Ozadje in cilji
Za ugotavljanje in potrjevanje N-glikan biomarkerjev pri raku želodca (GC) in pojasni njihov osnovni molekularni mehanizem delovanja.
skupaj 347 posameznikov, vključno z bolniki z GC (raka želodca) ali atrofični gastritis in zdravih kontrol, so bili naključno razdeljeni v skupine za usposabljanje (n = 287) in retrospektivni skupine potrjevanja (n = 60). Serum N-glikan profiliranje je bila dosežena z DNA sekvencer podprto /-fluorofor pomaga ogljikovih hidratov elektroforezo (DSA-FACE). Dve diagnostični modeli so bili izdelani na osnovi N-glikana profilov z uporabo logistične stopenjsko regresije. Diagnostična uspešnost vsakega modela je bila ocenjena v retrospektivni, bodoči (n = 60), in nadaljnje (n = 40) kohorte. Lektin odtisi so želeli določiti skupno jedro-fucosylation in izražanje genov, ki sodelujejo pri temeljnega fucosylation v GC je bila analizirana z reverzno verižno reakcijo transkriptaze-polimeraze.
Identificirali smo vsaj 9 N-glikan strukture (vrhovi) in ravni osnovnih ostankov fukoze in fucosyltransferase so v GC občutno zmanjšala. Dve diagnostični modeli, imenovan GCglycoA in GCglycoB, so bili zgrajeni za razlikovanje GC iz nadzora in atrofični gastritis. Površine, posejane sprejemnik deluje značilne (ROC) krivuljo (AUC) za tako GCglycoA in GCglycoB so bile višje od tistih, za CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4. V primerjavi z CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4, občutljivost GCglycoA povečal 29.66%, 37.28%, 56,78% in 61,86%, v tem zaporedju, in natančnost poveča 10.62%, 16.82%, 25,67% in 28,76%, v tem zaporedju . Za GCglycoB, občutljivost poveča 27.97%, 35.59%, 55.09% in 60.17% in natančnost v primerjavi s CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4, ki se poveča 21.26%, 24.64% 31.40% in 34.30%. Po kurativno operacijo, jedro fucosylated vrh (peak 3) in skupno jedro fucosylated N-glikanov (sumfuc) so bile odpravljene.
Rezultati so pokazali, da so diagnostični modeli, ki temelji na N- glikan označevalci so dragocene in neinvaziven alternative za prepoznavanje GC. Ugotovili smo, da je zmanjšala za osnovno fucosylation tako v tkivu in serumu bolnikov GC so lahko posledica zmanjšane ekspresije fucosyltransferase
Navedba. Liu L, Yan B, Huang J, Gu Q, Wang L, Fang M, et al. (2013), identifikacija in karakterizacija biomarkerjev Novel-glikana, ki temeljijo N želodčnega raka. PLoS ONE 8 (10): e77821. doi: 10,1371 /journal.pone.0077821
Urednik: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Kliničnega centra, Združene države Amerike
Prejeto: 14. maj 2013; Sprejeto: 4. september 2013; Objavljeno: 17. oktober 2013
Copyright: © 2013 Liu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo
Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (Dotacije 81102693 in 81102565). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa
nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi
Uvod
rak želodca (GC) je četrta rak najbolj razširjena in tretji najpogostejši vzrok smrti zaradi raka, z incidenco približno 930.000; letno, je odgovorna za več kot 700.000 smrtnih žrtev po vsem svetu, in petletno preživetje je 20-30% [1]. Pri bolnikih z GC je preživetje narekuje patološke fazi bolezni v času diagnoze. Na žalost, so pogosti simptomi GC niso značilne za bolezen, in v zgodnji fazi GC ne sme povzročati opaznih simptomov. Kljub povečanju znanja o molekularnih mehanizmov, ki uravnavajo maligno transformacijo in metastaze, skupna stopnja preživetja bolnikov z GC ni bistveno izboljšala. Več molekule bilo priporočljivo, saj GC biomarkerjev, vključno karcinoembrionski antigen (CEA) za pooperativno nadzor, ogljikovih hidratov antigen 19-9 (CA19-9), ogljikovih hidratov antigen 125 (CA125) in antigenom ogljikovih hidratov 72-4 (CA72-4) [2- 6]. Vendar pa nobena od teh tumorskih markerjev pokazale zadostne občutljivosti ali specifičnosti za prepoznavanje GC v zgodnji fazi. Druga možnost je, gastroskopija povečuje stopnjo dokončnih diagnoz, vendar diagnostična vrednost gastroskopijo je omejena s stroški, tveganja in neprijetnosti. Zato je nujno potrebna za razvoj neinvazivnih biomarkerjev, ki omogočajo zgodnje odkrivanje GC.
Povečanje dokazi kažejo na spremembo N-vezanih glikana lahko šteje kot potencialnih biomarkerjev za diagnosticiranje raka. Predhodne študije opazili pomembne spremembe N-vezanih glikanom v različnih raka in raka celičnih linij, ki vključuje raka trebušne slinavke, raka dojke, raka prostate, raka na jajčnikih in rak jeter [7-11]. Dodatna analiza GC razkril tudi, da je brez kompleks tipa N-glikanov nabrali v MKN7 in MKN45 celičnih linij [12]. Vendar pa nihanje in nihanje N-vezanih glikana pri bolnikih, GC, so še vedno v veliki meri neznan.
V naših predhodnih študijah z uporabo DNK-sekvencer pomaga /-fluorofor pomočjo kapilarne elektroforeze (DSA-obraza), smo pokazali, da je razvejane a-1,3-fucosylated triantenarijsko glikana in a biantenarnega glikana bili zelo specifična in občutljiva kandidatke HCC biomarkerjev [13]. V sedanji raziskavi smo uporabili DSA-FACE, da naknadno profil serumu N-glikanov v vzorcih bolnikov z GC ali atrofični gastritis in zdravih posameznikih. značilna smo ugotovljenih GC N-glikan markerje s sprejemnikom, ki delujejo lastnost (ROC) krivulje in potrdil označevalce v bodočih in nadaljnjih generacij. Naš cilj je bil ugotoviti obetavno biomarker za napovedovanje in odkrivanje GC z izboljšano specifičnosti in občutljivosti
Materiali in metode
1.1. Retrospektivna kohorta
Protokol študije je bil odobren s Odbor za etiko kitajski človeških virov na drugem vojaške Medical University. Pisna privolitev je bila pridobljena iz bolnikov in zdravih kontrolah.
Skupno 247 bolnikov z GC (n = 138) ali atrofični gastritis (n = 109) je bilo zaposlenih med letoma 2010 in 2012. diagnoze za vse so vključeni bolniki so histopathologically potrjujejo 2 patologi v bolnišnici Changhai, druge vojaške Medical University (Shanghai, Kitajska). V kontrolni skupini je bilo v istem časovnem obdobju vpisanih 128 starosti in spola ujemanjem zdravih prostovoljcev (brez bolezni). Povprečna starost in spol porazdelitev se ujemajo v 3 skupine. Povzetek podatkov pacientov je določeno v tabeli 1. bolniki GC, ki so prejeli preoperativno radioterapijo, kemoterapijo ali kemoradioterapijo so bili izključeni iz študije.
Povprečna ± SD ali št (%)
Tipičen
Control (n = 128)
atrofični gastritis (n = 109)
GC (n = 138)
Age, y50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.01Men75 (58.59) 60 ( 55,05) 70 (50,72) CEA-pozitivna 5 (3,91) 23 (21,10) 62 (44,93) CA19-9 pozitivnih 11 (8,59) 20 (18,35) 53 (38,41) CA125 pozitivnih 7 (5,47) 10 (9.17) 28 (20.29) CA72-4 pozitivni 8 (6,25) 12 (11,01) 22 (15,94) TNM stageI22 (15,94) II28 (20.29) III63 (45.65) IV25 (18.12) Tabela 1. Značilnosti skupine za usposabljanje.
Kratice : GC, želodčni rak; SD, standardni odklon. CSV Prenos CSV
Skupno 60 bolnikov (20 v vsaki skupini), so bili naključno izbrani iz 3 skupine zgoraj za naknadno preverjanje opisane; preostali bolniki (n = 315) so bile vključene v usposabljanje, določenem za gradnjo diagnostičnega modela. Med 2 leti študije, 40 od 138 bolnikov z GC v skupini treninga smo spremljali pred in po kurativno operacijo, ki temelji na razpoložljivosti. Skupina usposabljanje vključenih 118 bolnikov z GC, 89 bolnikov z atrofični gastritis in 108 zdravih kontrol.
Laboratorij in kliničnih podatkov za vse udeležence so bili pridobljeni iz kliničnih zdravstvenih evidenc, poročil patologije in osebne razgovore. Zbrani podatki vključeni spol, starost in želodčne funkcije raka (kot so lokacija tumorja, histološki razred, globina invazije, in bezgavk metastaze). Vzorce seruma so bili pridobljeni pred kirurške resekcije; Ti vzorci so bili zbrani iz polne krvi z uporabo standardnega protokola, centrifugira pri 10,000xg 20 minut in shranimo pri -80 ° C. napredovanja bolezni pri bolnikih, GC so razvrščeni glede na sedmi izdaji skupnega odbora ameriškega [14]: 20 bolnikov (16,95%) je imelo I. faza bolezni, 25 (21,17%) je stopnja II bolezni, 54 (45,76%) je imela stopnjo bolezni III, in 19 (16,10%) je stopnja IV bolezen
1.2. Bodoči kohorta
Da bi ocenili napovedno vrednost vzorci v retrospektivni študiji je opisan zgoraj, smo naprej raziskovali dodatno skupino (n = 60) bolnikov z GC (n = 20) ali atrofični gastritis (n = 20) in zdravih posameznikih (n = 20), od maja 2012 do novembra 2012 v bolnišnici. Postopki in strategije so bili enaki kot tisti, opisani zgoraj
1,3. Tkivom vzorcih
tkivnega vzorci so bili pridobljeni iz 20 bolnikov GC 138; 2 rezini, tumor in sosednji vzorec tkiva, so bili sprejeti. Vzorci tkiva (približno 1 cm 3) smo takoj zamrznili pri -80 ° C in podvržemo reverzne verižne reakcije transkriptaze-polimerazo (RT-PCR) in lektinsko pivnanjem. Vse tkiva so bili uporabljeni v skladu s Pravilnikom o sveta institucionalni pregled druge vojaške Medical University 1.4. Redno odkrivanje tumorskih markerjev Rutinske tumor marker teste smo izvedli z uporabo standardnih metod in reagentov . CEA in CA19-9 so bile določene na Abbott I2000, in CA72-4 in CA125 vrednosti so bile izmerjene z uporabo Roche Cobas E601. Ravni cut-off, ki ga proizvajalec za CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4 priporoča bila 5,0 mg /L, 39 U /L, 40 U /ml in 9,8 U /ml. Teste smo izvedli na Oddelku za laboratorijske medicine, Changhai Hospital, druge vojaške Medical University, Shanghai 1.5. Serum protein N-glikan profiliranje smo izvedli Serum beljakovin N-glikan analize kot je opisano predhodno [13]. Na kratko smo N-glikanov v 2 xl seruma sprosti iz proteinov s peptid-N-Glycolidase F. (PNGase F) (New England Biolabs, Boston, MA) označenega z 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulphonic kisline (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sialne kisline odstranimo z uporabo Arthrobacter ureafaciens tkiva smo homogenizirali z uporabo malte in pestilo in ponovno suspendirali v lize pufru, ki vsebuje koktajl inhibitor proteaze (Roche Diagnostics, Meylan, Francija). Unlysed frakcijo smo odstranili s centrifugiranjem (dvakrat pri 12000xg 10 minut pri 4 ° C). Koncentracija topnega proteina je bila določena z BioRad testa (BioRad, Marnes-la-coquette, Francija) in vzorci so bili shranjeni pri -80 ° C. Skupno 25 mikrogramov serumskega proteina ali 50 ig proteina pridobljeni iz zamrznjenega tkiva ločimo z 10% natrijevega dodecil sulfata-poliakrilamid gelno elektroforezo. Geli smo obarvali z CBB G250, ali beljakovine v gelu smo prenesli na nitrocelulozno membrano (Whatman /Schleicher & Schuell, Versailles, Francija) za odkrivanje-core fucosylated beljakovine. Membrane smo preko noči blokirali pri 4 ° C s 5% seruma albumina goveje v tris-pufrom (TBS: 140 mM NaCl in 10 mM Tris-HCl) in nato inkubiramo 1 uro pri sobni temperaturi, pri 5 ug /ml biotiniliranega leče culinaris aglutinin A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, CA), v TBS, ki vsebujejo 0,05% Tween-20 (TBST). Po 4 opere vsake s TBST 10 minut, smo membrane inkubirali s IRDye 800CW Streptavidin (1: 10.000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) 1 uro pri sobni temperaturi, speremo 4-krat s TBST, in razvili s pomočjo Odyssey Infrardeči Imaging System (LI-COR Biosciences). Prečiščena albumin (Sigma, St. Louis, MO) je bila uporabljena kot negativna kontrola za lektin blot 1.7. Skupaj ekstrakcijo RNA iz tkiva in kvantitativni PCR v realnem času RNA je bila vzeta iz zamrznjenega tkiva z uporabo Qiagen RNeasy mini komplet po navodilih proizvajalca (QIAGEN GmbH, Hilden, Nemčija). Čistost in koncentracija RNA smo določili s pomočjo spektrofotometra (Eppendorf, Hamburg, Nemčija). cDNA smo sintetizirali z 2 ug celotne RNA z uporabo reverzne transkripcije reagent (Toyobo, Osaka, Japonska). Primerji so bili izdelani s pomočjo Primer Express (Applied Biosystems), in sekvence so predstavljene v tabeli 2. cDNA smo pomnožili v Applied Biosystems 7300 PCR v realnem času stroj v skupni reakcijski volumen 20 ul, ki je vsebovala 10 ml za 2X Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems vključuje hiter začetek Taq DNA reakcija s polimerazo buffer), deoksinukleotid trifosfat mešanico (skupaj z uridin trifosfat, SYBR Green I barvilo in MgCl2) in 2 p.L primerji za vsak gen (pri končni koncentraciji 0,5 μΜ vsakega) . Vsak Reakcijo smo izvedli v treh izvodih. Kolesarske pogoji PCR so bili naslednji: denaturacija pri 95 ° C za 5 minut, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C 15 sekund, 59 ° C ali 55 ° C za 15 sekund in 72 ° C za 45 sekund relativno izražanje a-1,6-fucosyltransferase (Fut8) in gvanozina difosfat (BDP) -fucose transporter (BDP-fuc-Tr) v vsakem vzorcu je normalizirana na izražanje gena GAPDH gospodinjstvo z odštevanjem prag cikel (Ct) vrednost GAPDH od tistega Fut8 ali BDP-Tr (ΔCt). Pokrovček Razlika je bila izračunana tako, da se ΔCt preskusnega vzorca od kontrolnega vzorca za pridobitev ΔΔCt, nato pa se je 2 ^ -ΔΔCt. Vrednosti cikla praga, ki presegajo 40 ciklov, so bile obravnavane pod mejo detekcije. Topijo krivulje smo dobili za vsako reakcijsko zagotoviti, da je en izdelek pomnožili 1,8. Statistična analiza Vse kvantitativne smo izrazili kot standardni odklon povprečne ±, razen če ni navedeno drugače. Kvantitativne spremenljivke so bile v primerjavi z uporabo t-test, analiza variance, ali neparametrični testi. Pearsonov korelacijski koeficienti in z njimi povezane verjetnosti (P), so bili uporabljeni za oceno korelacije med parametri; Spearman je korelacijski koeficienti so izračunani za ordinalnih kategorične spremenljivke. Nova glikan biomarkerjev so bile ugotovljene in označena na podlagi naprej stopenjsko logistično regresijsko analizo. Diagnostična uspešnost posameznega biomarkerjev in diagnostičnih modelov je bil ovrednoten z ROC analizo krivulje. Občutljivost, specifičnost, pozitivna napovedna vrednost (PPV), negativna napovedna vrednost (NPV), in natančnost so bili izračunani z uporabo optimalnih časovnem prelomu vrednosti izbranih iz krivulj ROC. Vse poročali vrednosti P je 2-repa, in P vrednosti < 0,05, so bile obravnavane statistično značilne. Statistične analize so bile izvedene s pomočjo SPSS 18,0 za Windows (SPSS Inc.) Rezultati 2.1. Različne N-glikan profili pri bolnikih s PK ali atrofični gastritis in pri zdravih kontrolah s DSA oči tehnologijo, smo pregledali N-glikan profilov pri bolnikih z GC (n = 118) ali atrofični gastritis (n = 89) in pri zdravih posameznikih (n = 108). Mi količinsko in statistično primerjali vrhove v 3 skupine. Najmanj 9 N-glikan strukture (vrhovi) so bile ugotovljene pri vseh vzorcih (slika 1). Callewaert et al Liu et al prej objavila strukturno analizo teh N-glikanov [15,16]. Povprečna relativna številčnost teh N-glikan struktur je prikazan v tabeli 3. številčnosti struktur v vrhove 1, 2, 3, 5, 6, 7 in 9 je bila bistveno drugačna v GC, atrofični gastritis in zdravo nadzor skupine, ki kažejo, da različni N-glikan vzorci obstajajo v različnih patofizioloških razmerah. V primerjavi z zdravim kontrolno skupino, vrhovi 1, 2, 5 in 9 smo povečali (P 0,05) in vrhove 3, 6 in 7 so bili v skupini GC (P < 0,001) zmanjšalo. Številčnost struktur v vrhove 3, 5, 6, 7 in 9 je bila bistveno drugačna v skupini GC primerjavi s atrofični gastritis skupine (slika 2). 2.2: Gradnja in vrednotenje diagnostičnega modela, ki temelji na N-glikan označevalcev za razlikovanje bolnikov z rakom želodca od zdravi smo ocenili, povezanih z GC N-glikan spremembe temelji na logistične regresije analiza. Logistični regresijski koeficienti so bili uporabljeni za oceno razmerja odds za vsakega izmed neodvisnih spremenljivk. GCglycoA matematična formula, je bila zgrajena za razlikovanje bolnikov GC iz zdravih kontrol (GCglycoA = -1,072 + 0,957 * peak4-0.331 * peak6 + 0,646 * peak9). Za oceno sposobnosti GCglycoA, CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4, da diskriminira bolnikov GC smo značilno območje pod krivuljami ROC (AUC). V primerjavi s CEA (AUC = 0,74), CA19-9 (AUC = 0,76), CA125 (AUC = 0,72) in CA72-4 (AUC = 0,67), GCglycoA učinkoviteje bolnikov ugledni GC iz običajnih kontrol (AUC = 0,88) v uporabniškem skupina za usposabljanje (slika 3A). Preglednica 4 navaja občutljivost, specifičnost, PPV, NPV in natančnost za napovedovanje GC ga CEA, CA19-9, CA125, CA72-4 in GCglycoA. CEA na priporočeno vrednost 5,0 ng /ml imel občutljivost 45.76%, je imela 37 U /ml CA19-9 občutljivost 38.14%, je imela 40 U /ml CA125 občutljivost 18.64% in 9,8 E /ml CA72- 4 imel občutljivost 13,56%. Optimalna mejna vrednost -0.772 bil izbran za GCglycoA temelji na analizi ROC krivulje. Na tej mejno vrednostjo, je imel GCglycoA občutljivost 75.42%, kar je povečanje občutljivosti 29.66% 37.28% 56.78% in 61.86% v primerjavi z CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4 oz. Diagnostična natančnost GCglycoA pri ločevanju GC bolnikov iz zdravih kontrol v primerjavi s CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4, oziroma se je povečalo za 10,62%, 16.82% 25.67% in 28.76%. Ko je bil model uporablja za retrospektivne skupino validacije, občutljivost poveča 45.00%, 45.00%, 55.00% in 55.00% in natančnost v primerjavi s CEA, CA19-9, CA125 povečal 15.00%, 17.50%, 20,00% in 20,00% in CA72-4, oziroma (tabela 5). o možnostih ocena je pokazala, da je občutljivost izboljšati 65,00%, 65,00%, 85,00% in 80,00% in natančnost v primerjavi z izboljšano 30.00%, 27.50%, 37.50% in 37.50% CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4, oziroma (tabela 6). 2.3: Gradnja in vrednotenje diagnostičnega modela razlikovati raka želodca iz atrofični gastritis Z logistično regresijski model, je še en diagnostični model (GCglycoB), ustanovljen razlikovati med GC in atrofični gastritis: GCglycoB = 5,273-1,371 * peak2 + 0,781 * peak4-0.453 * peak6 + 0,221 * peak9. Optimalna mejna vrednost za GCglycoB (0,594) je bil izbran na podlagi analize ROC krivulje. V skupini za usposabljanje, AUC za GCglycoB je bila 0,82, medtem ko je bila AUC za CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4 0.65, 0.63, 0.69 in 0.64, v tem zaporedju (slika 3B). Diagnostična natančnost GCglycoB pri ločevanju GC iz atrofični gastritis povečal 21.26%, 24.64%, 31.40% in 34.30% in občutljivost poveča 27.97%, 35.59%, 55,09% in 60,17% v primerjavi s CEA, CA19-9, CA125 in CA72- 4, oziroma (tabela 7). V skupini validacije je 85,00% natančnost GCglycoB predstavljalo povečanje za 40,00%, 45.00% 65.00% in 55.00% in občutljivost 85,00% so se povečale za 22.50%, 22.50%, 30,00% in 30,00% v primerjavi z CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4, oziroma (tabela 8). V bodoči skupini, je bil GCglycoB bolj natančen (85,00% proti 30,00%, 30,00%, 10,00% in 15,00%) in občutljiv (90,00% proti 62,50%, 62,50%, 55,00% in 55,00% ) kot CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4, oziroma (tabela 9). 2.4: Zmanjšanje vrednosti celotnih-core fucosylated proteinov želodčnega raka Skupna raven ključnih a-1,6-fukoze ostankov (vsota vrhov 1, 2, 3, 4 , 6 in 7), je bistveno nižja (P < 0,001; tabela 2) pri bolnikih GC kot pri bolnikih atrofični gastritis in običajnih kontrol. Da bi potrdili to ugotovitev, smo ocenili koncentracijo osrednjih fucosylated proteinov v serumu in tkivu bolnikov z GC uporabo LCA saj specifično prepozna glikoproteine z alfa-1,6-fucosylated-N-Acetilglukozamin-asparagin (GlcNAc- asp) v jedru trimannosyl. V serumu je bilo manj LCA veže na osrednje ostanki fukoze v skupini GC kot v atrofičnega gastritisa in normalnih skupine (slika 4A). Skupno jedro fukoze številčnost je v GC tumorjev nižja kot v seznanjenih sosednje tkivo (slika 4B). Če želite ugotoviti, ali je bila sprememba celotnega temeljnega fucosylation v GC tumorjev, povezanih s spremenjeno biosintezo glikozilacijo, smo analizirali številčnost sesalcev a-1,6-fucosyltransferase (Fut8) in gvanozina difosfat transporter (BDP-Tr) v GC tumorjev in sosednjih tkiv RT-PCR. Rezultati so pokazali, da je Fut8 mRNA izraz v tumorjih nižja kot v sosednji tkivu (slika 4C). Vendar pa ni bilo bistvene razlike v guanosine difosfata (BDP) -fucose transporter (BDP-fuc-Tr) izražanje genov med tumorjev in sosednje tkivo (Slika 4D) 2.5. Spremembe v N-glikana markerjev pred in po kurativne kirurgije številčnost struktur v vrhove 1, 4 in 9 je bila precej drugačna po operaciji v primerjavi s pred operacijo (tabela 10). Rezultati so pokazali, da so bili povečanje temeljnega fucosylated vrha (maksimalno 3) in vseh ključnih fucosylated N-glikanov (sumfuc) obrnil po operaciji. Deset tednov po operaciji je GCglycoA vrednost pri 11 od 40 bolnikov z GC postala negativna, prav tako pa tudi vrednost GCglycoB pri 22 od 40 bolnikov z GC. 2.6: Korelacije med diagnostičnih modelov in kliničnih parametrov Trenutno so tumorske biomarkerjev CEA, CA19-9, CA125 in CA72-4 se pogosto uporabljajo za pregledovanje in spremljanje GC. Zato smo določili korelacije med posameznimi N-glikan označevalcev (vključno z diagnostičnimi modeli), tumorske biološke označevalce in stopnjo TNM. Rezultati so pokazali, da je bila samo faza TNM pozitivno povezana z GCglycoA (r = 0,355, P < 0,001) in GCglycoB (r = 0,345, P < 0,001) (tabela 11). Številčnost struktur v vrhove 6 in 9 je bila bistveno drugačna od faz TNM (tabela 12).
sialidase (Roche Biološka znanost, Palo Alto, CA), in predelani vzorce smo analizirali z uporabo DSA-FACE tehnologijo na osnovi elektroforeza kapilarna ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, , CA). V 9 najvišji vrhovi, ki so bile odkrite v vseh vzorcih (obračunavanje > 90% celotnih serumskih N-glikanov) smo analizirali s GeneMapper (Applied Biosystems). Vsak N-glikan struktura je številčno opisal normalizacijo vrhunec vsoti višine vseh vrhov, in smo analizirali te podatke s pomočjo SPSS 18.0 statistične programske opreme (SPSS Inc., Chicago, IL).
1.6 : ekstrakcija tkiva beljakovine in lektin pivnik
Gene
Forward Primer (5'-3 ')
Reverse Primer (5'-3')
Fut85'CCTGGCGTTGGATTATGCTCA 3'5'CCCTGATCAATAGGGCCTTCT 3'GDP-Tr5'CTGCCTCAAGTACGTCGGTG 3'5'CCGATGATGATACCGCAGGTG 3'GAPDH5'ATGGGGAAGGTGAAGGTCG 3'5'GGGGTCATTGATGGCAACAATA 3'Table 2. verižna reakcija s polimerazo začetni par zaporedja
Okrajšave: a. adenozin; C citidin; G gvanozin; T timidin; Fut8, fucosyltransferase; BDP-Tr, gvanozin difosfat-fukoze transporter CSV prenos CSV
.
Sredstva ± SD
spremenljivke
Control (n = 128)
atrofični gastritis (n = 108)
GC (n = 138)
F
P
dobe, y a50.10 ± 5.9552.11 ± 6.2951.01 ± 6.010.270.766Peak 1 a6.96 ± 1.677.64 ± 2.028.20 ± 2.7510.09 < 0.001Peak 2 a1.09 ± 0.341.20 ± 0.381.31 ± 0.493.120.045Peak 3 a6.28 ± 1.636.47 ± 1.385.76 ± 1.2810.48 < 0.001Peak 4 a5.76 ± 0.935.61 ± 0.815.75 ± 0.821.120.327Peak 5 a40.02 ± 3.7539.60 ± 3.7642.16 ± 4.3314.94 < 0.001Peak 6 a21.40 ± 2.6120.51 ± 2.8516.99 ± 2.9888.36 < 0.001Peak 7 a5.87 ± 1.416.02 ± 1.715.21 ± 1.2111.15 < 0.001Peak 8 a7.94 ± 1.587.59 ± 2.247.46 ± 1.822.240.108Peak 9a2.33±0.922.59±1.554.00±1.7748.12<0.001sumfucab47.37±4.4047.47±5.3043.21±5.9427.01<0.001Table 3. N-glikan profiliranje, ki ga DNK-sekvencer pomaga /-fluorofor pomaga kapilarno elektroforezo
Okrajšave:. GC, karcinom želodca; SD, standardni odklon. A analize variance b Sumfuc predstavlja skupno obilo α-1,6-fucosylated struktur (vsota vrhov 1, 2, 3, 4, 6 in 7). CSV prenos CSV
Kritična vrednost
dejanskemu stanju, Število predmetov
TEST
GC +
GC-
občutljivost,%
Specifičnost,%
PPV,%
NPV,%
Natančnost%
CEA (5 ng /ml) GC + 54545.7695.3791.5361.6869.47 GC-64103CA19-9 (37 U /ml) GC + 451038.1490.7481.8257.3163.27GC-7398CA125 (40 U /ml) GC + 22718.6493.5275.8651.2754.42GC-96101CA72-4 (9.8 U /ml) GC + 16813.5692.5966.6749 .5151.33GC-102100GCglycoA (-0,77) GC + 891675.4285.1984.7676.0380.09GC-2992Table 4. Diagnostična moč za Razlikovanje želodčnega karcinoma od kontrol v skupini za usposabljanje
Okrajšave: + pozitivni;. - Negativno; GC, karcinom želodca; GCglycoA, N-glikan, ki temelji na dvojno podajo želodčni rak diagnostični model A; NPV, negativna napovedna vrednost; PPV, pozitivna napovedna vrednost. CSV prenos CSV mejna vrednost
dejanskemu stanju, Število predmetov
TEST
GC +
GC-
občutljivost,%
Specifičnost,%
PPV,%
NPV,%
Natančnost%
CEA (5 ng /ml) GC + 8040.00100.00100.0062.5070.00GC-1220CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8140.0095.0088.8961.2967.50GC-1219CA125 (40 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA72-4 (9.8 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420GCglycoA (-0,77) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 5. Diagnostična moč za Razlikovanje želodčnega karcinoma od kontrol v skupini preverjanje Retrospektiva
Okrajšave:. + pozitivna; - Negativno; GC, karcinom želodca; GCglycoA, N-glikan, ki temelji na dvojno podajo želodčni rak diagnostični model A; NPV, negativna napovedna vrednost; PPV, pozitivna napovedna vrednost. CSV Prenos CSV
Kritična vrednost
dejanskemu stanju, Število predmetov
TEST
GC +
GC-
občutljivost,%
Specifičnost,%
PPV,%
NPV,%
Natančnost%
CEA (5 ng /ml) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.50GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9.8 U /ml) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoA -0.77GC + 19295,0090 .0090.4894.7492.50GC-118Table 6. Diagnostični Power Razlikovanje želodčnega karcinoma od kontrol v skupini perspektiv preverjanje
Okrajšave:. + pozitivna; - Negativno; GC, karcinom želodca; GCglycoA, N-glikan, ki temelji na dvojno podajo želodčni rak diagnostični model A; NPV, negativna napovedna vrednost; PPV, pozitivna napovedna vrednost. CSV prenos CSV
Kritična vrednost
dejanskemu stanju, Število predmetov
testu
GC +
GC-
občutljivost,%
Specifičnost,%
PPV,%
NPV,%
Natančnost%
CEA (5 ng /ml) GC + 541945.7678.6573.9752.2459.90GC-6470CA19-9 (37 U /ml) GC + 451738.1480.9072.5849.6656.52GC-7372CA125 (40 U /ml) GC + 22818.6491.0173.3345.7649.76GC-9681CA72-4 (9.8 U /ml ) GC + 16813.5691.0166.6744.2646.86GC-10281GCglycoB (0,594) GC + 88873.7391.0191.5872.3281.16GC-3081Table 7. Diagnostična moč za Razlikovanje želodčnega karcinoma od atrofični gastritis v skupini za usposabljanje
Okrajšave:. + pozitivna; - Negativno; GC, karcinom želodca; GCglycoB, N-glikan, ki temelji na dvojno podajo želodčni rak diagnostični model B; NPV, negativna napovedna vrednost; PPV, pozitivna napovedna vrednost. CSV prenos CSV mejna vrednost
dejanskemu stanju, Število predmetov
TEST
GC +
GC-
občutljivost,%
Specifičnost,%
PPV,%
NPV,%
Natančnost%
CEA (5 ng /ml) GC + 9445.0080.0069.2359.2662.50GC-1116CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8340.0085.0072.7358.6262.50GC-1217CA125 (40 U /ml) GC + 4220.0090.0066.6752.9455.00GC-1618CA72-4 (9.8 U /ml) GC + 6430.0080.0060.0053.3355.00GC-1416GCglycoB (0,594) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 8. Diagnostična moč za Razlikovanje želodčnega karcinoma od atrofični gastritis v skupini preverjanje Retrospektiva
Okrajšave:. + pozitivna; - Negativno; GC, karcinom želodca; GCglycoB, N-glikan, ki temelji na dvojno podajo želodčni rak diagnostični model B; NPV, negativna napovedna vrednost; PPV, pozitivna napovedna vrednost. CSV Prenos CSV
Kritična vrednost
dejanskemu stanju, Število predmetov
TEST
GC +
GC-
občutljivost,%
Specifičnost,%
PPV,%
NPV,%
Natančnost%
CEA (5 ng /ml) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9.8 U /ml) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoB (0,594) GC + 17185.0095.0094.4486.3690.00GC-319Table 9. Diagnostična moč za Razlikovanje želodčnega karcinoma od atrofični gastritis v skupini perspektiv preverjanje
Okrajšave:. + pozitivna; - Negativno; GC, karcinom želodca; GCglycoB, N-glikan, ki temelji na dvojno podajo želodčni rak diagnostični model B; NPV, negativna napovedna vrednost; PPV, pozitivna napovedna vrednost. CSV Prenos CSV
Povprečna ± SD ali srednjemu (interkvartilni razpon)
T
-Test
Variable
Pred kirurgijo
Po kirurgijo A
T ali Z
P
Peak 1 b8.92 ± 3.748.49 ± 3.342.0380.048Peak 2 b1.24 ± 0.591.52 ± 1.74-1.0510.300Peak 3 b5.96 ± 1.526.14 ± 1.33-0.6310.531Peak 4 b5.73 ± 0.695.21 ± 1.012.6020.013Peak 5 b40.81 ± 4.8742.27 ± 5.27-1.5130.138Peak 6 b16.74 ± 2.9817.30 ± 2.61-0.8090.423Peak 7 b5.28 ± 1.505.50 ± 1.14-0.7160.478Peak 8 B7.60 ± 2.077.82 ± 1.85-0.5860.562Peak 9b4.11±1.853.29±1.692.0470.047sumfucc43.88±7.7744.16±6.10-0.2170.830GCglycoAd1.07 (0,49, 3,12) 0,28 (-0,90, 1,14) -2.7820.005GCglycoB d1.31 (0,56, 2,41) 0,41 (-0,54, 1,19) -2.3790.017Table 10. N-glikan profiliranje pri bolnikih z želodčni rak Pred in po zdravilni kirurgijo
Okrajšave:. GCglycoA in GCglycoB, N-glikan, ki temelji na dvojno podajo rak želodca diagnostični vzorci A in B, v tem zaporedju; SD, standardni odklon. a Deset tednov po operaciji. b Seznanjene-vzorca T
Test c Sumfuc kaže skupno obilo ofα-1,6-fucosylated strukture. d Wilcoxonov preizkus podpisan-rank. CSV prenos CSV
Korelacija
CEA
CA19-9
CA125
CA72-4
TNM Stage
GCglycoA
GCglycoB
Peak 1r
0.210a0.127a0.006a-0.023a0.088a0.250b0.055bP
0.0160.1480.9440.7930.3160.0040.532Peak 2r
0.009a0.038a0.011a-0.067a0.010a0.224b-0.099bP
0.9170.6670.9040.4450.9060.0100.258Peak 3r
0.083a0.094a0.066a0.039a-0.115a-0.216b-0.346bP
0.3480.2860.4550.6540.1930.013<0.001Peak 4r
-0.045a0.160a0.047a-0.006a-0.091a0.122b0.074bP
0.6130.0680.5940.9430.3010.1670.403Peak 5r
-0.029a-0.156a-0.020a0.097a0.108a0.299b0.478bP
0.7430.0760.8160.2700.2180.001<0.001Peak 6r
0.009a0.020a0.044a-0.114a-0.348a-0.757b-0.787bP
0.9210.8170.6180.197<0.001<0.001<0.001Peak 7r
-0.039a0.089a-0.075a-0.161a-0.245a-0.368b-0.517bP
0.6580.3110.3940.0660.005<0.001<0.001Peak 8r
-0.135a-0.058a0.002a-0.087a-0.035a-0.215b0.011bP
0.1240.5130.9840.3210.6920.0140.897Peak 9r
0.028a-0.072a-0.034a0.095a0.315a0.794b0.591bP
0.7510.4130.7030.280<0.001<0.001<0.001GCglycoAr
-0.033b-0.042b-0.012b0.046b0.355b10.869bP
0.7100.6370.8960.605<0.001<0.001GCglycoBr
-0.052b-0.045b0.027b0.105b0.345b0.869b1P
0.5580.6110.7600.232<0.001<0.001Sumfuccr
0.061a0.151a0.040a-0.108a-0.170