PLoS ONE: Superior antitumoraktiviteten af ​​Nanopartikel Albumin-Bound Paclitaxel i Experimental Gastric Cancer

Abstrakt

mavekræft er den anden almindelige årsag til kræft dødsfald på verdensplan og mangler meget effektiv behandling for avanceret sygdom. Nab-paclitaxel er et nyt mikrotubuli-hæmmende cytotoksisk middel, der ikke er testet i mavekræft som i endnu. I denne undersøgelse blev humane gastriske cancercellelinier AGS, NCI-N87 og SNU16 undersøgt. Nab-paclitaxel inhiberede celleproliferation med en IC50 på 5 nM i SNU16, 23 nM i AGS og 49 nM i NCI-N87-celler efter 72 timers behandling, hvilket var lavere end den for oxaliplatin (1,05 um til 1,51 um) og epirubicin ( 0,12 um til 0,25 um). Nab-paclitaxel behandling forøget ekspression af det mitotiske spindler associeret phospho-stathmin uanset den samlede baseline eller phosphoryleret stathmin niveau, og induceret mitotisk celledød som bekræftet ved øget ekspression af spaltet-PARP og caspase-3. Efter en to-ugers NAB-paclitaxel, oxaliplatin eller epirubicin behandling, er den gennemsnitlige in vivo lokal tumorvækst hæmning sats var 77, 17,2 og 21,4 procent, (p = 0,002). Effekter af terapi på tumorale proliferative og apoptotiske indeks svarede med tumor Væksthæmningstestene data, mens ekspressionen af ​​phospho-stathmin også steget i væv. Der var en stigning i median dyr overlevelse efter NAB-paclitaxel behandling (93 dage) sammenlignet med kontroller (31 dage, p = 0,0007), oxaliplatin (40 dage, p = 0,0007), eller til docetaxel (81 dage, p = 0,0416) . Den stærke antitumoraktiviteten af ​​nab-paclitaxel i eksperimentel gastrisk cancer understøtter sådan mikrotubulus-inhiberende strategi for klinisk anvendelse. Nab-paclitaxel fordele blev observeret uafhængig af phosphoryleret stathmin udtryk ved baseline, at sætte spørgsmålstegn ved overvejelse af nab-paclitaxel brug i gastrisk kræft baseret på denne formodede biomarkør

Henvisning:. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior antitumoraktiviteten af ​​Nanopartikel Albumin-Bound Paclitaxel i Experimental Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10,1371 /journal.pone.0058037

Redaktør: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, England

Modtaget: 20. november 2012; Accepteret: 29 Januar 2013; Publiceret: 27 feb 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest udbredte. cancer og den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald i hele verden [1] - [3]. De fleste patienter har fremskreden eller metastatisk sygdom på tidspunktet for diagnose [4], [5]. Kombinationen af ​​oxaliplatin og 5-fluorouracil, med og uden epirubicin, er blevet den mest udbredte regime i første linje kemoterapi for avanceret mavekræft [6], [7]. Men denne kombination behandling har potentiale til betydelige bivirkninger og stadig bærer begrænset effekt, mens patienternes prognose forbliver trist med en median overlevelse på omkring 10 måneder? [8] - [11]. I et forsøg på at forbedre overlevelse og for at mindske toksiciteten er molekylært målrettet terapi aktivt undersøgt til behandling af gastrisk kræft [12].

Mikrotubuli har længe været betragtet som et mål af interesse for nogle anticancer narkotika på grund af deres universelle rolle i prolifererende celler og deres afgørende rolle i mitose [13] - [15]. Paclitaxel og docetaxel er klassiske mikrotubulus inhibitorer, der udøver deres aktivitet ved at fremme tubulin-polymerisation og stabilisering af mikrotubuli, hvilket resulterer i G2-M fasen og mitotisk celledød [15]. Mitotisk celledød er en form for celledød forekommer specielt under mitotiske stadier induceret af DNA skadelige midler og spindel giftstoffer /mitose inhibitorer [16], [17]; det hovedsageligt caspase afhængig, men i sjældne tilfælde kan også caspase uafhængig [18]. Paclitaxel er blevet testet for avancerede og tilbagevendende gastrisk kræft med en responsrate på 43% i kombination med 5-fluorouracil og folininsyre [9], [19]. Sammenlignet med den svarprocent på 38~45% givet ved en kombination af oxaliplatin med 5-fluorouracil og folinsyre, paclitaxel ikke resulterede i overlegen overlevelse, men forårsagede flere bivirkninger, især hos ældre patienter [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paclitaxel krævede emulgering med opløsningsmidler for at tillade intravenøs administration, som har resulteret i overfølsomhedsreaktioner og potentielt dramatiske bivirkninger hos patienter [23], [24]. Nanopartikel albumin-bundne (nab) paclitaxel er et hidtil ukendt albumin-stabiliseret, cremophor-fri og vandopløselig nanopartikel formulering af paclitaxel. Det er veltolereret uden overfølsomhedsreaktioner efter intravenøs infusion [25]. Kliniske og eksperimentelle studier viste, at sammenlignet med opløsningsmiddelbaseret paclitaxel, NAB-paclitaxel havde højere tumor fastholdelse, lavere toksicitet [23], [26] og mere potente antitumor virkninger på brystcancer, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), pancreas cancer, melanom, og hoved- og halscancer [27] - [31]. Imidlertid er den potentielle rolle nab-paclitaxel i gastriske kræftceller ikke testet som af endnu

Stathmin, en mikrotubuli-destabiliserende phosphoprotein, er en vigtig regulator af mikrotubuli polymerisering og dynamik [32] -. [34] og viste sig at være relateret til taxan modstand i visse tumortyper gennem at ændre lægemiddelbinding og forsinke G2-M faseovergangen [33], [35]. Stathmin inhibering havde en synergistisk antiangiogenisk og antitumorvirkning med taxol [36]. Stathmin ekspression er blevet fundet at være til stede i en lang række forskellige humane cancere, herunder mavecancer, og derfor kan repræsentere et attraktivt mål for cancerterapi [34], [37], [38]. Jeon et al. fundet, at stathmin kan tjene som prognostisk markør og et potentielt terapeutisk mål for mavekræft [37]. Phosphorylering af stathmin reducerer sine mikrotubulus destabiliserende virkninger, et fænomen, der er også blevet tilskrevet taxan aktivitet [34].

Denne undersøgelse evaluerede antitumor aktiviteter af nab-paclitaxel i humane gastriske kræftceller in vitro og in vivo. Vi sammenlignede antitumor effekt af NAB-paclitaxel til andre cytostatika om lokal tumorvækst og dyrs overlevelse. Vi målte også udtryk for total stathmin og phospho-stathmin in vitro og in vivo til at vurdere deres rolle som prædiktive markører i nab-paclitaxel antitumorreaktion.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

de humane gastriske cancercellelinier AGS, NCI-N87 og SNU16 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO _{2 atmosfære. NAB-paclitaxel blev indkøbt fra Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). Oxaliplatin blev indkøbt fra Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Docetaxel, epirubicin og 5-fluoruracil blev opnået fra et lokalt apotek. Celleproliferationen reagens WST-1 blev erhvervet fra Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev evalueret ved den kolorimetriske WST-1 assay. Målingen er baseret på evnen af ​​levedygtige celler til at spalte den sulfonerede tetrazoliumsalt WST-1 (4- [3- (4-iodphenyl) -2- (4-nitrophenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, 3- benzen disulfonat) ved mitokondrielle dehydrogenaser [39]. Gastrisk cancerceller (5000 celler pr brønd) blev udpladet i en 96-brønds plade i regelmæssig vækstmedium og blev behandlet med NAB-paclitaxel, 5-fluoruracil, oxaliplatin og epirubicin efter 16 timers inkubation. Det koncentrationsområde anvendes (1 nM til 10 uM) var sammenlignelig med deres klinisk opnåelige koncentrationer. Efter yderligere inkubation på 72 timer blev 10 pi WST-1 reagens tilsat i hver brønd efterfulgt af inkubation i 2 timer. Absorbansen ved 450 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser.

Cellecyklusanalyse

Cellecyklusanalyse blev udført ved flowcytometri med fluorescerende propidiumiodid (PI) farvning. Celler blev dyrket og behandlet med NAB-paclitaxel, oxaliplatin, epirubicin og docetaxel til 8 til 24 timer. Celler blev derefter opsamlet og fikseret i 75% ethanol-PBS natten over ved -20 ° C. Celler blev centrifugeret i 5 min ved 2000 x g. Cellepelleten blev resuspenderet og inkuberet i 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100, og 1 mg /ml RNAse A i PBS i 45 minutter ved stuetemperatur. Suspensionen blev derefter analyseret på en Becton Dickinson FACScan. Forholdet mellem celler i sub-G1, G1, S og G2-M-faser af cellecyklus blev bestemt ved deres DNA-indhold.

Immuncytokemisk analyse

mavekræft celler (1 x 10 ^{5 celler pr kammer) blev belagt i en 4-kammer slide i regelmæssig vækstmedium. Efter 24 timers blev cellerne behandlet med nab-paclitaxel i 16 timer og derefter fikseret i 4% paraformaldehyd. Celler blev inkuberet med CAS blokeringspuffer efterfulgt af 1 times inkubation med phospho-stathmin antistof (1:100) og 40 minutters inkubation med Cy3 (1:200 fortynding) sekundært antistof. Objektglas blev monteret under anvendelse monterings opløsning indeholdende 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fluorescensmikroskopi blev anvendt til at detektere fluorescerende signaler vha IX81 Olympus mikroskop udstyret med et Hamamatsu Orca digitalkamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).}

Western blot-analyse

Subkonfluente monolag af celler blev behandlet med NAB-paclitaxel, oxaliplatin og epirubicin. Cellelysater og tumorlysater blev opnået som tidligere beskrevet [40]. Supernatanter blev udvundet ved centrifugering ved 13000 rpm, Proteinkoncentrationer blev målt og lige mængder af totalt protein blev separeret ved SDS-PAGE. Proteiner blev overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA) og membranerne blev blokeret i 1 time i TBS-T. Membranerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende antistoffer: total stathmin, phospho-stathmin (ser38), spaltes poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), spaltet caspase-3 (alle fra Cell Signaling Technology , Beverly, MA), α-tubulin og β-actin (begge fra Sigma, St. Louis, MO). Membranerne blev derefter inkuberet med de tilsvarende HRP-konjugeret sekundære antistoffer (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) i en time. Specifikke bånd blev påvist ved hjælp af den forbedrede chemoilluminescence reagens (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) på autoradiografisk film.

Subkutan tumorvækst undersøgelse

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med retningslinjer og godkendte protokoller fra University of Texas Southwestern Medical center (Dallas, TX) Institutional Animal Care og brug Udvalg (Permit Number 2012-0081). Dyrene blev overvåget dagligt gennem hele eksperimentet for eventuelle tegn på nød. Kvinde SCID-mus (6 til 8 uger) blev anvendt til komparativ modellering af subkutan tumorvækst. Gastric kræftceller (10 × 10 ^{6 NCI-N87 eller 20 × 10 6 SNU16 celler) blev subkutant injiceret i hver mus. Mus blev vejet to gange om ugen. Fjorten dage efter tumorcelleinjektion alle mus havde målelig tumor (en gennemsnitlig tumorstørrelse på 100 til 150 mm 3). Mus blev derefter tilfældigt grupperet (n = 6~8 pr gruppe) og behandlet intraperitonealt med PBS (kontrol), nab-paclitaxel (10 mg /kg i 100 pi PBS, 2 gange om ugen), oxaliplatin (5 mg /kg i 100 pi PBS, 2 gange om ugen), og epirubicin (1 mg /kg i 100 pi PBS, 2 gange om ugen) i 14 dage. Tumorstørrelsen blev målt to gange ugentligt via caliper, og tumorvolumen (V) blev beregnet ved anvendelse af formlen V = ½ [L × (W) 2], L = længde og W = bredde. Relative tumorvolumen (RTV) blev bestemt ifølge formlen RTV = V _{n /V 0 hvor V 0 og V repræsenterer 1 tumorvolumen på dag 0 og efterfølgende måling dag, henholdsvis. Hæmningen rate tumorvækst blev beregnet ved anvendelse af formlen (1-RTVt /RTVc) × 100% hvor t og c repræsenterer behandling og kontrolgruppen. Efter endt behandling blev alle mus aflivet med CO2, tumorer blev fjernet, vejet, dissekeret og forarbejdet til histologisk, immunhistokemiske og Western blot analyse.}}

immunhistokemisk analyse

Tumor vævsprøver blev fastsat i 4% paraformaldehyd og indlejret i paraffin. Intratumoral proliferation blev målt ved Ki67 kerneantigen farvning i henhold til producentens protokol (Abcam, Cambridge, MA). Paraffinindlejrede vævssnit blev skåret (5 um), deparaffineret, rehydreret og antigen hentes. Sektionerne væv blev inkuberet med CAS blokerende buffer efterfulgt af 1 times inkubation med 1:200 fortynding af primær Ki67 eller phospho-stathmin antistof (1:200) og 40 minutters inkubation med Cy3 (1:200 fortynding) sekundært antistof. Objektglas blev monteret under anvendelse monterings opløsning indeholdende 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Invitrogen). Intratumoral proliferative indeks og stathmin aktivitet blev vurderet ved at beregne de positive celler fra fem forskellige høj effekt felter (HPF) på en blindet måde. Intratumoral apoptotisk aktivitet blev vurderet ved farvning af vævssnit med "Apoptag Apoptose Detection Kit" ifølge producentens (Millipore) instruktioner. Fluorescensmikroskopi blev anvendt til at detektere fluorescerende signaler vha IX81 Olympus mikroskop udstyret med et Hamamatsu Orca digitalkamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) og en FTB spinding konfokal enhed med Slidebook software (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).

Animal overlevelsesanalyse

Animal overlevelse blev udført ved hjælp af 6- til 8 uger gamle kvindelige SCID-mus [41]. Musene blev injiceret intraperitonealt med SNU16 (40 × 10 ^{6) celler og legemsvægt blev målt to gange om ugen. Tre uger efter tumorcelleinjektion mus blev tilfældigt inddelt (n = 6 til 8 per gruppe).}

I den første overlevelsesundersøgelse, mus blev behandlet intraperitonealt med PBS (kontrol), nab-paclitaxel (10 mg /kg i 100 pi PBS, 2 gange om ugen), og oxaliplatin (5 mg /kg i 100 pi PBS, 2 gange om ugen) i 2 uger. I den anden overlevelse undersøgelse blev mus behandlet intraperitonealt med PBS (kontrol), nab-paclitaxel (10 mg /kg i 100 pi PBS, 2 gange om ugen), docetaxel (3 mg /kg i 100 pi PBS, 2 gange om ugen ) eller oxaliplatin (5 mg /kg i 100 pi PBS, 2 gange om ugen) i 2 uger. Animal lidelse blev reduceret med euthanizing når man drejer døende i henhold til foruddefinerede kriterier, herunder hurtigt vægttab eller gevinst (> 15%), manglende spise eller drikke, sløvhed, manglende evne til at forblive oprejst og manglende styrke. Animal overlevelse blev vurderet fra den første dag i behandlingen indtil døden.

Statistisk analyse

Overlevelse analyse blev evalueret med GraphPad Prism 5 Software (GraphPad Software, San Diego, CA). In vitro celleproliferation data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Statistisk analyse blev udført ved ANOVA for multipel sammenligning gruppe og t-test for den enkelte gruppe sammenligning. Overlevelse gruppe sammenligning blev udført via log-rank test inden for en Kaplan-Meier typen analyse. Værdier af p < 0,05 blev anset for at repræsentere statistisk signifikante forskelle gruppe

Resultater

Stathmin udtryk i gastriske kræftceller

Analyse af de menneskelige mavekræft celler AGS, NCI. N87 og SNU16 viste, at alle tre linjer udtrykte stathmin. Ingen forskel af total stathmin ekspression blev fundet blandt disse tre cellelinier. Ekspression af phospho-stathmin varierede mellem cellelinjer, i følgende rækkefølge: SNU16 > AGS > NCI-N87-celler (figur 1A).

Nab-paclitaxel inhiberer gastrisk cancer celleproliferation

Nab-paclitaxel inhiberede gastrisk cancer celleproliferation på en dosis-afhængig måde, og inhibering i celleproliferation forekom at følge den samme rækkefølge som ekspression af phospho-stathmin (figur 1B). Ved 100 nM koncentration hæmning i celledeling var 94,5, 66,7 og 41,8 procent i SNU16, AGS og NCI-N87 celler hhv. NAB-paclitaxel viste den højeste antiproliferative potens med en laveste effektive dosis fundet i alle 3 cellelinjer blev testet i forhold til 5-fluouracil, oxaliplatin og epirubicin. IC _{50 af nab-paclitaxel var 5 nM i SNU16, 23 nM i AGS og 49 nM i NCI-N87 celler, som var mindre end 5-fluouracil (6,46 uM i SNU16, > 10 uM i AGS og 10,2 iM i NCI-N87 celler), oxaliplatin (1,51 uM i SNU16, 1,64 uM i AGS og 1,05 uM i NCI-N87 celler) eller epirubicin (0,12 uM i SNU16, 0,16 uM i AGS og 0,25 uM i NCI-N87 celler) ( Figur 1C).}

Nab-paclitaxel fremkalder G2 anholdelse og mitotisk celledød in vitro

for at vurdere den underliggende mekanisme for væksthæmning ved NAB-paclitaxel, cellecyklus profil blev analyseret. Som vist i figur 2A, NAB-paclitaxel (100 nM) resulterede i G2-M cellecyklusstandsning i SNU16 celler. Procentdelen af ​​propidiumiodid-positive celler i G2-M-fasen steg fra 35.6 til 71,6 efter 100 nM nab-paclitaxel behandling i 12 timer. Lignende ændringer skete i AGS og NCI-N87 celler med NAB-paclitaxel og docetaxel behandling, men ikke med oxaliplatin og epirubicin behandling (Tal S1 og S2).

Effekt af nab-paclitaxel på mitotisk celledød, udtryk for phospho -stathmin og apoptose-relaterede proteiner blev målt ved immunocystochemistry og Western blot. Nab-paclitaxel behandling forårsagede mikrotubuli forstyrrelser og mitotiske anholdelser i gastrisk kræftceller som observeret af nucleus fragmentering og karyopyknosis (figur 2B). Ekspression af phospho-stathmin blev forøget efter NAB-paclitaxel behandling, og højere ekspression af phospho-stathmin var forbundet med en større grad af mitotiske arrestationer, nucleus fragmentering eller karyopyknosis, og celledød (figur 2B og 2C). Nuklear fragmentering og karyopyknosis forekom hos 16,7% af celler med lav ekspression af phospho-stathmin men i 95,7% af celler med høj ekspression af phospho-stathmin (r = 0,672, p < 0,001). Der var også evidens for tidsafhængig forøget ekspression af phospho-stathmin ved nab-paclitaxel-behandling (figur 2D).

Vi undersøgte, om den mitotiske celledød induceret af nab-paclitaxel kunne delvis være korreleret med induktion af apoptose . Evaluering af PARP-1-spaltning og caspase-3-spaltning som markører for induktion i apoptose afslørede, at i gastriske cancerceller NAB-paclitaxel, oxaliplatin og epirubicin behandling forårsagede en stigning i ekspressionen af ​​både spaltet PARP-1 og caspase-3. Dette udtryk for apoptose-relaterede proteiner viste højere efter NAB-paclitaxel behandling sammenlignet med oxaliplatin eller epirubicin behandlinger (Figur 2E).

Nab-paclitaxel hæmmer væksten af ​​mavekræft implanteret

In vivo antitumor virkninger af nab-paclitaxel blev evalueret i en murin xenograft model med SNU16 celler. Nab-paclitaxel ved 10 mg /kg to gange om ugen i to uger var veltolereret uden tydelige tegn på toksicitet som vurderet ved muse vægt og daglig vurdering. Efter en to-ugers behandling, nab-paclitaxel resulterede i statistisk signifikant tumorvækst inhibering (p = 0,0004) som var større end dem af oxaliplatin (p = 0,0361) og epirubicin (p = 0,032) sammenlignet med vehikelkontrol, henholdsvis (figur 3A). Tumorvækstinhiberingen sats efter en 2-ugers behandling med NAB-paclitaxel, oxaliplatin og epirubicin var 77, 17,2 og 21,4 procent (p = 0,002), henholdsvis. Kun NAB-paclitaxel behandling skabte en størrelse reduktion af subkutane læsioner sammenlignet med deres forud fastlagte tumorstørrelse. Gennemsnitlige tumorvægt blev signifikant reduceret med nab-paclitaxel behandling (0,154 ± 0,075 g vs. 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037), men ikke af oxaliplatin (0,408 ± 0,12 g) eller epirubicin (0,46 ± 0,172 g) behandling sammenlignet med bærer kontrol, henholdsvis (figur 3A). Vi evaluerede også antitumor virkninger af nab-paclitaxel på NCI-N87 xenograft mus lokale tumorer. Efter to ugers behandling, NAB-paclitaxel terapi resulterede i signifikant tumorvolumen inhibering (p = 0,0023) (figur 3B) og tumorvækstinhibering sats var 72,8 procent. Gennemsnitlige tumorvægt i nab-paclitaxel behandlingsgruppe var signifikant lavere end i vehikelgruppen (0,093 ± 0,026 g vs. 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (figur 3B). blev ikke observeret nogen signifikant ændring i mus kropsvægt i nogen af ​​nab-paclitaxel, oxaliplatin eller epirubicin terapi grupper.

Nab-paclitaxel inducerer mitotisk celledød in vivo

Mekanismer for in vivo antitumoraktivitet af NAB-paclitaxel blev yderligere undersøgt i tumorvæv opnået fra SNU16 og NCI-N87 xenografter. En signifikant stigning i ekspressionen af ​​phospho-stathmin blev observeret i SNU16 (figur 4A) og NCI-N87 (figur 4B) xenotransplantattumorer med behandlingen af ​​NAB-paclitaxel både immunhistologisk og Western blot-analyser.

Tumor væv fra nab-paclitaxel-behandlede mus viste en nedsat tumorcelleproliferation sats. En Ki67-ekspression-baserede intratumoral proliferative indeks faldt med 90,7% (p = 0,001) sammenlignet med kontroller i nab-paclitaxel-behandlede gruppe, i modsætning til 72,6% (p = 0,004) i oxaliplatin behandlede gruppe og 67,7% (p = 0,003 ) i epirubicin behandlede gruppe (figur 5A). Nab-paclitaxel forårsagede en stærkere hæmning virkning på tumorcelleproliferation end oxaliplatin og epirubicin.

Undersøgelse af apoptose i tumorvæv afslørede, at induktionen i apoptotisk indeks var 7,9-fold i nab-paclitaxel (p = 0,013 ), 5,7-fold i oxaliplatin behandlede dyr (p = 0,024), og 5,2-fold i epirubicin behandlede gruppe (p = 0,042) over udgangspunktet kontrolgruppen (figur 5B).

Nab-paclitaxel øger dyr overlevelse

i den første overlevelse undersøgelse, den mediane overlevelse SCID-NOD mus var 24 dage i kontrolgruppen. Dette steg til 86 dage efter NAB-paclitaxel behandling (p = 0,0004 versus kontrolgruppen, p = 0,0005 vs. oxaliplatin gruppe) og 37,5 dage efter oxaliplatin behandling (p = 0,0004 versus kontrolgruppen). Gruppen overlevelse interval var også overlegen efter NAB-paclitaxel behandling (interval: 75 til 95 dage) sammenlignet med oxaliplatin behandling. (Interval: 34 til 41 dage) (Figur 6A)

I den anden overlevelse undersøgelse, median overlevelse af SCID-NOD mus var 31 dage i kontrolgruppen. Det steg til 93 dage efter NAB-paclitaxel behandling (p = 0,0007 vs. kontrol og oxaliplatin gruppe, og p = 0,0416 vs. docetaxel gruppe), til 81 dage efter docetaxel-behandling (p = 0,0007 vs. kontrol) og til 40 dage ved oxaliplatin behandling (p = 0,038 versus kontrolgruppen). Gruppen overlevelse interval var 75 til 96 dage efter NAB-paclitaxel behandling i forhold til docetaxel behandling (interval: 74 til 93 dage) og oxaliplatin behandling (interval: 35 til 45 dage). (Figur 6B)

Diskussion

Avanceret mavekræft er livstruende og repræsenterer en formidabel behandling udfordring. Traditionelle dobbelt eller tredobbelt cytotoksisk kemoterapi har begrænsede effekter og kan give bivirkninger og kemoresistens [42] - [44]. Den foreliggende undersøgelse viser klart, at nab-paclitaxel har betydelige stærkere antitumorvirkninger på gastriske cancercellelinier end for tiden anvendte cytotoksiske midler oxaliplatin og epirubicin in vitro og in vivo, målt ved antiproliferative virkninger, apoptose mitotisk celledød lokaliseret antitumorreaktion og overlevelse forbundne til tumor byrde.

In vitro studie viste, at nab-paclitaxel er yderst potent hæmme celledeling for humane gastriske cellelinier end oxaliplatin og epirubicin. SNU16 celler er mere følsomme over for nab-paclitaxel end NCI-N87-celler. Nogle undersøgelser fandt, at stathmin var korreleret med taxan modstand og stathmin knockdown kan øge følsomheden over for taxan [33], [36]. Vi testede ekspressionen af ​​stathmin og fandt ingen forskel mellem disse tre cellelinier. Interessant, da vi undersøgte ekspressionen af ​​phospho-stathmin fandt vi, at evnen til NAB-paclitaxel til at hæmme in vitro celle proliferation var i samme rangorden som udtryk for phospho-stathmin i disse tre gastriske kræftceller: SNU16 > AGS > NCI-N87. Det fremgik således i første omgang, at phospho-stathmin ekspression blev korreleret med nab-paclitaxel effektivitet, støtter vores hypotese om, at en phospho-stathmin kan tjene som en potentiel biomarkør at forudsige NAB-paclitaxel antitumorrespons i gastrisk cancer behandling.

Vi udførte en NCI-N87 xenograft undersøgelse for at evaluere antitumor effekt af nab-paclitaxel. Snarere uventet NAB-paclitaxel signifikant hæmmede NCI-N87 xenograft tumor vækst i forhold til kontrolgruppen. Disse noget afvigende resultater tyder på, at in vivo-antitumor effekt af nab-paclitaxel i gastrisk kræft kan være uafhængig af baseline udtryk for phospho-stathmin eller total stathmin. Da kun tre cellelinjer blev testet, kan vi ikke lave en endelig konklusion om forholdet mellem stathmin eller phospho-stathmin og nab-paclitaxel effekt i mavekræft. Yderligere forskning med stathmin slået-outs bør være nyttige til at behandle dette spørgsmål og undersøge rolle stathmin som biomarkør for nab-paclitaxel effekt.

I denne undersøgelse har vi derefter sammenlignet antitumor virkninger af nab paclitaxel med oxaliplatin og epirubicin på SNU16 xenograft lokale tumorer. NAB-paclitaxel udviste stærkere antitumorvirkning end oxaliplatin og epirubicin, som var konsistent med in vitro-celleproliferationsresultater og tumorvæv celleproliferation og apoptose data. Selvom 5-fluouracil er den mest etablerede single-agent lægemiddel i kemoterapeutisk gastrisk kræft pleje, er tumor respons af 5-fluoruracil rapporteres at være utilstrækkeligt forudsagt i SCID musemodeller til det punkt, hvor der er observeret selv ingen antitumorvirkninger [45]. Cisplatin og oxaliplatin, mere kraftfulde inducere af apoptose og også ofte anvendes i gastrisk cancer kemoterapeutiske behandling, er blevet valgt oftere som midler til sammenligning med nye midler, der skal testes [22], [45]. Opløsningsmiddel-baserede paclitaxel har flere bivirkninger og ikke tilføje overlevelse fordele sammenlignet med oxaliplatin i klinisk behandling for mavekræft [22]. I vores undersøgelser, har oxaliplatin ikke afvige statistisk fra epirubicin. Vi vælger derfor oxaliplatin som udgangspunkt agent i dyrets overlevelse undersøgelse og fandt, at nab-paclitaxel øget median mus overlevelse ved omkring 40 dage over oxaliplatin, en mere end dobbelt effekt end der opnås ved oxaliplatin. Docetaxel synes at være den mere aktive taxan, med en hurtigere cellulær optagelse og længere intracellulær tilbageholdelse sammenlignet med opløsningsmiddelbaseret paclitaxel [46]. Vi udførte en anden overlevelse undersøgelse for at sammenligne antitumor virkninger af nab-paclitaxel med docetaxel og fandt, at den mediane overlevelsestid lidt blev udvidet efter NAB-paclitaxel behandling (93 dage vs. 81 dage, p = 0,0416). Vores resultater var i overensstemmelse med resultaterne af en nylig fase II brystkræft retssag, som viste, at 100 mg /m ^{2 nab-paclitaxel havde forlænget overlevelse (hazard ratio 0,575, p = 0,008) sammenlignet med docetaxel [47]. Baseret på vores resultater, viste NAB-paclitaxel stærkere antitumor effekt i eksperimentelle mavekræft og synes at repræsentere en rimelig potent ny kemoterapeutisk middel til klinisk mavekræft behandling.}

Stathmin er en vigtig mikrotubuli mikrotubuli-destabiliserende phosphoprotein. Når stathmin phosphoryleres, dens mikrotubulus-destabiliserende aktivitet faldt [32], [34], og dette kan forbedre følsomheden til taxan. Stathmin phosphoryleres primært på cyklin-afhængige protein kinase (CDK) bindingssted Ser38 i mitose [32], så vi fokuserede vores udtryk analyser på ser38 rest. Vi fandt, at nab-paclitaxel behandling øget phospho-stathmin udtryk in vitro og in vivo og blev korreleret med mitotiske anholdelser, nuklear fragmentering, karyopyknosis og mitotisk celledød. Mitotisk celledød indtraf i disse celler med høj ekspression af phospho-stathmin. Zhou et al. [33] fandt, at nedreguleret stathmin udtryk efter STMN1 gen knockdown i hepatisk carcinoma celle tilføjet 7,7 gange følsomhed over for nab-paclitaxel og 2,7 gange følsomhed baseret på opløsningsmidler paclitaxel men ingen følsomhed over for doxorubicin. Den molekylære natur, der udløser celledød under langvarig mitosestandsning forbliver dårligt defineret [17], [32]. Spindelenhed checkpoints har længe været anset for at spille en kritisk rolle under denne proces [48]. I denne undersøgelse, nab-paclitaxel induceret fosforylering af stathmin i gastrisk kræftceller, hvilket forventes at stabilisere mikrotubuli apparat, som igen kan forårsage mitotiske anholdelser og udløse celledød. Selv om disse er tidlige og foreløbige data, en vis støtte til phospho-stathmin regulerer NAB-paclitaxel antitumoraktivitet er blevet observeret, og fortjener at blive yderligere evalueret.

Som konklusion den foreliggende undersøgelse viser, at single-agent nab-paclitaxel havde stærkere antitumoraktivitet i eksperimentel mavekræft end den nuværende standard kemoterapeutiske midler oxaliplatin og epirubicin, og syntes at være den overlegne taxan sammenlignet med docetaxel. Denne stærke antitumoraktivitet understøtter rationalet for klinisk vurdering af nab-paclitaxel som lovende mikrotubuli-hæmmende middel i mavekræft.

Støtte oplysninger
figur S1.
Nab-paclitaxel fører til G2-M fase anholdelse i gastriske kræftceller. (A) Histogrammer viser celle-cyklus profiler af AGS og NCI-N87 celler på forskellige tidspunkter efter NAB-paclitaxel behandling. Gastrisk cancer celler blev dyrket i 24 timer og derefter behandlet med 100 nM nab-paclitaxel i 12 timer eller 24 timer. Cellecyklusanalyse blev udført ved flowcytometri. De viste resultater er repræsentative for to uafhængige forsøg. (B) fordeling Cell cyklus for mavecancer celler behandlet med 100 nM nab-paclitaxel. . Symbol * mærker betingelser, hvorunder cellerne havde opløst
doi: 10,1371 /journal.pone.0058037.s001
(TIF)
Figur S2.
cellecyklusprogression af gastriske cancerceller behandlet med oxaliplatin, epirubicin og docetaxel. (A) Histogrammer viser celle-cyklus profiler af SNU16 og AGS celler efter oxaliplatin, epirubicin og docetaxel behandling. Gastrisk cancer celler blev dyrket i 24 timer og derefter behandlet med 10 pM NAB-paclitaxel, oxaliplatin, epirubicin og docetaxel i 8 timer. Celle cyklus blev udført ved flowcytometri. De viste resultater er repræsentative for to uafhængige forsøg.

• PLoS ONE: Restaurering af miR-1228 * Expression Undertrykker Epithelial-Mesenchymale Transition i Gastric Cancer
• PLoS ONE: MDM2 SNP309 rs2279744 Polymorfi og Gastric Cancer Risk: en meta-analyse