PLoS ONE: Superior Antitumoractiviteit van nanodeeltjes albumine-gebonden paclitaxel bij Experimental MaagKanker

Abstract

Maagkanker is de tweede oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd en mist zeer effectieve behandeling van gevorderde ziekte. Nab-paclitaxel is een nieuwe microtubule-remmende cytotoxisch middel, dat niet in maagkanker is getest tot nu toe. In deze studie, menselijke maagkanker cellijnen AGS, NCI-N87 en SNU16 bestudeerd. Nab-paclitaxel remden celproliferatie met een IC50 van 5 nM in SNU16, 23 nM in AGS en 49 nM in NCI-N87 cellen na 72 uur behandeling, die lager is dan die van oxaliplatine (1,05 uM tot 1,51 uM) en epirubicine was ( 0,12 uM tot 0,25 uM). Nab-paclitaxel behandeling verhoogde expressie van de mitotische spindel geassocieerd fosfo-stathmin ongeacht de basislijn gehele of gefosforyleerd stathmin niveau, en geïnduceerde mitotische celdood zoals bevestigd door de verhoogde expressie van gesplitst-PARP en caspase-3. Na twee weken nab-paclitaxel, oxaliplatine of epirubicine, de gemiddelde in vivo lokale tumorgroei remming bedroeg 77, 17,2 en 21,4 procent, respectievelijk (p = 0,002). Effecten van therapie op de tumor proliferatie en apoptotische indices correspondeerde met tumorgroei remming gegevens, terwijl de expressie van fosfo-stathmin ook toegenomen in weefsels. Er was een toename van de mediane overleving van dieren na nab-paclitaxel behandeling (93 dagen) vergeleken met controles (31 dagen, p = 0,0007), oxaliplatine (40 dagen, p = 0,0007) of docetaxel (81 dagen, p = 0,0416) . De sterke antitumoractiviteit van nab-paclitaxel in experimentele maagkanker ondersteunen zoals microtubule-remmende strategie voor klinische toepassing. Nab-paclitaxel voordelen werden onafhankelijk van gefosforyleerd stathmin expressie bij aanvang waargenomen, dat wordt getornd aan de overweging van NAB-paclitaxel gebruik bij maagkanker op basis van deze vermeende biomarker

Visum:. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior antitumoractiviteit van nanodeeltjes albumine-gebonden paclitaxel bij Experimental maagkanker. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10.1371 /journal.pone.0058037

Editor: Lu-Gang Yu, Universiteit van Liverpool, Verenigd Koninkrijk

Ontvangen: 20 november 2012; Aanvaard: 29 januari 2013; Gepubliceerd: 27 februari 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende. kanker en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1] - [3]. De meeste patiënten gevorderde of metastatische ziekte op het moment van diagnose [4], [5]. De combinatie van oxaliplatine en 5-fluorouracil, met en zonder epirubicine, is uitgegroeid tot de meest gebruikte behandeling in de eerste lijn chemotherapie voor gevorderde maagkanker [6], [7]. Echter, deze combinatiebehandeling heeft het potentieel aanzienlijke bijwerkingen en draagt ​​nog beperkte werkzaamheid, patiënten- sombere prognose met een mediane overleving van ongeveer 10 maanden blijft [8] - [11]. In een poging om de overleving te verbeteren en om de toxiciteit te verlagen moleculair gerichte therapie actief onderzocht voor de behandeling van maagkanker [12].

Microtubuli zijn lang beschouwd als een doelwit van belang voor sommige geneesmiddelen tegen kanker vanwege het universele rol in delende cellen en essentiële rol bij mitose [13] - [15]. Paclitaxel en docetaxel klassieke microtubule inhibitoren die hun activiteit uitoefenen door het bevorderen van tubuline polymerisatie en stabilisatie van microtubules resulteert in G2-M-fase arrestatie en mitotische celdood [15]. Mitotische celdood is een vorm van celdood in het bijzonder optreden tijdens mitotische stadia veroorzaakt door DNA-beschadigende agenten en spindel vergif /mitotische remmers [16], [17]; Het is vooral caspase afhankelijk, maar onder zeldzame omstandigheden kan ook caspase onafhankelijke [18]. Paclitaxel is getest voor geavanceerde en recidiverende maagkanker met een respons van 43% in combinatie met 5-fluorouracil en folinezuur [9], [19]. In vergelijking met de respons van 38~45% opgeleverd door een combinatie van oxaliplatin met 5-fluorouracil en folinezuur, paclitaxel leidde niet tot superieure overleving maar veroorzaakte meer bijwerkingen, vooral bij oudere patiënten [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paclitaxel vereist emulsificatie met oplosmiddelen om intraveneuze toediening die heeft geresulteerd in overgevoeligheidsreacties en potentieel dramatische bijwerkingen toe bij patiënten [23], [24]. Nanodeeltjes albumine-gebonden (NAB) paclitaxel is een roman-albumine gestabiliseerd, Cremophor-vrij en in water oplosbare nanopartikelformulering van paclitaxel. Het wordt goed verdragen zonder overgevoeligheidsreacties na intraveneuze infusie [25]. Klinische en experimentele studies aangetoond dat in vergelijking met paclitaxel op, NAB-paclitaxel hadden hogere tumor retentie, lagere toxiciteit [23], [26] en krachtiger antitumor effecten op borstkanker, niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC), pancreaskanker kanker, melanoom, en hoofd- en nekkanker [27] - [31]. Echter, de mogelijke rol van nab-paclitaxel bij maagkanker cellen niet getest vooralsnog

Stathmin, een microtubule destabiliserende fosfoproteïne, is een belangrijke regulator van microtubuli polymerisatie en dynamiek [32] -. [34] en bleek samen te hangen met taxaan resistentie in bepaalde tumortypen via de aanpassing drug binding en vertragen G2-M faseovergang [33], [35]. Stathmin remming had een synergetisch antiangiogene en antitumoractiviteit met taxol [36]. Stathmin expressie werd geconstateerd in diverse menselijke tumoren zoals maagkanker te zijn, en kan derhalve een aantrekkelijk doelwit voor kankertherapie [34] vertegenwoordigen [37], [38]. Jeon et al. vond dat stathmin zou kunnen dienen als een prognostische marker en een potentieel therapeutisch doel voor maagkanker [37]. Fosforylering van stathmin vermindert de microtubule destabiliserende effecten, een verschijnsel dat ook is toegeschreven aan taxaan activiteit [34].

Deze studie evalueerde de antitumor activiteiten van nab-paclitaxel in menselijke maagkanker cellen in vitro en in vivo. We vergeleken de antitumor werkzaamheid van nab-paclitaxel met andere cytotoxische middelen op lokale tumorgroei en overleving van dieren. We meten ook de uitdrukking van totale stathmin en fosfo-stathmin in vitro en vivo hun rol beoordelen als voorspellende markers in het NAB-paclitaxel antitumor response.

Materialen en methoden

Cell cultuur en reagentia

de menselijke maagkanker cellijnen AGS, NCI-N87 en SNU16 werden verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) en gekweekt in RPMI 1640 medium (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO _{2 atmosfeer. Nab-paclitaxel werd gekocht van Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). Oxaliplatine werd gekocht van Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Docetaxel, epirubicine en 5-fluorouracil werden verkregen van een plaatselijke apotheek. De cel proliferatie reagens WST-1 werd gekocht van Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

Cell levensvatbaarheid assay

levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd door de colorimetrische WST-1 test. De meting is gebaseerd op het vermogen van levensvatbare cellen om de gesulfoneerde tetrazoliumzout splitsen WST-1 (4- [3- (4-joodfenyl) -2- (4-nitrofenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, 3- benzeen naftaleendisulfonaat) door mitochondriaal dehydrogenase [39]. Maagkanker cellen (5000 cellen per well) werden uitgeplaat in een 96-putjesplaat in normale groeimedium en werden behandeld met nab-paclitaxel, 5-fluoruracil, oxaliplatine en epirubicine na 16 uur incubatie. Het concentratiebereik gebruikt (1 nM tot 10 uM) was vergelijkbaar met de klinisch bereikbare concentraties. Na aanvullende incubatie van 72 uur werd 10 pl WST-1 reagens in elk putje toegevoegd gevolgd door incubatie gedurende 2 uur. De absorptie bij 450 nm werd gemeten met een microplaat reader.

celcyclusanalyse

Cel cyclus analyse werd uitgevoerd onder toepassing van stroomcytometrie met fluorescerende propidium jodide (PI) kleuring. Cellen werden gekweekt en behandeld met nab-paclitaxel, oxaliplatin, epirubicine en docetaxel gedurende 8 tot 24 uur. De cellen werden vervolgens verzameld en in 75% ethanol-PBS gefixeerd nacht bij -20 ° C. De cellen werden gedurende 5 min bij 2000 x g. Het celpellet werd geresuspendeerd en geïncubeerd in 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100 en 1 mg /ml RNAse A in PBS gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. De suspensie werd vervolgens geanalyseerd op een Becton Dickinson FACScan. De verhouding van cellen in de sub-G1, G1, S en G2-M fasen van de celcyclus werd bepaald door hun DNA gehalte.

immunocytochemische analyse

Maagkanker cellen (1 x 10 ^{5 cellen per kamer) werden uitgezet in een 4-kamer slide in de reguliere groeimedium. Na 24 uur werden de cellen behandeld met nab-paclitaxel gedurende 16 uren en vervolgens in 4% paraformaldehyde gefixeerd. De cellen werden met CAS blokkerende buffer, gevolgd door 1 uur incubatie met fosfo-stathmin antilichaam (1:100) en 40 minuten incubatie met Cy3 (1:200 verdunning) secundair antilichaam. Glaasjes werden gemonteerd met bevestigingsoplossing met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fluorescentie microscopie werd gebruikt om fluorescentiesignalen via de IX81 Olympus microscoop voorzien van een Hamamatsu Orca digitale camera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ). Detecteren}

Western blotanalyse

Sub-confluente monolagen van cellen werden behandeld met NAB-paclitaxel, oxaliplatin en epirubicine. Cellysaten en tumor lysaten werden verkregen zoals eerder beschreven [40]. Supernatanten werden gewonnen door centrifugeren bij 13.000 rpm, eiwitconcentraties werden gemeten en werden vergelijkbare hoeveelheden eiwit werden gescheiden door SDS-PAGE. Eiwitten werden overgebracht op PVDF-membranen (Bio-Rad, Hercules, CA) en de membranen werden 1 uur geblokkeerd in TBS-T. De membranen werden overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met de volgende antilichamen: totaal stathmin, fosfo-stathmin (ser38), gesplitst poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), gesplitst caspase-3 (alle van Cell Signaling Technology , Beverly, MA), α-tubuline en β-actine (beide van Sigma, St. Louis, MO). De membranen werden vervolgens geïncubeerd met de overeenkomstige HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) gedurende één uur. Specifieke banden werden gedetecteerd met behulp van de verbeterde chemoilluminescence reagens (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) op autoradiografische film.

subcutane tumorgroei studie

Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en goedgekeurd protocollen van de Universiteit van Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional Animal Care en gebruik Comite (Permit Number 2012-0081). De dieren werden dagelijks gedurende het experiment op tekenen van leed bewaakt. Vrouwelijke SCID muizen (6-8 weken) werden gebruikt voor vergelijkende modellering van subcutane tumorgroei. Maagkanker cellen (10 x 10 ^{6 NCI-N87 of 20 x 10 6 SNU16 cellen) werden subcutaan geïnjecteerd in elke muis. Muizen werden tweemaal per week gewogen. Veertien dagen na injectie van tumorcellen, alle muizen hadden meetbare tumor (gemiddelde tumorgrootte 100 tot 150 mm 3). Muizen werden vervolgens willekeurig ingedeeld (n = 6~8 per groep) en intraperitoneaal behandeld met PBS (controle), nab-paclitaxel (10 mg /kg in 100 pl PBS, 2 keer per week), oxaliplatine (5 mg /kg in 100 gl PBS, 2 keer per week), en epirubicine (1 mg /kg in 100 pl PBS, 2 keer per week) gedurende 14 dagen. De tumorgrootte werd tweemaal per week gemeten via remklauw en tumor volume (V) werd berekend met behulp van de formule V = ½ [L x (W) 2], L = lengte en W = breedte. Relatieve tumorvolume (RTV) werd bepaald volgens de formule RTV = V _{n /V 0 waarbij V 0 en V 1 vertegenwoordigen tumorvolume op dag 0 en de volgende meting dag, respectievelijk. De tumorgroei inhibitie werd berekend met de formule (1-RTVt /RTVc) x 100% waarbij t en C behandeld en controlegroep. Na afloop van de behandeling werden alle muizen gedood met CO2, tumoren werden verwijderd, gewogen, uitgesneden en bewerkt voor histologische, immunohistochemische en Western blotanalyse.}}

Immunohistochemische analyse

Tumor weefselmonsters werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde en ingebed in paraffine. Intratumorale proliferatie werd gemeten door Ki67 nucleair antigen kleuring volgens protocol van de fabrikant (Abcam, Cambridge, MA). In paraffine ingebedde weefselcoupes werden gesneden (5 pm), van paraffine ontdaan, gerehydrateerd en antigeen opgehaald. Het weefsel secties werden met CAS blokkerende buffer, gevolgd door 1 uur incubatie met 1:200 verdunning van primaire Ki67 of fosfo-stathmin antilichaam (1:200) en 40 minuten incubatie met Cy3 (1:200 verdunning) secundair antilichaam. Glaasjes werden gemonteerd met bevestigingsoplossing met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen). Intratumorale proliferatieve index en stathmin activiteit werd geëvalueerd door het berekenen van de positieve cellen uit vijf hoge krachtvelden (HPF) op een blinde wijze. Intratumorale apoptotische activiteit werd geëvalueerd door kleuring weefselsecties met "Apoptag Apoptosis Detection Kit" volgens (Millipore) instructies van de fabrikant. Fluorescentie microscopie werd gebruikt om fluorescentiesignalen via de IX81 Olympus microscoop voorzien van een Hamamatsu Orca digitale camera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) en een DSU spinning confocale toestel met Slidebook software (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA) detecteren.

Animal survival analyse

Animal overleving studies werden uitgevoerd met behulp van 6- tot 8-weken oude vrouwelijke SCID muizen [41]. De muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met SNU16 (40 × 10 ^{6) cellen en lichaamsgewicht tweemaal per week gemeten. Drie weken na injectie van tumorcellen muizen werden willekeurig ingedeeld (n = 6-8 per groep).}

In de eerste overleving studie werden muizen intraperitoneaal behandeld met PBS (controle), nab-paclitaxel (10 mg /kg in 100 pl PBS, 2 keer per week), en oxaliplatine (5 mg /kg in 100 pl PBS, 2 keer per week) gedurende 2 weken. In de tweede overleving studie werden muizen intraperitoneaal behandeld met PBS (controle), nab-paclitaxel (10 mg /kg in 100 pl PBS, 2 keer per week), docetaxel (3 mg /kg in 100 pl PBS, 2 keer per week ) of oxaliplatine (5 mg /kg in 100 pl PBS, 2 keer per week) gedurende 2 weken. Dierenleed werd verminderd met euthanasie bij het draaien stervende volgens vooraf bepaalde criteria, waaronder snelle gewichtsverlies of winst (> 15%), het niet eten of drinken, lethargie, onvermogen rechtop te blijven en gebrek aan kracht. Dierlijke overleving werd beoordeeld vanaf de eerste dag van behandeling tot de dood.

Statistische analyse

Overlevingsanalyse werd geëvalueerd met GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software, San Diego, CA). In vitro celproliferatie gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. Statistische analyse werd uitgevoerd door ANOVA voor meerdere groepsvergelijking en t-toets voor het individu groepsvergelijking. Survival groep vergelijking werd uitgevoerd via log-rank-test binnen een Kaplan-Meier soort analyse. Waarden van p < 0,05 werden beschouwd als statistisch significante verschillen groep vertegenwoordigen

Resultaten

Stathmin expressie bij maagkanker cellen

Analyse van de menselijke maagkanker cellen AGS, NCI-. N87 en SNU16 bleek dat alle drie lijnen geuit stathmin. Geen verschil van totale stathmin expressie werd gevonden tussen deze drie cellijnen. Expressie van fosfo-stathmin varieerde tussen de cellijnen, in de volgende volgorde: SNU16 > AGS > NCI-N87-cellen (Figuur 1A).

Nab-paclitaxel maag remt proliferatie van kankercellen

Nab-paclitaxel remde maag kankercelproliferatie op een dosis-afhankelijke wijze, en remming van de celproliferatie verschenen dezelfde orde als expressie fosfo-stathmin (Figuur 1B) volgen. Bij 100 nM concentratie remming in cel proliferatie was 94,5, 66,7 en 41,8 procent in respectievelijk SNU16, AGS en NCI-N87 cellen. Nab-paclitaxel toonde de hoogste antiproliferatieve potentie met de laagste effectieve dosering te vinden in alle 3 cellijnen getest in vergelijking met 5-fluouracil, oxaliplatin en epirubicine. De IC _{50 NAB-paclitaxel 5 nM in SNU16, 23 nM in AGS en 49 nM in NCI-N87 cellen, die minder dan 5-fluouracil (6,46 uM in SNU16 >was, 10 pM in AGS en 10,2 uM in NCI-N87 cellen), oxaliplatine (1,51 micrometer in SNU16, 1,64 uM in AGS en 1,05 micrometer in NCI-N87 cellen) of epirubicine (0,12 micrometer in SNU16, 0,16 uM in AGS en 0,25 micrometer in NCI-N87 cellen) ( Figuur 1C).}

Nab-paclitaxel induceert G2 arrestatie en mitotische celdood in vitro

Om het onderliggende mechanisme van de groei remming door NAB-paclitaxel te evalueren, de celcyclus profiel werd geanalyseerd. Zoals getoond in Figuur 2A, NAB-paclitaxel (100 nM) resulteerde in G2-M celcyclus arrestatie in SNU16 cellen. Het percentage propidiumjodide positieve cellen in G2-M-fase steeg 35,6-71,6 na 100 nM nab-paclitaxel behandeling van 12 uur. Gelijkaardige veranderingen aangebracht in AGS en NCI-N87 cellen met nab-paclitaxel en docetaxel behandeld maar niet met oxaliplatin en epirubicine (figuren S1 en S2).

Effect van nab-paclitaxel op mitotische celdood, expressie fosfo -stathmin en apoptose-gerelateerde eiwitten werd gemeten door immunocystochemistry en Western blot. Nab-paclitaxel behandeling veroorzaakt microtubule verstoring en mitotische arrestaties bij maagkanker cellen zoals waargenomen door de nucleus fragmentatie en karyopyknosis (Figuur 2B). Expressie fosfo-stathmin werd verhoogd na nab-paclitaxel behandeling en hogere expressie fosfo-stathmin werd geassocieerd met een grotere mate van mitotische arrestatie, nucleus fragmentatie of karyopyknosis en celdood (figuur 2B en 2C). Nucleaire fragmentatie en karyopyknosis opgetreden in 16,7% van de cellen met een lage expressie van fosfo-stathmin maar in 95,7% van de cellen met hoge expressie van fosfo-stathmin (r = 0,672, p < 0,001). Ook was er bewijs voor tijdsafhankelijke verhoogde expressie van fosfo-stathmin door NAB-paclitaxel behandeling (figuur 2D).

We hebben gekeken of de mitotische celdood geïnduceerd door NAB-paclitaxel kon deels worden gecorreleerd met de inductie van apoptose . Evaluatie van PARP-1 en caspase-splitsing 3 splitsing als markers inductie van apoptose bleek dat bij maagkanker cellen nab-paclitaxel, oxaliplatin en epirubicine behandeling veroorzaakte een toename in de expressie van zowel gesplitste PARP-1 en caspase-3. Deze expressie van apoptose-gerelateerde eiwitten bleken hoger na nab-paclitaxel behandeling in vergelijking met oxaliplatine of epirubicine behandelingen (figuur 2E).

Nab-paclitaxel remt de groei van maagkanker xenotransplantaten

In vivo antitumor effecten van nab-paclitaxel geëvalueerd in een muizen xenograft model met behulp SNU16 cellen. Nab-paclitaxel bij 10 mg /kg tweemaal per week gedurende twee weken werd goed verdragen zonder duidelijke tekenen van toxiciteit zoals beoordeeld door muis gewicht en dagelijkse beoordeling. Na twee weken behandeling nab-paclitaxel in statistisch significante remming van tumorgroei (p = 0,0004), die groter zijn dan die van oxaliplatine (p = 0,0361) en epirubicine (p = 0,032) in vergelijking met dragercontrole respectievelijk was (Fig 3A). De tumor groeiremming na 2 weken behandeling met nab-paclitaxel, oxaliplatin en epirubicine was 77, 17,2 en 21,4 procent (p = 0,002) resp. Alleen NAB-paclitaxel behandeling creëerde een verkleining van subcutane laesies in vergelijking met hun vooraf bepaalde grootte van de tumor. Gemiddelde tumorgewicht werd significant verlaagd door nab-paclitaxel (0,154 ± 0,075 g versus 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037), maar niet met oxaliplatine (0,408 ± 0,12 g) of epirubicine (0,46 ± 0,172 g) behandeling in vergelijking met vehikel controle, respectievelijk (figuur 3A). We hebben ook onderzocht de antitumor effecten van de NAB-paclitaxel op NCI-N87 xenograft muis lokale tumoren. Na twee weken behandeling nab-paclitaxel resulteerde in significante remming van het tumorvolume (p = 0,0023) (figuur 3B) en de tumorgroeiremming bedroeg 72,8 procent. Gemiddelde tumorgewicht in de nab-paclitaxel behandelde groep was significant lager dan in de dragercontrolegroep (0,093 ± 0,026 g versus 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (Figuur 3B). Geen significante verandering in lichaamsgewicht muizen werd waargenomen in een van de nab-paclitaxel, oxaliplatine of epirubicine behandeling groepen.

Nab-paclitaxel mitotische induceert celdood in vivo

Mechanismen van in vivo antitumoractiviteit NAB-paclitaxel werden verder onderzocht in de tumor weefsel van SNU16 en NCI-N87 xenotransplantaten. Een significante toename in de expressie van fosfo- stathmin waargenomen in SNU16 (figuur 4A) en NCI-N87 (figuur 4B) xenograft tumoren met de behandeling van nab-paclitaxel zowel immunohistochemisch en Western blot analyses.

Tumor weefsel uit nab-paclitaxel behandelde muizen vertoonden een verminderde tumor celproliferatie tarief. Een Ki67 expressie gebaseerde intratumorale proliferatieve index daalde met 90,7% (p = 0,001) in vergelijking met controles bij de NAB-paclitaxel behandelde groep tegenover 72,6% (p = 0,004) in de oxaliplatine behandelde groep en 67,7% (p = 0,003 ) in epirubicine behandelde groep (Figuur 5A). Nab-paclitaxel veroorzaakte een sterkere remming effect op de proliferatie van tumorcellen dan oxaliplatin en epirubicine.

Onderzoek van apoptose in tumorweefsels gebleken dat de inductie van apoptotische index was 7,9-voudig in de nab-paclitaxel (p = 0,013 ), 5,7-voudig oxaliplatine behandelde dieren (p = 0,024) en 5,2-voudige in de epirubicine behandelde groep (p = 0,042) over de basislijn in de controlegroep (Figuur 5B).

Nab-paclitaxel verhoogt dieroverleving

in de eerste overlevingsstudie de mediane overleving van SCID NOD-muizen was 24 dagen in de controlegroep. Opgelopen tot 86 dagen na nab-paclitaxel behandeling (p = 0,0004 versus controlegroep, p = 0,0005 versus oxaliplatinegroep) en 37,5 dagen na behandeling met oxaliplatine (p = 0,0004 versus controlegroep). De groep overleven bereik was ook superieur na NAB-paclitaxel behandeling (bereik: 75-95 dagen) in vergelijking met behandeling met oxaliplatine. (Bereik: 34-41 dagen) (Figuur 6A)

In het tweede survival studie, mediaan overleving van SCID NOD-muizen was 31 dagen in de controlegroep. Deze toegenomen tot 93 dagen na de NAB-paclitaxel behandeling (p = 0,0007 ten opzichte van de controle en oxaliplatin groep, en p = 0,0416 vs. docetaxel-groep), tot 81 dagen na de behandeling met docetaxel (p = 0,0007 ten opzichte van controles) en tot 40 dagen door oxaliplatine behandeling (p = 0,038 versus controlegroep). De groep overleven range was 75-96 dagen na de NAB-paclitaxel behandeling in vergelijking met de behandeling met docetaxel (bereik: 74-93 dagen) en behandeling met oxaliplatine (bereik: 35 tot 45 dagen). (Figuur 6B)

Discussie

Geavanceerd maagkanker is levensbedreigend en vertegenwoordigt een formidabele behandeling uitdaging. Traditionele dubbele of drievoudige cytotoxische chemotherapie hebben beperkte effecten en bijwerkingen en chemoresistance [42] veroorzaken - [44]. Deze studie toont duidelijk aan dat nab-paclitaxel aanzienlijk sterker antitumor effect op maagkanker cellijnen dan momenteel gebruikte cytotoxische middelen oxaliplatin en epirubicine in vitro en in vivo, gemeten antiproliferatieve effecten, apoptose, mitotische celdood, gelokaliseerd antitumor respons en overleving aanverwante tumor last.

in vitro studie toonde aan dat nAB-paclitaxel is zeer krachtig in het remmen van proliferatie cel voor menselijke maag-cellijnen dan oxaliplatin en epirubicine. SNU16 cellen zijn gevoeliger voor NAB-paclitaxel dan NCI-N87 cellen. Sommige studies bleek dat stathmin werd gecorreleerd met taxaan weerstand en stathmin knock-down kan de gevoeligheid voor taxaan [33] te verhogen, [36]. We testten de expressie van stathmin en vond geen verschil tussen deze drie cellijnen. Interessant, wanneer we de expressie fosfo-stathmin onderzoek vonden we dat het vermogen van nab-paclitaxel in vitro remt celproliferatie was in dezelfde rangorde als uitdrukking van fosfo-stathmin in deze drie maagkanker cellen: SNU16 > AGS > NCI-N87. Het leek dus in eerste instantie werd dat fosfo-stathmin expressie gecorreleerd met de NAB-paclitaxel werkzaamheid, de kredietverlening enige steun van een hypothese dat fosfo-stathmin als een potentiële biomarker voor NAB-paclitaxel antitumor reactie in de maag de behandeling van kanker te voorspellen kan dienen.

We voerden een NCI-N87 xenograft onderzoek naar de anti-tumor effect van de NAB-paclitaxel te evalueren. Vrij onverwacht, NAB-paclitaxel aanzienlijk geremd NCI-N87 xenograft tumorgroei in vergelijking met de controlegroep. Deze enigszins afwijkende resultaten lijken te suggereren dat de in vivo antitumor effect van nab-paclitaxel bij maagkanker onafhankelijk van de basislijn expressie van fosfo-stathmin of totale stathmin zijn. Aangezien slechts drie cellijnen werden getest, kunnen we niet maken een definitieve conclusie over de relatie tussen stathmin of fosfo-stathmin en nab-paclitaxel werkzaamheid bij maagkanker. Verder onderzoek met stathmin knock-outs moet nuttig zijn om deze kwestie aan te pakken en te onderzoeken de rol van stathmin als biomarker voor het NAB-paclitaxel werkzaamheid zijn.

In deze studie hebben we vervolgens vergeleken anti-tumor effect van nab paclitaxel met oxaliplatin en epirubicine op SNU16 xenograft lokaal tumoren. Nab-paclitaxel bleek sterker anti-tumor werkzaamheid dan oxaliplatin en epirubicine die in overeenstemming zijn met de in vitro celproliferatie resultaten en tumorweefsel proliferatie en apoptose data was. Hoewel 5-fluouracil is de gevestigde enkel middel geneesmiddel in chemotherapeutische maagkanker zorg wordt de tumor respons van 5-fluoruracil gemeld onvoldoende worden voorspeld SCID muismodellen tot het punt waar het geheel geen antitumor effecten [45] waargenomen. Cisplatine en oxaliplatine, krachtiger induceerders van apoptose en ook veelvuldig bij maagkanker chemotherapeutische behandeling, zijn vaker gekozen als middelen ter vergelijking met nieuwe middelen die worden getest [22], [45]. Paclitaxel op meer bijwerkingen en niet overleving voordelen toe vergeleken met oxaliplatin in de klinische behandeling van maagkanker [22]. In onze studies, heeft oxaliplatin statistisch niet verschillen van epirubicine. We kiezen daarom oxaliplatin als uitgangspunt agent in het voortbestaan ​​dier studie en vond dat NAB-paclitaxel verhoogd mediane overleving muis met ongeveer 40 dagen op oxaliplatin, een meer dan het dubbele effect dan dat bereikt door oxaliplatin. Docetaxel lijkt de actievere taxaan zijn, met snellere cellulaire opname en intracellulaire langere retentie in vergelijking met paclitaxel op [46]. We voerden een andere survival studie om anti-tumor effect van de NAB-paclitaxel met docetaxel te vergelijken en vond dat de mediane overleving tijd enigszins werd verlengd na NAB-paclitaxel behandeling (93 dagen versus 81 dagen, p = 0,0416). Onze resultaten waren consistent met de resultaten van een recente Fase II borstkanker studie waaruit bleek dat 100 mg /m ^{2 NAB-paclitaxel hadden langere mediane totale overleving (hazard ratio 0,575, p = 0,008) in vergelijking met docetaxel [47]. Op basis van onze resultaten nab-paclitaxel sterker antitumor werkzaamheid bij experimentele maagkanker en blijkt een redelijk krachtige nieuwe chemotherapeutisch middel vormen voor klinische maag kankerbehandeling.}

Stathmin een belangrijke microtubule-microtubule destabiliserende fosfoproteïne. Wanneer stathmin gefosforyleerd, het microtubule destabiliserende activiteit af [32], [34] en kan verbeteren gevoeligheid voor taxaan. Stathmin gefosforyleerd vooral op het cycline-afhankelijke eiwitkinase (CDK) bindingsplaats Ser38 in mitose [32], en dus werden onze expressie analyses van de ser38 residu. We vonden dat nab-paclitaxel verhoogd fosfo-stathmin expressie in vitro en in vivo en is gecorreleerd met mitotische arrestatie, nucleaire fragmentatie, karyopyknosis en mitotische celdood. Mitotische cel overlijden in die cellen met hoge expressie van fosfo-stathmin. Zhou et al. [33] bleek dat-down gereguleerd stathmin expressie na STMN1 gen knock-down in de lever carcinoom cel 7,7-voudige gevoeligheid toegevoegd aan nab-paclitaxel en 2,7-voudige gevoeligheid voor oplosmiddelen op basis van paclitaxel, maar geen gevoeligheid voor doxorubicine. De moleculaire aard dat celdood veroorzaakt tijdens langdurige mitotische arrestatie blijft slecht gedefinieerd [17], [32]. Spileenheid checkpoints zijn lang gedacht een cruciale rol spelen tijdens dit proces [48]. In deze studie, nab-paclitaxel-geïnduceerde fosforylatie van stathmin bij maagkanker cellen, die naar verwachting de microtubule inrichting, waardoor mitotische arrestatie en trekker celdood kunnen veroorzaken stabiliseren. Hoewel deze zijn vroege en voorlopige gegevens, enige steun voor fosfo-stathmin reguleren NAB-paclitaxel antitumor activiteit is waargenomen en verdient verder worden geëvalueerd.

Tot slot, de huidige studie toont aan dat enkel middel NAB-paclitaxel had een sterkere antitumoractiviteit in experimentele maagkanker dan de huidige standaard chemotherapeutische middelen oxaliplatin en epirubicine, en bleek de superieure taxaan vergelijking met docetaxel. Deze sterke anti-tumor activiteit ondersteunt de rationale voor de klinische evaluatie van de NAB-paclitaxel als veelbelovende microtubule-remmende middel bij maagkanker.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Nab-paclitaxel leidt tot G2-M-fase-arrest bij maagkanker cellen. (A) Histogrammen tonen celcyclus profielen van AGS en NCI-N87 cellen op verschillende tijdstippen na de NAB-paclitaxel behandeling. Maagkanker cellen werden gedurende 24 uur en vervolgens behandeld met 100 nM nab-paclitaxel gedurende 12 uur of 24 uur. Celcyclus analyse werd uitgevoerd door flowcytometrie. De getoonde resultaten zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. (B) celcyclusverdeling maagkanker cellen behandeld met 100 nM nab-paclitaxel. . Symbool * merken voorwaarden waaronder cellen had gedesintegreerd
doi: 10.1371 /journal.pone.0058037.s001
(TIF)
Figuur S2.
celcyclus progressie van maagkanker cellen behandeld met oxaliplatine, epirubicine en docetaxel. (A) Histogrammen tonen celcyclus profielen van SNU16 en AGS cellen na oxaliplatin, epirubicine en docetaxel behandeling. Maagkanker cellen werden gedurende 24 uur en vervolgens behandeld met 10 uM nab-paclitaxel, oxaliplatin, epirubicine en docetaxel gedurende 8 uur. Celcyclus werd uitgevoerd door flowcytometrie. De getoonde resultaten zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten.

• PLoS ONE: Restauratie van miR-1228 * Expression Onderdrukt-mesenchymale transitie in Gastric Cancer
• PLoS ONE: MDM2 SNP309 rs2279744 polymorfisme en Gastric Cancer Risk: A Meta-Analysis