PLOS ONE: Paclitaxel Superior Actividad antitumoral de nanopartículas de albúmina unida en Experimental gástrico Cancer

Extracto

El cáncer gástrico es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo y carece de tratamiento altamente efectivo para la enfermedad avanzada. Nab-paclitaxel es un nuevo agente inhibidor de microtúbulos que no ha sido probado en el cáncer gástrico hasta el momento. En este estudio, se estudiaron líneas celulares de cáncer gástrico humano AGS, NCI-N87 y SNU16. Nab-paclitaxel inhibió la proliferación de las células con una IC50 de 5 nM en SNU16, 23 nM en AGS y 49 nM en células NCI-N87 después del tratamiento de 72 horas, que era inferior a la de oxaliplatino (1,05 M a 1,51 M) y epirubicina ( 0,12 M a 0,25 M). tratamiento Nab-paclitaxel aumentó la expresión de la mitótico-husillo asociado fosfo-stathmina independientemente del total básico o un nivel stathmina fosforilada, y se indujo la muerte celular mitótica como se confirma a través de aumento de la expresión de PARP escindida-y la caspasa-3. Después de un tratamiento de dos semanas nab-paclitaxel, oxaliplatino o epirubicina, la media vivo tasa de inhibición del crecimiento local del tumor fue 77, 17,2 y 21,4 por ciento, respectivamente (p = 0,002). Efectos de la terapia sobre índices proliferativos y apoptóticos tumorales se correspondían con los datos de inhibición del crecimiento tumoral, mientras que la expresión de fosfo-stathmina también aumentó en los tejidos. Hubo un aumento en la supervivencia de los animales mediana después del tratamiento nab-paclitaxel (93 días) en comparación con los controles (31 días, p = 0,0007), oxaliplatino (40 días, p = 0,0007) o a la terapia de docetaxel (81 días, p = 0,0416) . La fuerte actividad antitumoral de nab-paclitaxel en el cáncer gástrico experimental apoya dicha estrategia microtúbulos inhibidor para la aplicación clínica. Nab-paclitaxel se observaron independiente de la expresión stathmina fosforilada beneficios al inicio del estudio, poniendo en tela de juicio la consideración de uso nab-paclitaxel en el cáncer gástrico sobre la base de este biomarcador putativo

Visto:. Zhang C, N Awasthi, MA Schwarz, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior Actividad antitumoral de nanopartículas de paclitaxel unido a albúmina en Experimental cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10.1371 /journal.pone.0058037

Editor: Lu-Yu Gang, de la Universidad de Liverpool, Reino Unido

Recibido: noviembre 20, 2012; Aceptado 29 de enero de 2013; Publicado: 27 Febrero 2013

Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es el cuarto más frecuente. el cáncer y la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [1] - [3]. La mayoría de los pacientes han avanzado o enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico [4], [5]. La combinación de oxaliplatino y 5-fluorouracilo, con y sin epirubicina, se ha convertido en el régimen más utilizado en la quimioterapia de primera línea para el cáncer gástrico avanzado [6], [7]. Sin embargo, este tratamiento de combinación tiene el potencial de efectos secundarios considerables y aún lleva una eficacia limitada, mientras que el pronóstico de los pacientes sigue siendo pésimo con una supervivencia media de alrededor de 10 meses [8] - [11]. En un esfuerzo por mejorar la supervivencia y disminuir la toxicidad, la terapia molecularmente dirigida se está investigando activamente para el tratamiento del cáncer gástrico [12].

Los microtúbulos han sido considerados un objetivo de interés para algunos medicamentos contra el cáncer a causa de su papel universal en células proliferantes y su papel esencial en la mitosis [13] - [15]. Paclitaxel y docetaxel son inhibidores de microtúbulos clásicos que ejercen su actividad mediante la promoción de la polimerización de tubulina y estabilización de los microtúbulos resultantes en fase de la detención G2-M y la muerte celular mitótica [15]. la muerte celular mitótica es un modo de muerte celular que se produce específicamente durante las etapas mitóticas inducidos por agentes que daña el ADN y venenos del huso mitótico inhibidores /[16], [17]; se trata principalmente de la caspasa dependiente, pero en raras circunstancias también puede ser caspasa independiente [18]. El paclitaxel ha sido probado para los cánceres gástricos avanzados y recurrentes con una tasa de respuesta del 43% en combinación con 5-fluorouracilo y ácido folínico [9], [19]. En comparación con la tasa de respuesta de 38~45% producido por una combinación de oxaliplatino con 5-fluorouracilo y ácido folínico, el paclitaxel no dio lugar a una supervivencia superior pero causó más efectos secundarios, especialmente en pacientes de edad avanzada [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paclitaxel requiere emulsificación con disolventes para permitir la administración intravenosa que ha resultado en reacciones de hipersensibilidad y efectos secundarios potencialmente dramáticas en los pacientes [23], [24]. Nanopartícula unida a la albúmina (nab) paclitaxel es una novela, formulación de nanopartículas y soluble en agua libre de Cremophor estabilizada por albúmina de paclitaxel. Es bien tolerado sin reacciones de hipersensibilidad después de la infusión intravenosa [25]. Los estudios clínicos y experimentales demuestran que, en comparación con paclitaxel en solución, nab-paclitaxel tuvo una mayor retención del tumor, menor toxicidad [23], [26] y los efectos antitumorales más potentes sobre el cáncer de mama, de pulmón no microcítico de células de carcinoma (CPNM), de páncreas el cáncer, el melanoma y el cáncer de cabeza y cuello [27] - [31]. Sin embargo, el papel potencial de nab-paclitaxel en células de cáncer gástrico no se ha probado hasta el momento

Estatmina, una fosfoproteína desestabilizar microtúbulos, es un importante regulador de la polimerización de microtúbulos y la dinámica [32] - [34]. , y se encontró que estar relacionado con la resistencia a taxano en algunos tipos de tumores a través de la alteración de la droga de unión y retrasar la transición de fase G2-M [33], [35]. inhibición Estatmina tenía una actividad antiangiogénica y antitumoral sinérgico con taxol [36]. expresión Estatmina se ha encontrado para estar presente en una amplia variedad de cánceres humanos incluyendo el cáncer gástrico, y por lo tanto pueden representar un objetivo atractivo para la terapia del cáncer [34], [37], [38]. Jeon et al. encontró que stathmina podría servir como marcador pronóstico y una posible diana terapéutica para el cáncer gástrico [37]. La fosforilación de stathmina reduce sus efectos desestabilizadores de microtúbulos, un fenómeno que también se ha atribuido a la actividad taxano [34].

Este estudio evaluó las actividades antitumorales de nab-paclitaxel en células de cáncer gástrico humano in vitro e in vivo. Se comparó la eficacia antitumoral de nab-paclitaxel con otros agentes citotóxicos sobre el crecimiento local del tumor y la supervivencia del animal. También se midió la expresión de stathmina total y fosfo-stathmina in vitro e in vivo para evaluar su papel como marcadores predictivos de la respuesta antitumoral nab-paclitaxel.

Materiales y Métodos

Cultivo de células y reactivos

las líneas celulares de cáncer gástrico AGS humanos, NCI-N87 y SNU16 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO _{2 atmósfera. Nab-paclitaxel se adquirió de Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). El oxaliplatino se adquirió de Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Docetaxel, epirrubicina y 5-fluorouracilo se obtuvieron de una farmacia local. El reactivo de proliferación celular WST-1 se adquirió de Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

viabilidad de las células de ensayo

La viabilidad celular se evaluó por el colorimétrico WST-1 de ensayo. La medición se basa en la capacidad de células viables para escindir la sal de tetrazolio WST-1 sulfonado (4- [3- (4-yodofenil) -2- (4-nitrofenil) 2H-5-tetrazolio] -1, 3- disulfonato de benceno) por deshidrogenasas mitocondriales [39]. células de cáncer gástrico (5.000 células por pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos en medio de crecimiento normal y se trataron con NAB-paclitaxel, 5-fluorouracilo, oxaliplatino y epirubicina después de 16 horas de incubación. El intervalo de concentraciones utilizado (1 nM a 10 mM) era comparable a sus concentraciones clínicamente alcanzables. Después de la incubación adicional de 72 horas, se añadió 10 l reactivo WST-1 en cada pocillo seguido de incubación durante 2 horas. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas.

análisis del ciclo celular

análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo con fluorescente yoduro de propidio tinción (PI). Las células se cultivaron y se trataron con NAB-paclitaxel, oxaliplatino, epirubicina y docetaxel durante 8 a 24 horas. Las células se recogieron entonces y se fijaron en 75% de etanol-PBS durante la noche a -20 ° C. Las células se centrifugaron durante 5 min a 2.000 x g. El sedimento celular se resuspendió y se incubó en 0,05 mg /ml PI, 0.1% Triton X-100, y 1 mg /ml de ARNasa A en PBS durante 45 min a temperatura ambiente. Después, la suspensión se analizó en un FACScan Becton Dickinson. La proporción de células en la sub-G1, G1, S, y G2-M fases del ciclo celular se determinó por su contenido de ADN.

Inmuno análisis

células de cáncer gástrico (1 × 10 ^{5 células por cámara) se sembraron en un portaobjetos de 4 cámaras en medio de crecimiento normal. Después de 24 horas las células fueron tratadas con NAB-paclitaxel durante 16 horas y después se fijaron en 4% de paraformaldehído. Las células se incubaron con tampón de bloqueo CAS seguido de incubación de 1 hora con el anticuerpo fosfo-estatmina (1:100) y 40 minutos de incubación con Cy3 (1:200 dilución) anticuerpo secundario. Los portaobjetos se montaron utilizando solución de montaje que contiene 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). La microscopía de fluorescencia se utilizó para detectar señales de fluorescencia utilizando un microscopio Olympus IX81 equipado con una cámara Hamamatsu Orca digital (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).}

Western blot

monocapas subconfluentes de células fueron tratados con nab-paclitaxel, oxaliplatino y epirubicina. Se obtuvieron los lisados ​​celulares y los lisados ​​de tumores como se describe anteriormente [40]. Los sobrenadantes se recuperaron por centrifugación a 13.000 rpm, se midieron las concentraciones de proteína y cantidades iguales de proteína total se separaron mediante SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA) y las membranas se bloquearon durante 1 hora en TBS-T. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos: Estatmina total fosfo-estatmina (Ser38), poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1), se escindió de la caspasa-3 (todos de Cell Signaling Technology , Beverly, MA), α-tubulina y β-actina (ambos de Sigma, St. Louis, MO). Las membranas se incubaron con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Pierce Biotecnologías, Santa Cruz, CA) durante una hora. Específicas bandas se detectaron utilizando el reactivo mejorado chemoilluminescence (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) en la película autorradiográfica.

crecimiento del tumor subcutáneo estudio

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las las directrices y los protocolos aprobados de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (Permiso Número 2012 hasta 0081). Los animales se controlaron diariamente durante todo el experimento para detectar cualquier signo de malestar. ratones SCID hembra (6 a 8 semanas) se utilizaron para el modelado comparativo del crecimiento del tumor subcutáneo. células de cáncer gástrico (10 × 10 ^{6 NCI-N87 o 20 × 10 6) SNU16 células fueron inyectadas subcutáneamente en cada ratón. Los ratones se pesaron dos veces a la semana. Catorce días después de la inyección de las células tumorales, todos los ratones tenían tumores medibles (un tamaño medio de tumor de 100 a 150 mm 3). Los ratones fueron agrupados aleatoriamente (n = 6~8 por grupo) y se trataron por vía intraperitoneal con PBS (control), Nab-paclitaxel (10 mg /kg en 100 l de PBS, 2 veces por semana), oxaliplatino (5 mg /kg en 100 l de PBS, 2 veces a la semana), y epirubicina (1 mg /kg en 100 l de PBS, 2 veces a la semana) durante 14 días. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana a través de la pinza, y el volumen tumoral (V) se calculó utilizando la fórmula V = ½ [L × (W) 2], L = longitud y W = ancho. Se determinó el volumen tumoral relativo (RTV) de acuerdo con la fórmula RTV = V _{n /V 0 donde V 0 y V 1 representan el volumen tumoral en el día 0 y el día de medición siguiente, respectivamente. La tasa de inhibición del crecimiento tumoral se calculó utilizando la fórmula (1-RTVt /RTVC) x 100%, donde T y C representan el tratamiento y el grupo control. Después de la finalización del tratamiento, todos los ratones fueron sacrificados con CO2, los tumores se retiraron, se pesaron, se diseccionaron y se procesaron para histológica, inmunohistoquímica y análisis de transferencia Western.}}

El análisis inmunohistoquímico

muestras de tejido tumoral se fijaron en 4% de paraformaldehído y embebidos en parafina. intratumoral proliferación se midió mediante tinción Ki67 antígeno nuclear según el protocolo del fabricante (Abcam, Cambridge, MA). Se cortaron secciones de tejidos embebidos en parafina (5 micras), deparaffinized, rehidratada y el antígeno recuperados. Las secciones de tejido se incubaron con tampón de bloqueo CAS seguido de incubación de 1 hora con 1:200 dilución de Ki67 primario o anticuerpo fosfo-estatmina (1:200) y 40 minutos de incubación con Cy3 (1:200 dilución) anticuerpo secundario. Los portaobjetos se montaron utilizando solución de montaje que contiene 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen). La actividad de índice proliferativo y stathmina intratumoral se evaluó mediante el cálculo de las células positivas de los cinco campos de alta potencia diferentes (HPF) en una forma ciega. actividad apoptótica intratumoral se evaluó por tinción de secciones de tejido con "Kit de Detección de Apoptosis Apoptag" de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Millipore). La microscopía de fluorescencia se utilizó para detectar señales de fluorescencia utilizando un microscopio Olympus IX81 equipado con una cámara Hamamatsu Orca digital (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) y una unidad de hilado confocal ESD utilizando el software Slidebook (innovaciones de imagen inteligente, Philadelphia, PA).

supervivencia de los animales análisis

estudios de supervivencia de los animales se realizaron utilizando de 6 a 8 semanas de edad ratones SCID hembra [41]. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con SNU16 (40 × 10 ^{6) las células y el peso corporal se midió dos veces a la semana. se agruparon al azar tres semanas después de la inyección de células tumorales de ratones (n = 6 a 8 por grupo).}

En el primer estudio de supervivencia, los ratones fueron tratados por vía intraperitoneal con PBS (control), Nab-paclitaxel (10 mg /kg en 100 l de PBS, 2 veces a la semana), y oxaliplatino (5 mg /kg en 100 l de PBS, 2 veces a la semana) durante 2 semanas. En el segundo estudio de supervivencia, los ratones fueron tratados por vía intraperitoneal con PBS (control), Nab-paclitaxel (10 mg /kg en 100 l de PBS, 2 veces por semana), docetaxel (3 mg /kg en 100 l de PBS, 2 veces a la semana ) u oxaliplatino (5 mg /kg en 100 l de PBS, 2 veces a la semana) durante 2 semanas. sufrimiento de los animales se redujo la eutanasia al girar moribundo en función de criterios predefinidos, incluyendo la pérdida rápida de peso o ganancia (> 15%), la falta de comer o beber, letargo, incapacidad para permanecer en posición vertical y la falta de fuerza. supervivencia de los animales se evaluó a partir del primer día de tratamiento hasta la muerte. Se evaluó

Análisis estadístico El análisis

Supervivencia con GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA). En la celda datos in vitro de proliferación se expresan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA para la comparación grupo múltiple y la prueba t de Student para la comparación grupo individual. comparación de grupos de supervivencia se realizó mediante la prueba de log-rank dentro de un análisis del tipo de Kaplan-Meier. 0,05 fueron considerados para representar las diferencias entre grupos estadísticamente significativas

Resultados

Estatmina expresión en células de cáncer gástrico

El análisis de las células de cáncer gástrico AGS humanos, el NCI; valores de p <. N87 y SNU16 revelaron que las tres líneas expresaron stathmina. No hay diferencia de la expresión total de stathmina se encontró entre estas tres líneas celulares. La expresión de fosfo-stathmina varió entre las líneas celulares, en el siguiente orden: SNU16 > AGS > NCI-N87 células (Figura 1A).

Nab-paclitaxel inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico

Nab-paclitaxel inhibió la proliferación de células de cáncer gástrico de una manera dependiente de la dosis, y la inhibición de la proliferación celular apareció para seguir el mismo orden que la expresión de fosfo-estatmina (Figura 1B). En 100 inhibición concentración nM en la proliferación celular fue 94,5, 66,7 y 41,8 por ciento en SNU16, AGS y células NCI-N87 respectivamente. Nab-paclitaxel mostró la potencia antiproliferativa más alta con una dosis efectiva más baja se encuentra en todas las líneas celulares ensayadas 3 en comparación con el 5-fluoracilo, oxaliplatino y epirubicina. El IC _{50 de NAB-paclitaxel era 5 nM en SNU16, 23 nM en AGS y 49 nM en células NCI-N87, que era menos del 5-fluoracilo (6,46 M en SNU16, > 10 micras de AGS y 10,2 M en células NCI-N87), el oxaliplatino (1,51 M en SNU16, 1,64 M en AGS y 1,05 M en células NCI-N87) o epirubicina (0,12 M en SNU16, 0,16 M en AGS y 0,25 M en células NCI-N87) ( Figura 1C).}

Nab-paclitaxel induce la detención G2 y la muerte celular mitótico in vitro

Para evaluar el mecanismo subyacente de la inhibición del crecimiento por nab-paclitaxel, se analizó el perfil del ciclo celular. Como se muestra en la Figura 2A, NAB-paclitaxel (100 nM) dio como resultado la detención del ciclo celular en G2-M en las células SNU16. El porcentaje de células positivas con yoduro de propidio en la fase G2-M aumentó 35,6 a 71,6 después de 100 nM tratamiento nab-paclitaxel durante 12 horas. Cambios similares se produjeron en células AGS y NCI-N87 con nab-paclitaxel y docetaxel tratamiento pero no con oxaliplatino y epirubicina tratamiento (figuras S1 y S2).

Efecto de la NAB-paclitaxel sobre la muerte celular mitótico, la expresión de fosfo -stathmin y las proteínas relacionadas con la apoptosis se midió por immunocystochemistry y Western blot. tratamiento Nab-paclitaxel causó la interrupción de los microtúbulos y la detención de la mitosis en células de cáncer gástrico como se observa por la fragmentación núcleo y de cariopicnosis (Figura 2B). La expresión de fosfo-stathmina se aumentó después del tratamiento nab-paclitaxel, y una mayor expresión de fosfo-stathmina se asoció con un mayor grado de detenciones mitóticos, de fragmentación de núcleo o de cariopicnosis, y la muerte celular (Figura 2B y 2C). la fragmentación nuclear y de cariopicnosis se produjo en 16,7% de las células con baja expresión de fosfo-stathmina pero en 95,7% de las células con alta expresión de fosfo-estatmina (r = 0,672, p < 0,001). También hubo pruebas para el tiempo de aumento de la expresión dependiente de fosfo-stathmina mediante tratamiento nab-paclitaxel (Figura 2D).

Hemos examinado si la muerte celular mitótica inducida por nab-paclitaxel podría en parte estar correlacionada con la inducción de la apoptosis . Evaluación de la PARP-1 de escisión y la caspasa-3 escisión como marcadores de la inducción de la apoptosis reveló que en células de cáncer gástrico nab-paclitaxel, oxaliplatino y epirubicina tratamiento causó un aumento en la expresión de tanto escindido PARP-1 y la caspasa-3. Esta expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis apareció luego del tratamiento con nab-paclitaxel en comparación con oxaliplatino o tratamientos epirubicina (Figura 2E).

Nab-paclitaxel inhibe el crecimiento de xenoinjertos de cáncer gástrico
antitumoral

En vivo efectos de NAB-paclitaxel se evaluaron en un modelo de xenoinjerto murino utilizando las células SNU16. Nab-paclitaxel terapia con 10 mg /kg dos veces a la semana durante dos semanas fue bien tolerado y sin signos evidentes de toxicidad a juzgar por el peso del ratón y evaluación diaria. Después de un tratamiento de dos semanas, Nab-paclitaxel terapia resultó en la inhibición del crecimiento tumoral estadísticamente significativa (p = 0,0004) que era mayor que los de oxaliplatino (p = 0,0361) y epirubicina (p = 0,032) en comparación con el control del vehículo, respectivamente (Figura 3A). La tasa de inhibición del crecimiento tumoral después de un tratamiento de 2 semanas con NAB-paclitaxel, oxaliplatino y epirubicina fue de 77, 17,2 y 21,4 por ciento (p = 0,002), respectivamente. Único tratamiento nab-paclitaxel creó una reducción del tamaño de las lesiones subcutáneas en comparación con su tamaño del tumor preestablecido. La media de peso del tumor se redujo significativamente por el tratamiento nab-paclitaxel (0,154 g ± 0,075 vs 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037) de tratamiento, pero no por oxaliplatino (0,408 ± 0,12 g) o epirubicina (0,46 ± 0,172 g) en comparación con los vehículos control, respectivamente (Figura 3A). También se evaluaron los efectos antitumorales de nab-paclitaxel en NCI-N87 tumores locales xenoinjerto de ratón. Después de dos semanas de tratamiento, la terapia nab-paclitaxel resultó en una inhibición significativa del volumen del tumor (p = 0,0023) (Figura 3B) y la tasa de inhibición del crecimiento del tumor fue de 72,8 por ciento. El peso medio del tumor en el grupo de tratamiento nab-paclitaxel fue significativamente más bajo que en el grupo de vehículo (0,093 ± 0,026 g vs. 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (Figura 3B). No se observó ningún cambio significativo en el peso corporal del ratón en cualquiera de los grupos nab-paclitaxel, oxaliplatino o terapia epirubicina.

Nab-paclitaxel induce la muerte celular mitótico en vivo

Los mecanismos de la actividad antitumoral in vivo de nab-paclitaxel se examina más adelante en los tejidos tumorales obtenidas a partir de SNU16 y NCI-N87 xenoinjertos. Se observó un aumento significativo en la expresión de fosfo-stathmina en SNU16 (Figura 4A) y NCI-N87 (Figura 4B) xenoinjertos de tumores con el tratamiento de nab-paclitaxel por tanto blot inmunohistoquímico y análisis por Western.

Tumor tejidos de ratones tratados nab-paclitaxel muestra una tasa de disminución de la proliferación de células tumorales. Un índice de proliferación intratumoral basada en la expresión de Ki67 disminuyó en un 90,7% (p = 0,001) en comparación con los controles en el grupo tratado nab-paclitaxel, en comparación con 72,6% (p = 0,004) en el grupo tratado oxaliplatino y 67,7% (p = 0,003 ) en el grupo tratado epirubicina (Figura 5A). Nab-paclitaxel causó un efecto de inhibición más fuerte sobre la proliferación de células tumorales de oxaliplatino y epirubicina.

Examen de la apoptosis en los tejidos tumorales reveló que la inducción de apoptosis en el índice era 7,9 veces mayor en el grupo nab-paclitaxel (p = 0,013 ), 5,7 veces mayor en los animales tratados con oxaliplatino (p = 0,024), y 5,2 veces en el grupo tratado epirubicina (p = 0,042) sobre la línea de base en el grupo de control (Figura 5B).

Nab-paclitaxel aumenta la supervivencia de los animales

en el primer estudio de supervivencia, la supervivencia media de los ratones SCID-NOD fue de 24 días en el grupo de control. Esto aumentó a 86 días después del tratamiento nab-paclitaxel (p = 0,0004 frente al grupo control, p = 0,0005 vs. grupo oxaliplatino) y 37,5 días después de tratamiento con oxaliplatino (p = 0,0004 frente al grupo control). El rango de la supervivencia del grupo también fue superior después del tratamiento nab-paclitaxel (rango: 75 a 95 días), en comparación con el tratamiento con oxaliplatino. (Rango: 34 a 41 días) (Figura 6A)

En el segundo estudio de supervivencia, la mediana supervivencia de ratones SCID-NOD fue de 31 días en el grupo de control. Esto aumentó a 93 días después del tratamiento nab-paclitaxel (p = 0,0007 frente al control y el grupo de oxaliplatino, y p = 0,0416 vs. grupo de docetaxel), a 81 días después del tratamiento con docetaxel (p = 0,0007) en comparación con los controles y con 40 días de tratamiento con oxaliplatino (grupo de control p = 0,038 vs.). El rango de la supervivencia del grupo fue de 75 a 96 días después del tratamiento nab-paclitaxel en comparación con el tratamiento con docetaxel (rango: 74 a 93 días) y tratamiento con oxaliplatino (rango: 35 a 45 días). (Figura 6B)

Discusión

cáncer gástrico avanzado es peligrosa para la vida y representa un desafío formidable tratamiento. Los regímenes tradicionales de quimioterapia citotóxica dobles o triples tienen efectos limitados y pueden causar efectos secundarios y la quimio-resistencia [42] - [44]. El presente estudio demuestra claramente que nab-paclitaxel tiene efectos significativamente más fuertes antitumorales en las líneas celulares de cáncer gástrico que los agentes citotóxicos utilizados actualmente oxaliplatino y epirubicina in vitro e in vivo, medidos por los efectos antiproliferativos, la apoptosis, la muerte celular mitótica, respuesta antitumoral localizada y de supervivencia relacionada a la carga tumoral.

estudio in vitro demostró que nab-paclitaxel es muy potente en la inhibición de la proliferación de células de líneas de células gástricas humanas que oxaliplatino y epirubicina. SNU16 células son más sensibles a nab-paclitaxel que las células NCI-N87. Algunos estudios encontraron que stathmina se correlacionó con la resistencia taxano y desmontables stathmina puede aumentar la sensibilidad a la taxano [33], [36]. Hemos probado la expresión de stathmina y no se encontraron diferencias entre estas tres líneas celulares. Curiosamente, cuando se analizó la expresión de fosfo-stathmina, se encontró que la capacidad de NAB-paclitaxel para inhibir la proliferación celular in vitro estaba en el mismo orden de rango que la expresión de fosfo-stathmina en estas tres células de cáncer gástrico: SNU16 > AGS > NCI-N87. Por lo tanto, apareció inicialmente que la expresión de fosfo-stathmina se correlacionó con la eficacia nab-paclitaxel, dando algo de apoyo a una hipótesis de que la fosfo-stathmina puede servir como un biomarcador potencial para predecir la respuesta antitumoral nab-paclitaxel en el tratamiento del cáncer gástrico.

Se realizó un estudio de xenoinjerto NCI-N87 para evaluar el efecto antitumoral de nab-paclitaxel. En lugar de forma inesperada, nab-paclitaxel inhibió significativamente el crecimiento de tumores de xenoinjertos NCI-N87 en comparación con el grupo control. Estos resultados un tanto discrepantes parecen sugerir que el efecto antitumoral in vivo de NAB-paclitaxel en el cáncer gástrico puede ser independiente de la expresión de línea de base de fosfo-stathmina o stathmina total. Dado que se probaron sólo tres líneas celulares, no podemos llegar a una conclusión definitiva acerca de la relación entre stathmina o fosfo-stathmina y eficacia nab-paclitaxel en el cáncer gástrico. La investigación adicional con Estatmina golpeado-outs debe ser útil para abordar esta cuestión e investigar el papel de stathmina como biomarcador para la eficacia nab-paclitaxel.

En este estudio, se comparó a continuación los efectos antitumorales de paclitaxel nab con oxaliplatino y epirubicina en los tumores de xenoinjertos locales SNU16. Nab-paclitaxel mostró más fuerte eficacia antitumoral de oxaliplatino y epirubicina que era consistente con los resultados in vitro de proliferación celular y la proliferación de células de tejido tumoral y los datos de la apoptosis. Aunque el 5-fluoracilo es el fármaco de un solo agente más establecida en el tratamiento del cáncer gástrico quimioterapéutico, se informa de la respuesta del tumor de 5-fluorouracilo a predecir de manera inadecuada en modelos de ratón SCID hasta el punto donde se han observado incluso sin efectos antitumorales [45]. Cisplatino y oxaliplatino, más potentes inductores de apoptosis y también se utiliza con frecuencia en el tratamiento quimioterapéutico del cáncer gástrico, se han elegido con más frecuencia como agentes para fines de comparación con los nuevos agentes que se van a probar [22], [45]. paclitaxel en solución tiene más efectos secundarios y no agregó beneficios de supervivencia en comparación con oxaliplatino en el tratamiento clínico para el cáncer gástrico [22]. En nuestros estudios, el oxaliplatino no difirió estadísticamente de epirubicina. Por lo tanto, elegimos oxaliplatino como agente de la línea de base en el estudio de supervivencia de los animales y se encontró que Nab-paclitaxel aumentó la mediana de supervivencia del ratón en alrededor de 40 días más de oxaliplatino, un efecto más del doble que el alcanzado por oxaliplatino. Docetaxel parece ser el más activo de taxano, con más captación celular rápida y la retención intracelular más largo en comparación con base de disolvente paclitaxel [46]. Se realizó otro estudio para comparar la supervivencia efectos antitumorales de nab-paclitaxel con docetaxel y encontramos que el tiempo medio de supervivencia fue ligeramente extendida después del tratamiento nab-paclitaxel (93 días frente a 81 días, p = 0,0416). Nuestros resultados fueron consistentes con los resultados de un reciente ensayo fase II del cáncer de mama, que mostraron que 100 mg /m ^{2 nab-paclitaxel tuvieron una supervivencia prolongada mediana global (cociente de riesgos instantáneos 0,575, p = 0,008) en comparación con docetaxel [47]. En base a los resultados, nab-paclitaxel mostró más fuerte eficacia antitumoral en el cáncer gástrico experimental y parece representar un nuevo agente quimioterapéutico razonablemente potente para el tratamiento del cáncer gástrico clínica.}

Estatmina es un importante microtúbulos fosfoproteína desestabilizar microtúbulos. Cuando se fosforila stathmina, su actividad microtúbulos desestabilizar disminuyó [32], [34] y esto puede mejorar la sensibilidad a taxano. Estatmina es fosforilada principalmente de la ciclina dependiente de la proteína quinasa (CDK) sitio de unión Ser38 en la mitosis [32], por lo que nos centramos nuestro análisis de la expresión en el residuo Ser38. Se encontró que el tratamiento nab-paclitaxel aumento de la expresión de fosfo-stathmina in vitro e in vivo y se correlacionó con la detención de la mitosis, la fragmentación nuclear, cariopicnosis y la muerte celular mitótico. la muerte celular mitótico se produjo en las células con alta expresión de fosfo-stathmina. Zhou et al. [33] encontró que la expresión de la estatmina regulada hacia abajo después de STMN1 knockdown de genes en células de carcinoma hepático añadió 7,7 veces la sensibilidad a Nab-paclitaxel y sensibilidad de 2,7 veces paclitaxel a base de solvente a pero no la sensibilidad a la doxorubicina. La naturaleza molecular que desencadena la muerte celular durante la detención de la mitosis prolongada sigue siendo mal definidos [17], [32]. los puestos de control de ensamblaje del huso Desde hace tiempo se cree que desempeñan un papel fundamental en este proceso [48]. En este estudio, nab-paclitaxel induce la fosforilación de stathmina en células de cáncer gástrico, que se espera para estabilizar el aparato de microtúbulos, que a su vez puede causar detenciones mitótico y la muerte celular gatillo. Aunque estos son los primeros y los datos preliminares, una cierta ayuda para fosfo-stathmina regulación de la actividad antitumoral nab-paclitaxel se ha observado y merece ser evaluada.

En conclusión, el presente estudio demuestra que un solo fármaco nab-paclitaxel tenía actividad antitumoral más fuerte en el cáncer gástrico experimental que el actual estándar oxaliplatino agentes quimioterapéuticos y epirrubicina, y parecía ser el taxano superior en comparación con docetaxel. Esta fuerte actividad antitumoral es compatible con los fundamentos de la evaluación clínica de nab-paclitaxel como agente prometedor inhibidor de microtúbulos en el cáncer gástrico.

Apoyo a la Información
Figura S1.
Nab-paclitaxel conduce a la detención en la fase G2-M en células de cáncer gástrico. Los histogramas (A) muestran perfiles del ciclo celular de las células AGS y NCI-N87 en diferentes momentos después del tratamiento nab-paclitaxel. células de cáncer gástrico se cultivaron durante 24 horas y después se trató con 100 nM nab-paclitaxel durante 12 horas o 24 horas. El análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo. Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos independientes. (B) la distribución del ciclo celular para células de cáncer gástrico tratados con 100 nM nab-paclitaxel. . * Símbolo condiciones marcas bajo las cuales se habían desintegrado células
doi: 10.1371 /journal.pone.0058037.s001 gratis (TIF)
figura S2.
progresión del ciclo celular de células de cáncer gástrico tratados por oxaliplatino, epirubicina y docetaxel. Los histogramas (A) muestran perfiles del ciclo celular de las células AGS SNU16 y después de oxaliplatino, epirubicina y el tratamiento con docetaxel. células de cáncer gástrico se cultivaron durante 24 horas y después se trató con 10 mM nab-paclitaxel, oxaliplatino, epirubicina y docetaxel durante 8 horas. ciclo celular se realizó por citometría de flujo. Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos independientes.

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