Plos ONE: Superior antitumorsko aktivnost nanodelcev albuminov-Bound Paklitaksel eksperimentalne Rak želodca

Povzetek

Rak želodca je drugi najpogostejši vzrok raka povezanih smrti po vsem svetu in nima zelo učinkovitega zdravljenja napredovale bolezni. Nab-paclitaxel je roman mikrotubulsko zavira citotoksična, ki ni bila testirana na raka želodca kot doslej. V tej študiji so proučevali človeške želodčne rakave celične linije AGS, NCI-N87 in SNU16. Nab-paclitaxel inhibira proliferacijo celic z IC50 5 nM v SNU16, 23 nM v letnem pregledu rasti in 49 nM v NCI-N87 celic po 72-urni zdravljenja, ki je bila nižja od tiste, ki oksaliplatina (1,05 um do 1,51 LM) in epirubicinom ( 0,12 um do 0,25 um). Zdravljenje nab-paclitaxel povečano izražanje mitotska-vretena povezano fosfo-stathmin ne glede na izhodiščno skupaj ali fosforiliranim ravni stathmin in povzroča odmiranje celic mitotićno kar potrjujejo povečano izražanje cepi-PARP in kaspaze-3. Po dva tedna nab-paklitakselom, oksaliplatinske ali epirubicin tretiranje, povprečna vivo lokalni stopnji zaviranja rasti tumorja je bila 77, 17,2 in 21,4 odstotka, v tem zaporedju (p = 0,002). Učinki terapije na tumorskih proliferacije in apoptotska indeksov sovpadala s podatki zaviranja rasti tumorja, medtem ko izraz fosfo-stathmin povečala tudi v tkivih. Prišlo je do povečanja v srednji preživetje živali po nab-paklitakselom zdravljenja (93 dni) v primerjavi s kontrolno skupino (31 dni, p = 0,0007), oksaliplatinom (40 dni, p = 0,0007) ali na zdravljenju z docetakselom (81 dni, p = 0,0416) . Močna protitumorsko aktivnost nab-paklitaksela v eksperimentalni rakom želodca, podpirajo takšno mikrotubulov zavira strategije za klinično uporabo. Nab-paklitaksela so opazili koristi neodvisno od fosforiliranega stathmin izražanja na izhodišču, s čimer pod vprašaj upoštevanje uporabe nab-paklitakselom na raka želodca, ki temelji na domnevni biomarker

Navedba. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S Schwarz RE (2013) Superior antitumorsko aktivnost nanodelcev albuminov-Bound paklitaksel eksperimentalne rak želodca. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10,1371 /journal.pone.0058037

Urednik: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Velika Britanija

Prejeto: 20. november 2012; Sprejeto: 29. januar 2013; Objavljeno: 27. februar 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

nasprotujočimi si interesi. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je četrta najbolj razširjena. rak in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu [1] - [3]. Večina bolnikov je napredovalo ali metastatsko boleznijo ob diagnozi [4], [5]. Kombinacija oksaliplatinom in 5-fluorouracilom, z in brez epirubicin, je postal najbolj razširjen režim v prvi liniji kemoterapije za napredovalim rakom želodca [6], [7]. Vendar pa je ta kombinacija zdravljenja ima potencial za znatne stranskih učinkov in še vedno nosi omejeno učinkovitost, medtem ko je prognoza bolnikov ostaja žalostna z mediano preživetje okoli 10 mesecev [8] - [11]. V prizadevanju za izboljšanje preživetja in zmanjšanje toksičnosti, molekularno usmerjena terapija se aktivno raziskovali za zdravljenje raka želodca [12].

mikrotubulov že dolgo velja cilj zanimanja za nekatera zdravila proti raku zaradi njihova univerzalna vlogo pri razraščajo celice in njihovo bistveno vlogo pri mitoze [13] - [15]. Paklitaksel in docetaksel so klasične mikrotubulnih inhibitorjev, ki izvajajo svojo dejavnost s spodbujanjem polimerizacije tubulina in stabilizacijo mikrotubulov, ki izhajajo v G2-M fazo aretacijo in celične smrti mitotičnem [15]. Mitotićni celična smrt je način celične smrti, ki se pojavljajo predvsem v mitotićnih stopnjah z DNK škodljivo agentov in vretena strupov induciranih /mitotičnem inhibitorji [16], [17]; gre predvsem kaspaze odvisna, vendar v redkih primerih se lahko kaspaze tudi neodvisni [18]. Paklitaksel je bil testiran za napredne in ponavljajočih želodčnih raka s stopnjo odziva 43% v kombinaciji s 5-fluorouracilom in folne kisline [9], [19]. V primerjavi s stopnjo odgovora 38~45% s kombinacijo oksaliplatina s 5-fluorouracilom in folne kisline obrodila, paclitaxel ni prišlo v vrhunski preživetje, ampak povzroča več stranskih učinkov, zlasti pri starejših bolnikih [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paklitaksel potrebno emulzifikacijo s topili, da intravenski kar je privedlo do preobčutljivostne reakcije in potencialno dramatične stranskih učinkov pri bolnikih, [23] [24]. Nanodelcev albumin vezan (nab) paklitaksel je nov albuminsko stabiliziran, kremofor in brez vodotopna nanodelcev formulacija paklitaksela. To je dobro prenašajo brez preobčutljivostne reakcije po intravenski infuziji [25]. Klinične in eksperimentalne študije so pokazale, da v primerjavi s paklitakselom, ki temelji topila, so imeli nab-paklitaksel višjo zadrževanje tumorja, nižjo toksičnost [23], [26] in močnejše protitumorne učinke na rak dojke, nedrobnocelični pljučni karcinom (NSCLC), trebušne slinavke rak, melanom, in raka glave in vratu [27] - [31]. Vendar pa je potencialna vloga nab-paklitaksela v želodcu rakave celice niso testirani kot še

Stathmin, a-mikrotubulsko destabilizacijo fosfoprotein, ki je pomemben regulator mikrotubularne polimerizacije in dinamike [32] - [34]. in je bilo ugotovljeno, da je povezana z odpornosti taksane pri nekaterih vrstah tumorjev skozi spremembo zdravilo zavezujoča in zavlačujejo G2-M fazni prehod [33], [35]. Zaviranje Stathmin imela sinergistično antiangiogenetsko in protitumorsko aktivnost z taksola [36]. Stathmin izraz bilo ugotovljeno, da je prisoten v različnih človeških raka, vključno z rakom želodca, zato lahko predstavlja atraktivno tarčo za terapijo raka [34], [37], [38]. Jeon sod. ugotovil, da bi stathmin služi kot prognostični označevalec in potencialnega terapevtskega cilja za rakom želodca [37]. Fosforilacijo stathmin zmanjšuje njene mikrotubulov destabilizacijske učinke, pojav, ki je bil prav tako pripisati taksane dejavnosti [34].

Ta študija je ocenila protitumorne aktivnosti nab-paklitaksela v človeške želodčne rakavih celic in vitro in in vivo. Primerjali smo učinkovitost protitumorsko za nab-paklitaksela do drugih citotoksičnih zdravil za lokalno rast tumorjev in preživetje živali. Prav tako smo izmerili izražanje celotne stathmin in fosfo-stathmin in vitro in in vivo za presojo njihove vloge kot napovedni označevalcev v nab-paclitaxel odgovor protitumorskega.

Materiali in metode

Cell kulture in reagenti

človekovih želodčni rak celične linije AGS, NCI-N87 in SNU16 so bili pridobljeni iz American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) in kultivirali v RPMI 1640 medija (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS) pri 37 ° C v navlaženi 5% CO _{2 atmosferi. Nab-paclitaxel je bila kupljena od Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). Oksaliplatin je bila kupljena od Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Docetaksel, epirubicina in 5-fluorouracil so bili pridobljeni iz lokalnega farmacije. celica reagent širjenje WST-1 je bila kupljena od Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

preživetja celic test

preživetja celic je ocenil kolorimetrično WST-1 testom. Merjenje temelji na sposobnosti živih celic, da odcepitev sulfoniranega tetrazolom sol WST-1 (4- [3- (4-jodofenil) -2- (4-nitrofenil) -2H-5-tetrazolio] -1, 3- benzen disulfonata), ki ga mitohondrijskih dehidrogenaz [39]. raka želodca celice (5.000 celic na jamico) smo nanesli na ploščo s 96 vdolbinami v rednem gojišča in so bili zdravljeni z nab-paklitaksela, 5-fluorouracil, oksaliplatina in epirubicin po 16 urah inkubacije. Območje koncentracij uporabljena (1 nM do 10 uM), je bila primerljiva z njihovimi klinično dosegljivih koncentracijah. Po dodatnem inkubaciji 72 ur, je bilo 10 ul WST-1 reagent dodamo v vsako jamico čemur sledi inkubacija 2 uri. Absorbanca pri 450 nm smo merili z uporabo mikroploščnega čitalnika.

Cell ciklusu

analize celičnega cikla smo izvedli s pretočno citometrijo z fluorescentno propidijevim jodidom (PI) barvanjem. Celice smo kultivirali in obdelamo s nab-paklitaksel, oksaliplatin, epirubicin in docetaksela za 8 do 24 ur. Celice smo nato zbrali in fiksna v 75% etanola-PBS preko noči pri -20 ° C. Celice smo centrifugirali 5 minut pri 2000 x g. Celični del je bil ponovno suspendirali in inkubirali pri 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100 in 1 mg /ml RNaze A v PBS 45 minut pri sobni temperaturi. Suspenzijo smo nato analizirali s Becton Dickinson FACSCAN. Razmerje med številom celic v sub-G1, G1, S in G2-M fazi celičnega cikla je bila določena z njihovo vsebino DNK.

imunocitokemijski analiza

želodca rakave celice (1 x 10 ^{5 celic na komoro) smo nanesli v 4-komorni diapozitiv v rednem gojišča. Po 24-urnem smo celice obdelali s nab-paklitaksela 16 ur in nato pritrdi na 4% paraformaldehida. Celice smo inkubirali s CAS z blokirnim pufrom sledi 1-urni inkubaciji z fosfo-stathmin protitelesa (1:100) in 40 minutah inkubacije s Cy3 (1:200 redčenje) sekundarnih protiteles. Ploščice smo pritrdi s pomočjo pritrdilne raztopino, ki vsebuje 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fluorescenčna mikroskopija je bila uporabljena za odkrivanje fluorescentnih signalov s pomočjo IX81 Olympus mikroskop opremljen z Hamamatsu Orca digitalni fotoaparat (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).}

Western blot analiza

Sub-Strnjena plast celic so bili zdravljeni z nab-paklitakselom, oksaliplatinom in epirubicinom. Celični lizati in tumorske lizate smo dobili kot je opisano predhodno [40]. Supernatante smo izoliramo s centrifugiranjem pri 13000 obratih na minuto, so bile izmerjene koncentracije beljakovin in enake količine celotnega proteina smo ločili s SDS-PAGE. Proteine ​​smo prenesli na PVDF membrano (Bio-Rad, Hercules, CA) in membrane smo blokirali 1 uro v TBS-T. Membrane inkubiramo preko noči pri 4 ° C z naslednjimi protitelesi: skupno stathmin, fosfo-stathmin (ser38) cepimo poli (ADP-riboza) polimerazo-1 (PARP-1) cepimo kaspaza-3 (vsi iz celic signalnih Technology Beverly, MA), α-tubulin in β-aktin (oboje od Sigma, St. Louis, MO). Membrane smo nato inkubirali z ustreznimi sekundarnih protiteles HRP-konjugiranimi (Pierce Biotehnologija, Santa Cruz, CA), za eno uro. Posebni trakovi so odkrili s pomočjo okrepljenega chemoilluminescence reagenta (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) na avtoradiografsko filmu.

subkutana rast tumorja študija

Vsi poskusi na živalih so bile izvedene v skladu s smernice in odobreni protokoli University of Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) institucionalnega varstva živali in odbora medicini (Dovoljeno številka 2012-0081). Živali smo dnevno spremljali skozi celoten poskus za vsak znak stiske. Ženski SCID miši (6 do 8 tednov), smo uporabili za primerjalno modeliranje podkožnega rasti tumorja. Želodčne rakave celice (10 x 10 ^{6 NCI-N87 ali 20 × 10 6 SNU16 celice), so subkutano injicirali v vsako miš. Miši smo stehtali dvakrat na teden. Štirinajst dni po injiciranju tumorskih celic, so vse miši merljiv tumor (povprečno velikost tumorja od 100 do 150 mm 3). Miši so bile nato naključno združeni (n = 6~8 na skupino) in obdelane intraperitonealno s PBS (kontrola), nab-paklitaksel (10 mg /kg v 100 ul PBS, 2-krat na teden), oksaliplatin (5 mg /kg pri 100 ul PBS, 2-krat na teden) in epirubicin (1 mg /kg v 100 ml PBS, 2-krat na teden), za 14 dni. Velikost tumorja smo izmerili dvakrat tedensko preko čeljusti in volumen tumorja (V) izračunamo z uporabo formule V = pol [L x (W) 2], L = dolžino in W = širina. Relativna količina tumor (RTV) je bila določena v skladu s formulo RTV = V _{n /V 0, kjer V 0 in V 1 predstavljajo obseg tumorja na dan 0 in naslednjim dnem meritev, oz. stopnja zaviranja rasti tumorja smo izračunali z uporabo formule (1-RTVt /RTVc) x 100%, kadar t in c predstavljajo zdravljenje in kontrolno skupino. Po končanem zdravljenju so bile vse miši žrtvovati s CO2, so odstranili tumor, stehtati, secirali in pripravljena za histoloških, imunohistokemijske in Western blot analizo.}}

Imunohistokemijsko analiza

vzorce tumorskega tkiva so bile določene v 4% paraformaldehida in vdelali v parafin. Intratumorska orožja je bila merjena z Ki67 jedrska antigena barvanjem po protokolu proizvajalca (Abcam, Cambridge, MA). odseki tkiva-parafin vgrajeni smo razrezali (5 um), deparaffinized, rehidrirano in antigen najdena. odseki tkiva inkubiramo s CAS z blokirnim pufrom sledi 1-urni inkubaciji z 1:200 redčenjem osnovne Ki67 ali fosfo-stathmin protitelesa (1:200) in 40 minutah inkubacije s Cy3 (1:200 redčenje) sekundarnih protiteles. Ploščice smo pritrdi s pomočjo pritrdilne raztopino, ki vsebuje 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen). Intratumorska proliferacije indeks in stathmin aktivnost je bila ocenjena z izračunom pozitivne celice iz petih različnih področjih visoke moči (HPF) v slepi način. Intratumorska apoptotske aktivnost je bila ocenjena z obarvanjem dele tkiva z "Apoptag apoptoze Detection Kit" v skladu z (Millipore) navodili proizvajalca. Fluorescenčna mikroskopija je bila uporabljena za odkrivanje fluorescentnih signalov s pomočjo IX81 Olympus mikroskop opremljen z Hamamatsu Orca digitalni fotoaparat (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) in predenje konfokalna enoto DSU uporabo Slidebook programske opreme (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).

preživetje živali analiza

študije preživetja na živalih so bile izvedene z uporabo 6- do 8 tednov stare ženske SCID miši [41]. Miši smo intraperitonealno vbrizgali SNU16 (40 x 10 ^{6) celice in telesna teža se je, merjeno dvakrat na teden. Tri tedne po vbrizgavanje tumorske celice miši naključno razvrščeni (n = 6 do 8 na skupino).}

V prvi študiji preživetja miši smo obdelali intraperitonealno s PBS (kontrola), nab-paklitaksel (10 mg /kg v 100 ml PBS, 2-krat na teden) in oksaliplatin (5 mg /kg v 100 ml PBS, 2-krat na teden), 2 tedna. V drugi študiji preživetja miši obdelane intraperitonealno s PBS (kontrola), nab-paklitaksel (10 mg /kg v 100 ul PBS, 2-krat tedensko), docetaksel (3 mg /kg v 100 ul PBS, 2-krat na teden ) ali oksaliplatin (5 mg /kg v 100 ul PBS, 2-krat na teden) za 2 tedna. trpljenje živali, ki se je zmanjšala za euthanizing ko zavijemo so umirale v skladu z vnaprej določenimi merili, vključno s hitrim hujšanjem ali dobiček (> 15%), neupoštevanje jesti ali piti, letargija, nezmožnost, da ostane pokonci in pomanjkanje moči. preživetje živali, je bila ocenjena na prvi dan zdravljenja do smrti.

Statistična analiza
analiza

Preživetje je bila ocenjena z GraphPad Prism 5 Programska oprema (GraphPad Software, San Diego, CA). In vitro celice so podatki orožja izražena kot srednja vrednost ± standardni odklon. Statistična analiza je bila opravljena z ANOVA za večkratno primerjavo skupino in t-test za posamezno primerjavo skupine. Preživetje skupina Primerjava je bila izvedena s pomočjo testa log-ranga v analizi tipa Kaplan-Meier. Vrednosti p < 0,05 so menili, da predstavljajo statistično značilne razlike v skupini

Rezultati

Stathmin izraz v želodčnih rakavih celic

Analiza človeških želodca rakave celice AGS, NCI-. N87 in SNU16 je pokazala, da so vse tri vrstice izražena stathmin. Ne razlikuje od celotnega izraza stathmin je bilo med temi tremi celičnih linij. Izražanje fosfo-stathmin gibal med celičnih linij, v naslednjem vrstnem redu: SNU16 > AGS > NCI-N87 celice (slika 1A).

Nab-paclitaxel zavira proliferacijo želodčni rak celic

Nab-paclitaxel zavrla širjenje želodčni rak celic v modi odvisnosti od odmerka, in zaviranje v celične proliferacije pojavil slediti isti vrstni red kot izraz fosfo-stathmin (slika 1B). Pri 100 nM inhibicije koncentracij v proliferacije celic je bila 94,5, 66,7 in 41,8 odstotka v SNU16, AGS in NCI-N87 celic oz. Nab-paclitaxel pokazala najvišjo antiproliferativno potenco z najnižjega učinkovitega odmerka najdemo v vseh 3 celičnih linijah preizkušen v primerjavi s 5-fluouracil, oksaliplatinom in epirubicinom. IC _{50 nab-paklitaksela bilo 5 nM v SNU16, 23 nM v letnem pregledu rasti in 49 nM v NCI-N87 celic, kar je manj kot 5-fluouracil (6,46 LM v SNU16, > 10 mikrometrov v letnem pregledu rasti in 10,2 LM v NCI-N87 celic), oksaliplatin (1,51 LM v SNU16, 1,64 LM v letnem pregledu rasti in 1,05 iM v NCI-N87 celic) ali epirubicin (0,12 LM v SNU16, 0.16 uM v letnem pregledu rasti in 0,25 iM v NCI-N87 celic) ( Slika 1C).}

Nab-paclitaxel napeljuje G2 aretacijo in mitotićno odmiranje celic in vitro

Za oceno mehanizma, zaviranje rasti po nab-paklitaksela, je bil analiziran profil celica cikel. Kot je prikazano na sliki 2A, nab-paclitaxel (100 nm) povzročila G2-M ustavitev celičnega cikla v SNU16 celicah. Odstotek propidijevim jodida pozitivnih celic v G2-M fazi povečal od 35,6 do 71,6 po 100 nM nab-paklitakselom zdravljenja 12 ur. Podobne spremembe so se zgodile v AGS in NCI-N87 celic z nab-paklitaksela in zdravljenje z docetakselom, ne pa z oksaliplatinom in zdravljenje epirubicin (Številke S1 in S2).

Učinek nab-paklitaksela na mitotičnem celične smrti, izražanje fosfo -stathmin in proteinov povezanih apoptosis smo izmerili s immunocystochemistry in Western blot. Nab-paclitaxel zdravljenje povzroča motnje mikrotubulov in mitotičnem aretacije v želodčnih rakave celice, ki jih jedra razdrobljenost in karyopyknosis (Slika 2B) opazili. Izražanje fosfo-stathmin je po nab-paklitakselom zdravljenja povečal, in višji izraz fosfo-stathmin je bilo povezano z večjo stopnjo mitotićnih aretacij, fragmentacije jedro ali karyopyknosis in celične smrti (slika 2B in 2C). Jedrska razdrobljenost in karyopyknosis pojavila pri 16,7% celic z nizko ekspresijo fosfo-stathmin vendar pri 95,7% celic z visoko ekspresijo fosfo-stathmin (r = 0.672, p < 0,001). Tam je bil tudi dokaz za časovno odvisne povečano izražanje fosfo-stathmin jih nab-paklitakselom zdravljenja (slika 2D).

preučil smo, če bi smrt mitotska celic, ki jih nab-paklitaksela povzroča delno povezati z indukcijo apoptoze . Vrednotenje PARP-1 cepitev in kaspaza-3 cepitvijo kot označevalci indukcijo apoptoze pri pokazala, da v želodčnih rakavih celicah nab-paklitaksel, oksaliplatin in epirubicina zdravljenje povzročila povečanje izražanja tako odcepimo PARP-1 in kaspaza-3. Ta izraz proteinov, povezanih z apoptoze pojavila večja po nab-paklitakselom zdravljenja v primerjavi z oksaliplatinom ali epirubicin zdravljenja (slika 2E).

Nab-paclitaxel zavira rast želodca presadkov raka

V vivo antitumorsko učinki NAB-paklitaksela so ocenili v mišje modelu ksenotransplantskih uporabo SNU16 celice. Nab-paclitaxel terapijo pri 10 mg /kg dvakrat na teden za dva tedna dobro prenašali brez očitnih znakov toksičnosti, kot je soditi po teži miške in dnevno oceno. Po zdravljenju dveh tednov, nab-paclitaxel zdravljenje povzročilo statistično značilno zaviranje rasti tumorja (p = 0,0004), ki je bilo večje od tistih, ki oksaliplatina (p = 0,0361) in epirubicinom (p = 0,032) v primerjavi s kontrolno skupino nosilca, v tem zaporedju (slika 3A). stopnja zaviranja rasti tumorja po zdravljenju 2-tedenski s nab-paklitakselom, oksaliplatinom in epirubicinom je bila 77, 17,2 in 21,4 odstotka (p = 0,002), v tem zaporedju. Le nab-paclitaxel zdravljenje ustvaril zmanjšanje velikosti podkožnih lezij v primerjavi z njihovo preestablished velikost tumorja. Pomeni, je teža tumor bistveno zmanjšal za zdravljenje nab-paklitakselom (0,154 ± 0,075 g vs 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037), vendar ne z oksaliplatinom (0,408 ± 0,12 g) ali epirubicin (0,46 ± 0,172 g) zdravljenje glede na vozilo nadzor, in sicer (slika 3A). Prav tako smo ocenili učinke protitumorne za nab-paklitaksela na NCI-N87 ksenogenskega miško lokalnih tumorjev. Po dveh tednih zdravljenja, nab-paclitaxel zdravljenje povzročilo znatno inhibicijo volumna tumorja (p = 0,0023) (slika 3B) in stopnjo zaviranja rasti tumorja je bila 72,8-odstotna. Pomeni maso tumorja v skupini, ki je nab-paklitakselom je bila bistveno manjša kot v skupini vozil (0,093 ± 0,026 g vs 0,288 ± 0,02 g, p = 0.0054) (slika 3B). Ni bistveno spremenila miš telesne mase so opazili v katerem koli od nab-paklitaksel, oksaliplatinu ali epirubicin zdravljenje skupin.

Nab-paclitaxel inducira mitotićno odmiranje celic in vivo

Mehanizmi in vivo protitumorsko aktivnost za nab-paclitaxel so podrobneje proučen v tumorskih tkiv, pridobljenih iz SNU16 in NCI-N87 presadkov. v SNU16 (slika 4A) in NCI-N87 (slika 4B) ksenotransplantskih tumorjev pri zdravljenju nab-paklitaksela tako s Imunohistološka in Western blot analiz so opazili bistveno povečanje v izražanju fosfo-stathmin.

Tumor tkivo nab-paklitaksela zdravljenih miših prikazana je bila stopnja proliferacije celic tumorja. Ki temelji izraz Ki67 intratumorska proliferacije indeks v primerjavi s kontrolno v nab-paklitakselom skupini, zdravljeni zmanjšalo za 90,7% (p = 0,001), v primerjavi s 72,6% (p = 0,004) v oksaliplatinske zdravljeni skupini in 67,7% (p = 0,003 ) v epirubicin zdravljeni skupini (slika 5A). Nab-paclitaxel povzročil večjo zavirajo učinek na tumorske celične proliferacije kot oksaliplatinom in epirubicinom.

Pregled apoptoze v tumorskih tkivih, je pokazala, da je indukcija v apoptoze indeks 7,9-krat v skupini nab-paklitaksela (p = 0,013 ), 5,7-krat v oksaliplatinu zdravljene živali (p = 0,024), in 5,2-krat v epirubicin skupini, zdravljeni (p = 0,042) glede na izhodiščno vrednost v primerjavi s kontrolno skupino (slika 5B).

Nab-paklitakselom poveča preživetje živali

v prvi študiji preživetje, je bila mediana preživetja SCID-NOD miši 24 dni v kontrolni skupini. To poveča na 86 dni po nab-paklitakselom zdravljenja (p = 0,0004 v primerjavi s kontrolno skupino, p = 0,0005 vs. oksaliplatinske skupina) in 37,5 dni po zdravljenju oksaliplatinske (p = 0,0004 v primerjavi s kontrolno skupino). Razpon preživetje skupina je bila tudi boljša po nab-paklitakselom zdravljenja (razpon: od 75 do 95 dni) v primerjavi z zdravljenjem oksaliplatinske. (razpon: od 34 do 41 dni) (slika 6A)

V drugi študiji preživetje, mediane preživetje SCID-NOD miši je bil 31 dni v kontrolni skupini. To je povečalo za 93 dni po nab-paklitakselom zdravljenja (p = 0,0007 v primerjavi z nadzorom in oksaliplatinske skupine, in p = 0,0416 v primerjavi z docetakselom skupine), da se 81 dni po zdravljenju z docetakselom (p = 0,0007 v primerjavi s kontrolami) in 40 dni zdravljenje oksaliplatin (kontrolna skupina p = 0,038 vs). Razpon preživetje skupina je bila od 75 do 96 dni po nab-paklitakselom zdravljenja v primerjavi z zdravljenjem z docetakselom (razpon: od 74 do 93 dni) in zdravljenje oksaliplatinske (razpon: od 35 do 45 dni). (slika 6B)

Pogovor

Napredovali rak želodca je smrtno nevarno in predstavlja mogočna zdravljenja izziv. Tradicionalni dvojne ali trojne citotoksične kemoterapije so omejene učinke in neželene učinke in chemoresistance [42] - [44]. Sedanja raziskava jasno kaže, da je nab-paclitaxel bistveno močnejše protitumorne učinke na želodcu raka celičnih linijah, kot se trenutno uporabljajo citotoksična sredstva oksaliplatinom in epirubicin in vitro in in vivo, merjeno s antiproliferacijskimi učinkov, apoptoze, mitotićni celične smrti, lokalizirana odzivanja protitumorsko in preživetju povezane do tumorja.

in vitro študija je pokazala, da je nab-paclitaxel visoko učinkovit pri zaviranju proliferacije celic za zdravljenje ljudi linije želodčnih celic kot oksaliplatinom in epirubicinom. SNU16 celice so bolj občutljivi na nab-paclitaxel kot NCI-N87 celic. Nekatere raziskave so pokazale, da je bila stathmin povezana z odpornostjo taksane in stathmin rasklapanje lahko poveča občutljivost za taksana [33], [36]. Testirali smo izraz stathmin in ugotovili, da ni razlike med temi tremi celičnih linij. Zanimivo je, da ko smo preučili izražanje fosfo-stathmin smo ugotovili, da je bila sposobnost nab-paclitaxela na zaviranje v proliferacije in vitro celic v istem rangu, da kot izraz fosfo-stathmin v teh treh želodčnih rakavih celic: SNU16 > AGS > NCI-N87. Tako se je zdelo sprva bilo, da fosfo-stathmin izraz korelaciji z učinkovitostjo nab-paklitakselom, kreditiranje nekaj podpore za hipotezo, da lahko fosfo-stathmin služi kot potencialno biomarker napovedati nab-paklitaksela odziv protitumorsko pri zdravljenju raka želodca.

smo izvedli študijo ksenotransplantskih NCI-N87 za oceno protitumorskega učinka nab-paklitaksela. Namesto nepričakovano, nab-paclitaxel močno zaviral NCI-N87 rast ksenogenskega tumor v primerjavi s kontrolno skupino. Te nekoliko neskladnih rezultatov nakazuje, da lahko in vivo protitumorski učinek nab-paklitaksela pri raku želodca je neodvisna od osnovnega izražanja fosfo-stathmin ali celotne stathmin. Ker smo testirali le tri celične linije, ne moremo narediti jasnih zaključkov o odnosu med stathmin ali fosfo-stathmin in nab-paklitakselom učinkovitosti pri raku želodca. Nadaljnje raziskave s stathmin potrkal odmora naj bo koristna za obravnavo tega vprašanja, in raziskati vlogo stathmin kot biomarker za učinkovitost nab-paklitakselom.

V tej študiji smo nato primerjali protitumorne učinke NAB paklitaksela z oksaliplatinom in epirubicinom na SNU16 ksenograftov lokalnih tumorjev. Nab-paclitaxel pokazala večjo protitumorsko učinkovitost kot oksaliplatinom in epirubicinom, ki je bil v skladu z in vitro rezultati celične proliferacije in proliferacije tumorskih tkiv celic in podatkov apoptoze. Čeprav je 5-fluouracil je najbolj uveljavljen single-agent drog v kemoterapevtskim želodca boj proti raku, je poročal odziv tumorja 5-fluorouracil, ki se neustrezno napovedati SCID modelov miši do točke, ko so opazili tudi ni antitumorskih učinkov [45]. Cisplatina in oksaliplatina, močnejši spodbujevalci apoptoze in tudi pogosto uporabljajo v želodčnem zdravljenju raka kemoterapevtskega, so bili izbrani bolj pogosto kot agenti za primerjavo z novimi sredstvi, ki jih je treba preskusiti, [22] [45]. Na osnovi topil paclitaxel ima več stranskih učinkov in ni dodala koristi za preživetje v primerjavi z oksaliplatinom v kliničnem zdravljenju raka želodca [22]. V naših raziskavah, oksaliplatin ni statistično razlikujejo od epirubicin. Zato smo se odločili, oksaliplatin kot temeljno sredstvo v študiji preživetje živali in ugotovili, da nab-paclitaxel povečala mediana preživetja miške okoli 40 dni po oksaliplatina, več kot dvojni učinek, kot da doseči z oksaliplatinom. Zdi se, da bolj aktivno taksan, s hitrejšo celični privzem in daljše znotrajcelični zadrževanja v primerjavi z paklitakselom na osnovi vehikla [46] Docetaxel. Smo izvedli še eno študijo preživetje primerjati protitumorne učinke nab-paklitaksela z docetakselom in ugotovila, da je bil čas, mediana preživetja nekoliko razširila po nab-paklitakselom zdravljenja (93 dni v primerjavi s 81 dni, p = 0,0416). Naši rezultati so skladni z rezultati nedavne faze II sojenja raka na dojki, ki je pokazala, da je 100 mg /m ^{2 nab-paclitaxel podaljšano srednjo skupno preživetje (razmerje ogroženosti 0,575, p = 0,008) v primerjavi z docetakselom [47]. Na podlagi naših rezultatov, nab-paclitaxel pokazala večjo učinkovitost protitumorsko v eksperimentalni raka želodca in se zdi, da predstavljajo razumno močan nov kemoterapevtsko sredstvo za klinično želodčne zdravljenju raka.}

Stathmin je pomemben mikrotubulsko-mikrotubulsko destabilizacijo fosfoprotein. Ko je stathmin fosforilira, njena aktivnost mikrotubulsko destabilizacije zmanjšal [32], [34] in to lahko izboljša občutljivost na taksan. Stathmin fosforilirajo predvsem na ciklin-odvisna proteinska kinaza (CDK) zavezujoča mestu Ser38 je v mitoze [32], zato smo se osredotočili naše izraz analiz ostankov ser38. Ugotovili smo, da je zdravljenje nab-paclitaxel povečano izražanje fosfo-stathmin in vitro in in vivo, in je povezana s mitotićnih aretacijami, jedrske drobljenja, karyopyknosis in mitotičnem celične smrti. Mitotićni celične smrti prišlo v teh celic z visoko izražanje fosfo-stathmin. Zhou et al. [33] je pokazala, da je navzdol urejena stathmin izraz po STMN1 gen rasklapanje pri jetrni karcinom dodali 7,7-kratno občutljivost na nab-paclitaxel in 2,7-kratno občutljivost paklitaksela na osnovi topil, da vendar ne občutljivost na doksorubicinom. Molekularni narava, ki sproži celično smrt v času podaljšanega mitotičnem aretaciji še vedno slabo opredeljene [17], [32]. Vretena za montažo kontrolnih točk so dolgo mislili, da imajo ključno vlogo v tem procesu [48]. V tej študiji, nab-paclitaxel inducirano fosforilacijo stathmin v želodčnih rakave celice, za katere se pričakuje, da stabilizira aparat mikrotubulov, kar lahko posledično povzroči mitotičnem aretacije in sprožilec celično smrt. Čeprav so te zgodnje in predhodni podatki, nekaj podpore za fosfo-stathmin regulacijo nab-paclitaxel protitumorsko aktivnost, so opazili in si zasluži, da je treba dodatno oceniti.

Na koncu je ta študija kaže, da single-agent nab-paclitaxel imel močnejše protitumorsko aktivnost v eksperimentalni raka želodca kot sedanji standardni kemoterapevtikov oksaliplatinom in epirubicinom, in se zdi, da je boljši taksan primerjavi z docetakselom. Ta močna protitumorsko aktivnost podpira utemeljitev za klinično ocenjevanje nab-paklitaksela kot obetaven mikrotubulov zavira sredstvo za raka želodca.

Podpora Informacije
sliki S1.
Nab-paclitaxel vodi v G2-M faze priporu v želodcu rakavih celic. (A) Histogrami prikazujejo profilov celičnega cikla AGS in NCI-N87 celic v različnih časih po nab-paklitakselom zdravljenja. Želodčne rakave celice smo gojili 24 ur in nato obdelamo s 100 nM nab-paklitaksela 12 ur ali 24 ur. Analiza celični cikel je opravil citometrije toka. Prikazani rezultati so reprezentativni dveh neodvisnih eksperimentov. (B) za distribucijo Celični ciklus za celice želodca z rakom, zdravljenih s 100 nM nab-paklitaksela. . Simbol * oznak pogoji, pod katerimi so celice razpadla
doi: 10,1371 /journal.pone.0058037.s001
(IOD)
Slika S2.
napredovanje celičnega cikla celic želodca z rakom, zdravljenih s oksaliplatina, epirubicin in docetaksela. (A) Histogrami prikazujejo profilov celičnega cikla SNU16 in AGS celic po oksaliplatin epirubicin in zdravljenje docetaksela. Želodčne rakave celice smo gojili 24 ur in nato obdelamo s 10 uM nab-paklitaksel, oksaliplatin, epirubicin in docetaksela 8 ur. Celični ciklus je opravil citometrije toka. Prikazani rezultati so reprezentativni dveh neodvisnih eksperimentov.

• Plos ONE: Obnova pokoj-1228 * Expression Zavira epitelijskih-mezenhimskih Prehod iz želodca Cancer
• Plos ONE: Mdm2 SNP309 rs2279744 polimorfizma in želodca Rak tveganja: Meta-Analysis