PLOS ONE: Paclitaxel Superior antitumoral Atividade de nanopartículas de albumina-Bound in Experimental gástrica Cancer

Abstract

O câncer gástrico é a segunda causa comum de morte relacionada com câncer em todo o mundo e carece de tratamento altamente eficaz para a doença avançada. Nab-paclitaxel é um novo agente citotóxico microtúbulos-inibitória que não tenha sido testado em cancro gástrico como de ainda. Neste estudo, as linhas celulares de cancro gástrico humano AGS, NCI-N87 e SNU16 foram estudados. Nab-paclitaxel inibiu a proliferação celular com um IC50 de 5 nM em SNU16, 23 nM em AGS e 49 nM em células NCI-N87 após o tratamento de 72 horas, que era menor do que a oxaliplatina (1,05 uM a 1,51 uM) e epirrubicina ( 0,12 uM a 0,25 uM). tratamento nab-paclitaxel aumento da expressão do fuso mitótico-associado fosfo-stathmin independentemente do nível stathmin fosforilada total de linha de base ou, e morte celular induzida por mitótico como confirmado através do aumento da expressão de PARP clivada-e caspase-3. Depois de duas semanas de nab-paclitaxel, oxaliplatina ou epirubicina tratamento, a média in vivo taxa de inibição do crescimento local do tumor foi de 77, 17,2 e 21,4 por cento, respectivamente (p = 0,002). Efeitos da terapia sobre índices apoptóticos e proliferativas tumorais correspondeu com os dados de inibição do crescimento do tumor, enquanto que a expressão de fosfo-stathmin também aumentou nos tecidos. Houve um aumento na sobrevivência dos animais média após tratamento nab-paclitaxel (93 dias), em comparação com controlos (31 dias, p = 0,0007), a oxaliplatina (40 dias, p = 0,0007) ou para o tratamento com docetaxel (81 dias, p = 0,0416) . A forte actividade antitumoral de nab-paclitaxel em câncer gástrico experimental suporta essa estratégia microtúbulos-inibitória para aplicação clínica. Nab-paclitaxel benefícios foram observados independente da expressão stathmin fosforilada na linha de base, colocando em causa a consideração da utilização nab-paclitaxel em câncer gástrico com base neste biomarcador putativo

Citation:. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior antitumoral Atividade de nanopartículas de paclitaxel-albumina Bound in Experimental câncer gástrico. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10.1371 /journal.pone.0058037

editor: Lu-Gang Yu, da Universidade de Liverpool, Reino Unido

Recebido: 20 de novembro de 2012; Aceito: 29 de janeiro de 2013; Publicação: 27 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o quarto mais prevalente. câncer e a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1] - [3]. A maioria dos pacientes têm avançado ou doença metastática no momento do diagnóstico [4], [5]. A combinação de oxaliplatina e 5-f luorouracilo, com e sem epirubicina, tornou-se o regime mais amplamente usado em quimioterapia de primeira linha para o cancro gástrico avançado [6], [7]. No entanto, este tratamento de combinação tem o potencial para efeitos secundários consideráveis ​​e ainda carrega eficácia limitada, enquanto que o prognóstico dos pacientes permanece sombrio, com uma sobrevida média de cerca de 10 meses [8] - [11]. Num esforço para melhorar a sobrevivência e para diminuir a toxicidade, a terapia orientada molecularmente está a ser activamente investigados para o tratamento de cancro gástrico [12].

Os microtúbulos têm sido desde há muito considerada um alvo de interesse para alguns fármacos anti-cancerígenos, porque de o seu papel universal em células em proliferação e o seu papel essencial na mitose [13] - [15]. O paclitaxel e o docetaxel são inibidores de microtúbulos clássicos que exercem a sua actividade através da promoção da polimerização da tubulina e estabilização de microtúbulos, resultando em prisão fase G2-M e morte celular mitótico [15]. morte celular mitótica é um modo de morte celular que ocorre durante as fases mitóticas especificamente induzidas por agentes prejudiciais de ADN e venenos do fuso /inibidores mitóticos [16], [17]; é principalmente caspase dependentes, mas em raras circunstâncias também pode ser caspase independente [18]. O paclitaxel tem sido testado para cancros gástricos avançados e recorrente com uma taxa de resposta de 43%, em combinação com 5-fluorouracilo e ácido folínico [9], [19]. Em comparação com a taxa de resposta de 38~45% produziu por uma combinação de oxaliplatina com 5-fluorouracilo e ácido folínico, o paclitaxel não resultou em sobrevivência superior, mas causou mais efeitos secundários, especialmente em pacientes idosos [9], [20] - [ ,,,0],22]. O paclitaxel necessária emulsificação com solventes para permitir a administração intravenosa, que resultou em reacções de hipersensibilidade e os efeitos colaterais potencialmente dramáticas em pacientes [23], [24]. Nanopartículas de albumina-bound (NAB) paclitaxel é um romance, formulação de nanopartículas e solúvel em água livre de Cremophor estabilizou-albumina de paclitaxel. É bem tolerada, sem reações de hipersensibilidade após a infusão intravenosa [25]. Os estudos clínicos e experimentais demonstraram que, em comparação com o paclitaxel à base de solvente, nab-paclitaxel tiveram uma maior retenção do tumor, toxicidade mais baixa [23], [26] e efeitos antitumorais mais potentes sobre o cancro da mama, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), pancreático câncer, melanoma e câncer de cabeça e pescoço [27] - [31]. No entanto, o papel potencial de nab-paclitaxel em células de cancro gástrico não é testado como ainda

stathmin, uma fosfoproteína desestabilizadores do microtúbulo, é um importante regulador da polimerização de microtúbulos e dinâmica [32] - [34]. , e verificou-se estar relacionada com a resistência ao taxano, em alguns tipos de tumores através da alteração da droga e retardar ligação de transição de fase G2-M [33], [35]. inibição stathmin tinha uma actividade antiangiogénica e antitumoral sinérgica com taxol [36]. stathmin expressão foi encontrado para estar presente numa grande variedade de cancros humanos incluindo cancro gástrico, e, portanto, podem representar um alvo atraente para a terapia do cancro [34], [37], [38]. Jeon et al. descobriram que stathmin pode servir como um marcador de prognóstico e um potencial alvo terapêutico para o cancro gástrico [37]. Fosforilação de stathmin reduz seus microtúbulos efeitos desestabilizadores, um fenómeno que também tem sido atribuída à atividade taxano [34].

Este estudo avaliou as atividades antitumorais de nab-paclitaxel em células cancerosas gástricas humanas in vitro e in vivo. Comparou-se a eficácia antitumor de nab-paclitaxel com outros agentes citotóxicos sobre o crescimento local do tumor e a sobrevivência dos animais. Também medimos a expressão de stathmin total e fosfo-stathmin in vitro e in vivo para avaliar o seu papel como marcadores preditivos da resposta antitumoral nab-paclitaxel.

cultura celular Materiais e Métodos Comprar e reagentes

os gástricas linhas celulares de cancro humano AGS, NCI-N87 e SNU16 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO _{2 atmosfera. Nab-paclitaxel foi adquirido da Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). Oxaliplatina foi comprado de Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). O docetaxel, epirrubicina e 5-fluorouracilo foi obtido numa farmácia local. O reagente de proliferação celular WST-1 foi adquirido a partir de Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi avaliada através do ensaio colorimétrico de WST-1. A medida é baseada na capacidade das células viáveis ​​para clivar o sal de tetrazólio WST-1 sulfonado (4- [3- (4-iodofenil) -2- (4-nitrofenil) -2H-5-tetrazolio] -1, 3- dissulfonato de benzeno) por desidrogenases mitocondriais [39]. células de cancro gástrico (5.000 células por cavidade) foram plaqueadas numa placa de 96 poços em meio de crescimento normal e foram tratados com nab-paclitaxel, 5- fluorouracilo, epirrubicina e oxaliplatina após 16 horas de incubação. A gama de concentrações utilizada (1 nM a 10? M) foi comparável às suas concentrações clinicamente praticáveis. Após incubação adicional de 72 horas, 10 ul de reagente WST-1 foram adicionados em cada poço seguido por incubação durante 2 horas. A absorvância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas.

análise do ciclo celular

análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo com iodeto de propídio fluorescente (PI) coloração. As células foram cultivadas e tratadas com nab-paclitaxel, oxaliplatina, epirrubicina e docetaxel durante 8 a 24 horas. As células foram então recolhidas e fixadas em 75% de etanol-PBS durante a noite a -20 ° C. As células foram centrifugadas durante 5 min a 2000 x g. O sedimento celular foi ressuspenso e incubadas em 0,05 mg /ml de PI, 0,1% de Triton X-100, e 1 mg /ml de ARNase A em PBS durante 45 min à temperatura ambiente. A suspensão foi, em seguida, analisadas num Becton Dickinson FACScan. A proporção de células da sub-G1, G1, S, e G2-M fases do ciclo celular foi determinada pelo seu teor de ADN.

Análise imunocitoquímica

células de cancro gástrico (1 × 10 ^{5 células por câmara) foram plaqueadas numa corrediça 4-câmara em meio de crescimento regular. Após 24 horas as células foram tratadas com nab-paclitaxel durante 16 horas e, em seguida, fixado em paraformaldeído a 4%. As células foram incubadas com tampão de bloqueio CAS seguido por 1 hora de incubação com anticorpo fosfo-stathmin (1:100) e 40 minutos de incubação com Cy3 (1:200 diluição) anticorpo secundário. As lâminas foram montadas utilizando solução de montagem contendo 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). microscopia de fluorescência foi usado para detectar sinais fluorescentes usando o microscópio IX81 Olympus equipado com uma câmera Hamamatsu Orca digitais (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).}

análise de Western blot

monocamadas Sub-confluentes de células foram tratados com nab-paclitaxel, oxaliplatina e epirrubicina. Os lisados ​​celulares e lisados ​​de tumor foram obtidas como descrito anteriormente [40]. Os sobrenadantes foram recuperados por centrifugação a 13000 rpm, as concentrações da proteína foram medidas e quantidades iguais de proteína total foram separadas por SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA) e as membranas foram bloqueadas durante 1 hora em TBS-T. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os seguintes anticorpos: stathmin total, a fosfo-stathmin (ser38), poli clivado (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1), caspase-3 (todos a partir de Cell Signaling Technology , Beverly, MA), α-tubulina e β-actina (ambos da Sigma, St. Louis, MO). As membranas foram depois incubadas com os anticorpos secundários conjugados com HRP (Pierce correspondentes Biotechnologies, Santa Cruz, CA), durante uma hora. As bandas específicas foram detectadas usando o reagente de quimioluminescência aumentada (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) em filme de auto-radiografia.

crescimento tumor subcutâneo estudo

Todas as experiências com animais foram efectuados em conformidade com as diretrizes e protocolos aprovados da Universidade do Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional animal Care e Use Committee (Permissão Número 2.012-0.081). Os animais foram monitorados diariamente ao longo da experiência para qualquer sinal de perigo. ratinhos SCID fêmea (6 a 8 semanas) foram usadas para a modelagem comparativa do crescimento do tumor subcutâneo. células cancerosas gástricas (10 × 10 ^{6 NCI-N87 ou 20 × 10 6 SNU16 células) foram injectados por via subcutânea em cada rato. Os murganhos foram pesados ​​duas vezes por semana. Catorze dias após a injecção das células de tumor, todos os ratinhos tinham tumores mensuráveis ​​(um tamanho médio do tumor de 100 mm a 150 mm 3). Os ratinhos foram então agrupados aleatoriamente (n = 6~8 por grupo) e tratados por via intraperitoneal com PBS (controlo), nab-paclitaxel (10 mg /kg em 100 ul de PBS, 2 vezes por semana), oxaliplatina (5 mg /kg em 100 ul de PBS, 2 vezes por semana), e epirrubicina (1 mg /kg em 100 ul de PBS, 2 vezes por semana) durante 14 dias. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana por meio de compasso de calibre, e o volume do tumor (V) foi calculado usando a fórmula V = ½ [L x (W) 2], L = comprimento e W = largura. o volume relativo do tumor (RTV) foi determinada de acordo com a fórmula RTV = V _{N /V 0 em que V 0 e V 1 representam o volume do tumor no dia 0 e no dia de medição seguinte, respectivamente. A taxa de inibição do crescimento do tumor foi calculada pela utilização da fórmula (1-RTVt /RTVC) x 100% onde T e C representam o tratamento e controlo de grupo. Após conclusão do tratamento, todos os ratos foram sacrificados com CO2, os tumores foram removidos, pesados, dissecados e processados ​​para análise histológica, imuno-histoquímica e análise de Western blot.}}

A análise imunohistoquímica

amostras de tecido de tumor foram fixadas em paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina. intratumoral proliferação foi medida por coloração de Ki67 antigénio nuclear de acordo com o protocolo do fabricante (Abcam, Cambridge, MA). secções de tecido embebidas em parafina foram cortados (5 uM), desparafinados, re-hidratados e antigénio recuperado. As secções de tecido foram incubadas com tampão de bloqueio CAS seguido por 1 hora de incubação com 1:200 diluição de Ki67 primário ou anticorpo fosfo-stathmin (1:200) e 40 minutos de incubação com Cy3 (1:200 diluição) anticorpo secundário. As lâminas foram montadas utilizando solução de montagem contendo 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Invitrogen). Intratumoral proliferativa índice de atividade e stathmin foi avaliada através do cálculo das células positivas em cinco campos de alta potência diferentes (HPF) de uma maneira cega. actividade apoptótica intratumoral foi avaliada por coloração de secções de tecido com "Apoptag Apoptosis Detection Kit" de acordo com as instruções do fabricante (Millipore). microscopia de fluorescência foi usado para detectar sinais fluorescentes usando o microscópio IX81 Olympus equipado com uma câmera Hamamatsu Orca digitais (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) e uma unidade de fiação confocal DSU usando software Slidebook (Inovações de imagem inteligente, Philadelphia, PA).

sobrevivência animal análise

estudos de sobrevivência dos animais foram realizados utilizando ratinhos SCID fêmea com 6 a 8 semanas de idade [41]. Os ratos foram injectados intraperitonealmente com SNU16 (40 × 10 ^{6) células e peso corporal foi medido duas vezes por semana. Três semanas após a injecção das células tumorais os ratinhos foram agrupados aleatoriamente (n = 6-8 por grupo).}

No primeiro estudo de sobrevivência, os ratinhos foram tratados intraperitonealmente com PBS (controlo), nab-paclitaxel (10 mg /kg em 100 ul de PBS, 2 vezes por semana) e oxaliplatina (5 mg /kg em 100 ul de PBS, 2 vezes por semana) durante 2 semanas. No segundo estudo de sobrevivência, os ratinhos foram tratados intraperitonealmente com PBS (controlo), nab-paclitaxel (10 mg /kg em 100 ul de PBS, 2 vezes por semana), docetaxel (3 mg /kg em 100 ul de PBS, 2 vezes por semana ) ou oxaliplatina (5 mg /kg em 100 ul de PBS, 2 vezes por semana) durante 2 semanas. O sofrimento dos animais foi reduzido em eutanásia quando virar moribunda de acordo com critérios pré-definidos, incluindo a rápida perda de peso ou ganho (> 15%), a incapacidade de comer ou beber, letargia, incapacidade de se manter na posição vertical e falta de força. sobrevida dos animais foi avaliada a partir do primeiro dia de tratamento até a morte.

A análise estatística
análise

A sobrevivência foi avaliada com GraphPad Prism 5 Software (GraphPad Software, San Diego, CA). Na célula in vitro de proliferação de dados são expressos como média ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada por ANOVA para comparação grupo múltiplo e teste t de Student para a comparação grupo individual. comparação de grupos de sobrevivência foi realizada através do teste log-rank dentro de uma análise do tipo Kaplan-Meier. Os valores de p < 0,05 foram considerados para representar diferenças entre os grupos estatisticamente significativas

Resultados

expressão stathmin em células cancerosas gástricas

A análise dos gástricas células cancerosas AGS humanos, NCI-. N87 e SNU16 revelaram que todas as três linhas de expresso stathmin. Não foi encontrada diferença de expressão total de stathmin entre essas três linhas celulares. A expressão de fosfo-stathmin variou entre linhas de células, na seguinte ordem: SNU16 > AGS > NCI-N87 células (Figura 1A).

Nab-paclitaxel inibe a proliferação de células de cancro gástrico

Nab-paclitaxel inibiu a proliferação de células de cancro gástrico de uma forma dependente da dose, e a inibição da proliferação celular apareceu a seguir pela mesma ordem que a expressão de fosfo-stathmin (Figura 1B). A 100 nM de concentração de inibição da proliferação celular foi de 94,5, 66,7 e 41,8 por cento em SNU16, AGS e células NCI-N87, respectivamente. Nab-paclitaxel apresentou a maior potência antiproliferativa com uma dose eficaz mais baixa encontrada em todas as linhas celulares testadas 3 em comparação com 5-fluouracil, oxaliplatina e epirrubicina. A IC _{50 de nab-paclitaxel foi de 5 nM em SNU16, 23 nM em AGS e 49 nM em células NCI-N87, que foi menos de 5-fluouracil (6,46 uM em SNU16, > 10 uM em AGS e 10,2 uM em células NCI-N87), oxaliplatina (1,51 uM em SNU16, 1,64 uM em AGS e 1,05 uM em células NCI-N87) ou epirubicina (0,12 uM em SNU16, 0,16 uM em AGS e 0,25 uM em células NCI-N87) ( Figura 1C).}

Nab-paclitaxel induz a paragem G2 e morte celular in vitro mitótico

Para avaliar o mecanismo subjacente da inibição do crescimento por nab-paclitaxel, o perfil do ciclo celular foi analisada. Como mostrado na Figura 2A, nab-paclitaxel (100 nM) resultou na paragem do ciclo celular G2-M em SNU16 células. A percentagem de células positivas de iodeto de propidio na fase G2-M aumentou 35,6-71,6 após 100 nM tratamento nab-paclitaxel durante 12 horas. Mudanças semelhantes ocorreram em células AGS e NCI-N87 com nab-paclitaxel e o tratamento com docetaxel, mas não com oxaliplatina e tratamento epirubicina (Figuras S1 e S2).

Efeito de nab-paclitaxel sobre a morte das células mitóticas, a expressão de fosfo -stathmin e proteínas relacionadas com a apoptose foi medida por immunocystochemistry e Western blot. tratamento Nab-paclitaxel causaram o rompimento dos microtúbulos e as detenções de mitose em células cancerosas gástricas como observado pela fragmentação núcleo e cariopicnose (Figura 2B). A expressão de fosfo-stathmin foi aumentada após o tratamento nab-paclitaxel, e maior expressão de fosfo-stathmin foi associado com um maior grau de detenções mitóticas, fragmentação ou núcleo de cariopicnose, e morte celular (Figura 2B e 2C). A fragmentação nuclear e de cariopicnose ocorreu em 16,7% das células com baixa expressão de fosfo-stathmin mas em 95,7% de células com elevada expressão de fosfo-stathmin (r = 0,672, p < 0,001). Há também evidência de tempo aumento da expressão de fosfo-dependente stathmin por tratamento nab-paclitaxel (Figura 2D).

Examinámos se a morte celular induzida mitótico por nab-paclitaxel pode em parte ser correlacionada com a indução de apoptose . Avaliação de PARP-1 e a clivagem de caspase-3 clivada como marcadores de indução de apoptose revelaram que em células de cancro gástrico nab-paclitaxel, oxaliplatina e epirrubicina tratamento causou um aumento na expressão de ambos clivados PARP-1 e a caspase-3. Esta expressão de proteínas relacionadas com a apoptose após o tratamento aparentemente mais elevada nab-paclitaxel em comparação com tratamentos de oxaliplatina ou epirubicina (Figura 2E).

Nab-paclitaxel inibe o crescimento de xenoenxertos de cancro gástrico

in vivo antitumoral efeitos de nab-paclitaxel foram avaliadas num modelo de xenoenxerto de murinos utilizando SNU16 células. Nab-paclitaxel na terapia de 10 mg /kg duas vezes por semana durante duas semanas foi bem tolerada, sem sinais óbvios de toxicidade, como avaliado por peso do rato e avaliação diária. Depois de um tratamento de duas semanas, nab-paclitaxel terapia resultou na inibição do crescimento tumoral estatisticamente significativo (p = 0,0004) que era maior do que os de oxaliplatina (p = 0,0361) e epirrubicina (p = 0,032) em comparação com controlo de veículo, respectivamente (Figura 3A). A taxa de inibição do crescimento do tumor após um tratamento de 2 semanas com nab-paclitaxel, oxaliplatina e epirrubicina foi de 77, 17,2 e 21,4 por cento (p = 0,002), respectivamente. Apenas o tratamento nab-paclitaxel criada uma redução do tamanho das lesões subcutâneas em comparação com o seu tamanho do tumor pré-estabelecido. Peso médio dos tumores foi significativamente diminuído por tratamento nab-paclitaxel (0,154 ± 0,075 g vs. 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037) o tratamento, mas não por oxaliplatina (0,408 ± 0,12 g) ou epirubicina (0,46 ± 0,172 g) em comparação com veículo de controlo, respectivamente (Figura 3A). Também foram avaliados os efeitos antitumorais de nab-paclitaxel em NCI-N87 tumores locais rato xenotransplante. Após duas semanas de tratamento, terapia de nab-paclitaxel resultou na inibição significativa do volume do tumor (p = 0,0023) (Figura 3B) e a taxa de inibição do crescimento do tumor foi de 72,8 por cento. O peso médio do tumor no grupo de tratamento nab-paclitaxel foi significativamente mais baixa do que no grupo do veículo (0,093 ± 0,026 g vs. 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (Figura 3B). Nenhuma mudança significativa no peso corporal do rato foi observado em nenhum dos grupos nab-paclitaxel, oxaliplatina ou terapia epirubicina.

Nab-paclitaxel induz a morte celular mitótico in vivo

Mecanismos de na actividade antitumoral vivo de nab-paclitaxel foram ainda examinadas em tecidos tumorais obtidas de SNU16 e NCI-N87 xenotransplantes. Um aumento significativo na expressão de fosfo-stathmin foi observada em SNU16 (Figura 4A) e NCI-N87 (Figura 4B) tumores de xenoenxerto com o tratamento de nab-paclitaxel por ambos blot e Western imuno análises.

Tumor tecido de ratinhos tratados nab-paclitaxel apresentaram um índice de proliferação de células de tumor diminuiu. Um índice proliferativo intratumoral baseada-expressão de Ki67 diminuiu em 90,7% (p = 0,001) comparado com os controlos no grupo nab-paclitaxel tratada, em oposição a 72,6% (p = 0,004) no grupo tratado com oxaliplatina e 67,7% (p = 0,003 ) no grupo tratado epirubicina (Figura 5A). Nab-paclitaxel provocou uma inibição mais forte efeito sobre a proliferação de células de tumor do que a oxaliplatina e epirrubicina.

Exame da apoptose em tecidos tumorais revelou que a indução de apoptose em índice foi de 7,9 vezes no grupo nab-paclitaxel (p = 0,013 ), 5,7 vezes em oxaliplatina animais tratados (p = 0,024), e 5,2 vezes no grupo tratado epirubicina (p = 0,042) ao longo da linha de base dentro do grupo de controlo (Figura 5B).

Nab-paclitaxel aumenta a sobrevida dos animais

no primeiro estudo a sobrevivência, a média de sobrevivência de ratos SCID-NOD foi de 24 dias no grupo controle. Esta aumentou para 86 dias após o tratamento nab-paclitaxel (p = 0,0004 contra grupo de controlo, p = 0,0005 vs grupo oxaliplatina) e para 37,5 dias após o tratamento oxaliplatina (p = 0,0004 contra grupo de controlo). A gama de sobrevivência do grupo também foi superior após o tratamento nab-paclitaxel (intervalo: 75 a 95 dias) em relação ao tratamento de oxaliplatina. (Intervalo: 34 a 41 dias) (Figura 6A)

No segundo estudo, a sobrevivência, a mediana a sobrevivência de ratinhos SCID-NOD foi de 31 dias no grupo de controlo. Isso aumentou para 93 dias após o tratamento nab-paclitaxel (p = 0,0007 vs. grupo controle e oxaliplatina, e p = 0,0416 vs. grupo docetaxel), a 81 dias após o tratamento com docetaxel (p = 0,0007 vs. controles) e 40 dias por tratamento de oxaliplatina (grupo controle p = 0,038 vs). A gama de sobrevivência do grupo foi de 75 a 96 dias após o tratamento nab-paclitaxel em comparação com tratamento com docetaxel (intervalo: 74 a 93 dias) e tratamento de oxaliplatina (intervalo: 35 a 45 dias). (Figura 6B)

Discussão

câncer gástrico avançado é risco de vida e representa um desafio formidável tratamento. regimes de quimioterapia citotóxica tradicionais duplos ou triplos têm efeitos limitados e podem causar efeitos colaterais e chemoresistance [42] - [44]. O presente estudo demonstra claramente que nab-paclitaxel tem efeitos significativamente mais fortes antitumor em linhas de células de cancro gástrico do que os agentes citotóxicos actualmente usados ​​oxaliplatina e epirrubicina in vitro e in vivo, medido por efeitos antiproliferativos, a apoptose, a morte celular mitótico, resposta antitumoral localizada e sobrevida relacionada a carga tumoral.

In vitro estudo mostrou que nab-paclitaxel é altamente potente na inibição da proliferação de células de linhas de células gástricas humanas do que a oxaliplatina e epirubicina. células SNU16 são mais sensíveis a nab-paclitaxel do que as células NCI-N87. Alguns estudos descobriram que stathmin foi correlacionada com a resistência taxano e knockdown stathmin pode aumentar a sensibilidade à taxano [33], [36]. Testamos a expressão de stathmin e não encontraram nenhuma diferença entre estas três linhas celulares. Curiosamente, quando foi examinada a expressão de fosfo-stathmin verificou-se que a capacidade de nab-paclitaxel para inibir a proliferação de células in vitro foi da mesma ordem de grandeza como a expressão de fosfo-stathmin nestes três células de cancro gástrico: SNU16 > AGS > NCI-N87. Assim, surgiu inicialmente que a expressão de fosfo-stathmin foi correlacionada com a eficácia nab-paclitaxel, dando algum apoio a uma hipótese de que a fosfo-stathmin pode servir como um biomarcador potencial para prever a resposta antitumoral nab-paclitaxel no tratamento do cancro gástrico.

Foi realizado um estudo de xenoenxerto NCI-N87 para avaliar o efeito antitumoral de nab-paclitaxel. Em vez de forma inesperada, nab-paclitaxel inibiu significativamente o crescimento do tumor xenoenxerto NCI-N87 em comparação ao grupo controle. Estes resultados um pouco discrepantes parecem sugerir que o efeito anti-tumoral in vivo de nab-paclitaxel no cancro gástrico pode ser independente da expressão da linha de base de fosfo-stathmin ou stathmin total. Desde apenas três linhas celulares foram testadas, não podemos fazer uma conclusão definitiva sobre a relação entre stathmin ou fosfo-stathmin e eficácia nab-paclitaxel em câncer gástrico. Mais pesquisas com stathmin bateram-outs deve ser útil para abordar esta questão e investigar o papel do stathmin como biomarcador de eficácia nab-paclitaxel.

Neste estudo, nós, então, comparada efeitos antitumorais de paclitaxel nab com oxaliplatina e epirubicina em tumores de xenoenxerto de locais SNU16. Nab-paclitaxel mostrou eficácia antitumoral mais forte do que a oxaliplatina e epirrubicina, que foi consistente com resultados in vitro a proliferação celular e a proliferação de células de tumor e tecido de dados de apoptose. Embora 5-fluouracil é a droga de agente único mais estabelecida no tratamento do câncer gástrico quimioterápico, a resposta do tumor de 5-fluorouracil é relatado para ser inadequadamente previsto em modelos de ratos SCID para o ponto onde foram observados mesmo sem efeitos antitumorais [45]. A cisplatina e oxaliplatina, os indutores mais potentes de apoptose e também frequentemente utilizados no tratamento quimioterapêutico do cancro gástrico, foram escolhidos mais frequentemente como agentes para fins de comparação com novos agentes que estão a ser testados [22], [45]. paclitaxel à base de solvente tem mais efeitos secundários e não adicionar benefícios de sobrevivência em comparação com a oxaliplatina no tratamento clínico de cancro gástrico [22]. Em nossos estudos, oxaliplatina não diferiram estatisticamente do epirubicina. Decidimos, portanto, oxaliplatina como um agente de linha de base no estudo de sobrevivência dos animais e descobriram que nab-paclitaxel aumentou a sobrevida mediana do mouse por cerca de 40 dias mais de oxaliplatina, um efeito mais do que o dobro do que o alcançado por oxaliplatina. Docetaxel parece ser mais activo do taxano, com mais rápida captação celular e intracelular de retenção mais longo em comparação com o paclitaxel à base de solvente [46]. Realizamos um outro estudo de sobrevivência para comparar os efeitos antitumorais de nab-paclitaxel com docetaxel e constatou que o tempo médio de sobrevivência foi ligeiramente alargado após o tratamento nab-paclitaxel (93 dias versus 81 dias, p = 0,0416). Nossos resultados foram consistentes com os resultados de um estudo recente da Fase II do cancro da mama que mostraram que 100 mg /m ^{2 nab-paclitaxel tiveram uma sobrevida prolongada média geral (taxa de risco 0,575, p = 0,008) em comparação com docetaxel [47]. Com base em nossos resultados, nab-paclitaxel mostrou eficácia antitumoral mais forte no câncer gástrico experimental e parece representar um novo agente quimioterápico razoavelmente potente para o tratamento do câncer gástrico clínica.}

stathmin é um importante microtúbulos fosfoproteína-desestabilizar microtúbulos. Quando stathmin é fosforilada, a sua actividade desestabilizadores do microtúbulo diminuiu, [34] [32] e isto pode melhorar a sensibilidade à taxano. Stathmin é fosforilada sobretudo no dependente de ciclina proteína cinase (CDK) local de ligação na mitose Ser38 [32], de modo que focado analisa a expressão no resíduo ser38. Descobrimos que o tratamento com nab-paclitaxel aumentou a expressão de fosfo-stathmin in vitro e in vivo e foi correlacionado com prisões mitóticas, fragmentação nuclear, cariopicnose e a morte das células mitóticas. morte celular ocorreu mitótico nas células com elevada expressão de fosfo-stathmin. Zhou et al. [33] descobriram que a expressão stathmin regulada para baixo depois STMN1 silenciamento de genes em células de carcinoma hepático adicionados 7,7 vezes a sensibilidade para nab-paclitaxel e sensibilidade 2,7 vezes paclitaxel à base de solvente para mas nenhuma sensibilidade à doxorrubicina. A natureza molecular que desencadeia a morte celular durante a paragem da mitose prolongada permanece mal definido [17], [32]. postos de montagem do fuso ter sido pensado para desempenhar um papel crucial durante este processo [48]. Neste estudo, nab-paclitaxel fosforilação induzida de stathmin em células de cancro gástrico, o que é esperado para estabilizar o aparelho de microtúbulos, que por sua vez pode provocar prisões mitóticas e morte celular gatilho. Embora estes sejam precoces e preliminares de dados, algum apoio para fosfo-stathmin regulação da actividade antitumoral nab-paclitaxel tem sido observado e merece ser ainda avaliados.

Em conclusão, o presente estudo demonstra que um único agente de nab-paclitaxel tinha uma actividade antitumoral mais forte no cancro gástrico experimental do que a corrente de oxaliplatina agentes quimioterapêuticos padrão e epirubicina, e pareceu ser o taxano superior em comparação com o docetaxel. Esta actividade antitumoral forte suporta a justificativa para avaliação clínica de nab-paclitaxel como promissor agente de microtúbulos-inibitória no câncer gástrico.

Informações de Apoio
Figura S1.
Nab-paclitaxel leva à parada fase G2-M em células cancerosas gástricas. Os histogramas (A) mostram perfis do ciclo celular de células AGS e NCI-N87 em diferentes momentos após o tratamento nab-paclitaxel. células de cancro gástrico foram cultivadas durante 24 horas e, em seguida, tratada com 100 nM de nab-paclitaxel durante 12 horas ou 24 horas. análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. Os resultados apresentados são representativos de duas experiências independentes. (B) a distribuição do ciclo celular em células cancerosas gástricas tratados por 100 nM nab-paclitaxel. . * Símbolo condições marcas sob as quais as células haviam se desintegrado
doi: 10.1371 /journal.pone.0058037.s001
(TIF)
Figura S2.
progressão do ciclo celular de células de cancro gástrico tratados por oxaliplatina, epirrubicina e docetaxel. Os histogramas (A) mostram perfis do ciclo celular de células SNU16 e AGS depois de oxaliplatina, epirubicina e tratamento com docetaxel. células de cancro gástrico foram cultivadas durante 24 horas e depois tratou-se com 10 uM nab-paclitaxel, oxaliplatina, epirrubicina e docetaxel durante 8 horas. ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. Os resultados apresentados são representativos de duas experiências independentes.

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