0.023a0.088a0.250b0.055bP
0.0160.1480.9440.7930.3160.0040.532Peak 2r
0.009a0.038a0.011a-0.067a0.010a0.224b-0.099bP
0.9170.6670.9040.4450.9060.0100.258Peak 3r
0.083a0.094a0.066a0.039a-0.115a-0.216b-0.346bP
0.3480.2860.4550.6540.1930.013<0.001Peak 4r
-0.045a0.160a0.047a-0.006a-0.091a0.122b0.074bP
0.6130.0680.5940.9430.3010.1670.403Peak 5r
-0.029a-0.156a-0.020a0.097a0.108a0.299b0.478bP
0.7430.0760.8160.2700.2180.001<0.001Peak 6r
0.009a0.020a0.044a-0.114a-0.348a-0.757b-0.787bP
0.9210.8170.6180.197<0.001<0.001<0.001Peak 7r
-0.039a0.089a-0.075a-0.161a-0.245a-0.368b-0.517bP
0.6580.3110.3940.0660.005<0.001<0.001Peak 8r
-0.135a-0.058a0.002a-0.087a-0.035a-0.215b0.011bP
0.1240.5130.9840.3210.6920.0140.897Peak 9r
0.028a-0.072a-0.034a0.095a0.315a0.794b0.591bP
0.7510.4130.7030.280<0.001<0.001<0.001GCglycoAr
-0.033b-0.042b-0.012b0.046b0.355b10.869bP
0.7100.6370.8960.605<0.001<0.001GCglycoBr
-0.052b-0.045b0.027b0.105b0.345b0.869b1P
0.5580.6110.7600.232<0.001<0.001Sumfuccr
0.061a0.151a0.040a-0.108a-0.170