PLoS ONE: histondeacetylase HDAC4 Bevordert maagkanker SGC-7901 Cells Progression via p21 Repressie

Abstract

Maagkanker (GC) is één van de belangrijkste oorzaken van kanker overlijden in de wereld. De rol van histondeacetylase 4 (HDAC4) in specifieke cellen en weefsels types is geïdentificeerd. Echter, de biologische rol in de ontwikkeling van maagkanker blijven grotendeels onontdekt. Kwantitatieve real time PCR (qRT-PCR) en western blot werden gebruikt om de expressie van HDAC4 analyseren de klinische monsters. siRNA en overexpressie van HDAC4 en siRNA p21 werden gebruikt om functionele effecten op proliferatie, een kolonievorming, een adenosine 5'-trifosfaat studie (ATP) test en reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie, celcyclus, apoptose tarieven en autophagy assays. HDAC4 werd opwaarts gereguleerd bij maagkanker weefsels en verschillende maagkanker cellijnen. De proliferatie, kolonie vorming van vermogen en de ATP-niveau werden verbeterd in HDAC4 overexpressie SGC-7901 cellen, maar geremd in HDAC4 knockdown SGC-7901-cellen. HDAC4 knockdown leidde tot G0 /G1-fase cel arrestatie en veroorzaakte apoptose en ROS verhogen. Bovendien HDAC4 bleek p21 expressie in maagkanker SGC-7901 cellen te remmen. p21 knock-down dramatisch verzwakt celproliferatie remmen, stoppen van de celcyclus, apoptose promotie en autofagie up-regulatie in HDAC4-siRNA SGC-7901-cellen. We hebben aangetoond dat HDAC4 bevordert maagkanker cel voortgang gemedieerd door de onderdrukking van p21. Onze resultaten experimentele basis voor het begrijpen van de pro-tumor mechanisme van HDAC4 als behandeling voor maagkanker

Citation:. Kang Z-H, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) histondeacetylase HDAC4 Bevordert maagkanker SGC-7901 Cells Progression via p21 Repressie. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10.1371 /journal.pone.0098894

Editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, China

Ontvangen: 12 februari 2014; Aanvaard: 8 mei 2014; Gepubliceerd: 4 juni 2014

Copyright: © 2014 Kang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door een subsidie ​​van het ministerie van Volksgezondheid van de provincie Jilin (nr 2012z119). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [1]. Aziatische en Zuid-Amerikaanse landen hebben een hogere incidentie van GC dan de Verenigde Staten en West-Europa [2]. Meest doeltreffende therapieën gericht op vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en epidermale groeifactor receptor (EGFR) verwante indicaties geavanceerde GC. Verbindingen tegen nieuwe targets, zoals mTOR [3], c-Met (hepatocyte growth factor receptor) [4], en HDACs, zijn ook onderzocht.

Histon deacetylase 4 (HDAC4), wat een klasse IIa HDAC, is bekend dat er in verschillende transcriptionele corepressor complexen. HDAC4 is een cruciaal onderdeel van het DNA schade respons route die door middel van 53BP1 [5] handelt. HDAC4 onderdrukt de expressie van de cycline-afhankelijke kinaseremmer p21 (ook bekend als p21waf1 /Cip1) in humane kankercellen door een Sp1-afhankelijke p53-onafhankelijk mechanisme [6]. HDAC4 bevordert de groei van darmkankercellen via onderdrukking van p21 [7]. Inactivatie van HDAC4 door kleine interfererende RNA of HDAC-remmers onderdrukt neuronale celdood [8].

De rol van HDAC4 in specifieke cellen (HeLa (cervixcarcinoom), U373 (glioom), OVCAR (ovarium), T98G ( glioom), HCT116 (dikke), NHA (astrocytische) en SKBR3 (borst)) en weefsels (hersenschors, testis, prostaat, en de epidermale laag van de huid) steeds duidelijker [9]. Echter, de exacte mechanisme van HDAC4 bij maagkanker niet vastgesteld. Daarom is het doel van deze studie was de eerste die de expressieniveaus van HDAC4 in menselijke maagkanker weefsels en cellijnen evalueren. Ten tweede, het effect van HDAC4 op maagkanker cellijnen werd onderzocht onder toepassing van overexpressie en knockdown. Ten slotte hebben we onderzocht of HDAC4 had een relatie met p21 bij maagkanker cellen. Samen, ons doel was te vinden of HDAC4 heeft een biologische rol in GC de ontwikkeling en het onderliggende mechanisme te ontrafelen.

Materialen en methoden

weefselmonsters

Negenentwintig gepaarde primair maagcarcinoom weefsels en verre normale maag weefsels werden verzameld van patiënten (leeftijd: 58,46 ± 9,17 jaar) tijdens routine therapeutische chirurgie in de afdeling Gastro-intestinale chirurgie, het eerste ziekenhuis van Jilin University. Alle monsters werden verkregen met informed consent op basis van de Verklaring van Helsinki en door het Human ethische commissie van het eerste ziekenhuis van Jilin University en Jilin University, PR China goedgekeurd. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle deelnemers.

cellijnen en cultuur

De menselijke maagkanker cellijnen SGC-7901, AGS, en BGC-823 en de normale maag epitheel cellijn GES waren verkregen van American Type Culture Collection (Manassas, VA) en gekweekt in RPMI 1640 medium met 10% foetaal bovien serum in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO _{2 bij 37 ° C.}

Stabiel getransfecteerde cellijn en transiënte transfectie

de HDAC4 fragment van volledige lengte werd geamplificeerd door reverse transcriptie PCR uit GES cellen met de specifieke primers zoals eerder beschreven [10] en ingevoegd in de BamHI en HindIII plaatsen van pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, UK). De pcDNA3.1 (+) - HDAC4 plasmide werd geverifieerd door sequentie-analyse om de afwezigheid van mutaties te bevestigen. SGC-7901-cellen werden uitgezaaid in 6-putjesplaten en getransfecteerd met pcDNA3.1 (+) - HDAC4 en pcDNA3.1 (+) - vectoren, respectievelijk, met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) volgens de instructies door de fabrikant voor 24 uur zonder antibioticumselectie. Vervolgens werden de cellen gekweekt in medium dat 400 ug /ml G418 (Sigma, St. Louis, MO) totdat alle cellen in de niet-getransfecteerde controle kweek werden gedood.

SGC-7901-cellen werden gezaaid op 6-putjesplaten en getransfecteerd met niet-targeting siRNA of siRNA gericht tegen humaan HDAC4 of p21 (Santa Cruz) met gebruik van Lipofectamine 2000 volgens de instructies van de fabrikant. Stretch experimenten werden uitgevoerd op cellen 48 of 72 uur na transfectie.

RNA-isolatie en kwantitatieve real time PCR (qRT-PCR)

Totaal RNA werd geïsoleerd uit weefsels of cellen van TRIzol reagens ( Invitrogen) en reverse transcripties werden uitgevoerd met behulp van de Takara RNA PCR kit (Takara, Dalian, China) volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met een SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japan) in een real-time PCR systeem (Eppendorf, Duitsland). De relatieve expressie verhouding in elke gepaarde tumor en non-tumorweefsel werd berekend door de 2 ^{-ΔΔCT methode.}

Celtelling kit-8 (CCK-8) test

De proliferaties van de SGC-7901-cellen werden beoordeeld aan de hand van een CCK-8 assay (Beyotime, Jiangsu, China) volgens het protocol door de fabrikant aanbevolen. In het kort werden de cellen gekweekt in een 96-puts plaat met een concentratie van 2000 cellen per putje. Op 0, 1, 2 en 3 dagen na transfectie de celproliferatie assay werd uitgevoerd door toevoeging van 10 pl CCK8 oplossing in elk putje, gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 2 uur. De absorptie werd gemeten met een ELISA lezer bij een golflengte van 450 nm.

kolonievorming assay

In het kort werden de HDAC4-overexpressie en -knockdown SGC-7901 cellen uitgezaaid in drievoud (1000 cellen per 60 mm kweekschaal) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende twee weken klonen vormen. De cellen werden gewassen met PBS met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten en gekleurd met kristalviolet (0,5% kristalviolet, 1% paraformaldehyde en 20% methanol in PBS) gedurende 30 min. De kolonies op elke plaat werden geteld en celoverleving werd uitgedrukt als een percentage van het aantal overlevende kolonies op de controleplaten.

celcyclusanalyse

De cellen werden geoogst en voorzichtig geresuspendeerd in enkelvoudige celsuspensies in Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) buffer (PBS met 2% FBS). De cellen werden tweemaal gewassen met PBS en met koude 70% ethanol overnacht gefixeerd. Cellen werden vervolgens tweemaal gewassen met koude PBS, geresuspendeerd in RNase A oplossing en gedurende 30 minuten bij 4 ° C. De suspensie werd gedurende 30 min en analyse met FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA) tot 0,05 mg /ml propidiumjodide (Beyotime) gevolgd door incubatie toegevoegd bij 4 ° C.

Cell apoptoseassay

Propidiumiodide (PI, 1 ug /ml) en Annexine V-FITC (1 ug /ml) werden gebruikt voor de bepaling van apoptose. In het kort werden de cellen getrypsiniseerd en geïncubeerd met PI en annexine V-FITC gedurende 15 minuten bij 37 ° C. De monsters werden gedetecteerd met een FACS Calibur flowcytometer. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

intracellulair adenosine 5'-trifosfaat (ATP) niveau assay

Intracellulaire ATP-gehalten werden bepaald met behulp van bioluminescentie [11]. In het kort werden cellen gelyseerd en gecentrifugeerd bij ongeveer 15.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. De supernatanten werden vervolgens gemengd met een ATP testmengsel werkoplossing (Sigma), en de hoeveelheid licht werd onmiddellijk gemeten met een luminometer (Thermo Scientific Luminoskan Ascent, Walthan, MA). De luminescentie gegevens werden genormaliseerd door het monster eiwit bedragen (gemeten met behulp van een BCA-test).

reactive oxygen species (ROS) meting

Het genereren van intracellulaire ROS werd onderzocht met behulp van 6-carboxy-2 ' , 7'-dichloorfluoresceïn diacetaat (H _{2DCFDA). In het kort 5 x 10 ^{4 cellen werden uitgeplaat in 60-mm schaaltjes en een nacht hechten. De cellen werden gekleurd met 5 uM H 2DCFDA gedurende 30 minuten bij 37 ° C en vervolgens verzameld, en de fluorescentie werd geanalyseerd met een fluorescentie spectrometer (Flex StationII 384, Molecular Devices) bij 485 nm (excitatie) en 538 nm ( emissie). Cellulaire oxidant niveaus werden uitgedrukt als relatieve DCF fluorescentie per monster bedragen eiwit (BCA methode). In sommige experimenten werden cellen voorbehandeld met 10 mM N
-acetylcysteine ​​(NAC) voor de analyse van ROS generatie.}}

Western blotanalyse

De cellen werden gelyseerd in IP lysisbuffer (Beyotime), gedenatureerd gedurende 10 minuten bij 95 ° C, geknipt met een insulinespuit en gescheiden op SDS /PAGE gelen. Na immunoblotting werden de membranen geblokkeerd en geïncubeerd met primaire antilichamen in PBS /0,1% Tween-20 met 5% magere melkpoeder. Antilichamen gericht tegen HDAC4, p21, LC3, beclin 1 ATG 7, caspase 3, 9, Bcl-2, Bax en anti-β-actine werden allen aangekocht van Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Chemiluminescerende detectie werd getest door het gebruik van een ECL-detectie kit (Pierce, Rockford, IL, USA). De resultaten werden geanalyseerd onder toepassing van Quantity One software om de optische dichtheidsverhouding doelwiteiwit verkrijgen ß-actine.

Immunofluorescentie

De cellen werden uitgeplaat op dekglaasjes met 4% paraformaldehyde (Sigma Aldrich) gedurende 10 min en gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 /PBS. De cellen werden geblokkeerd met 1% BSA gedurende 1 uur, gevolgd door incubatie gedurende de nacht bij 4 ° C met anti-LC3 antilichaam en vervolgens werden de cellen geïncubeerd met FITC-geconjugeerd secundair antilichaam (Beyotime) gedurende 1 uur. De kernen werden gekleurd met 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma). De fluorescentiebeeldvorming werd gevisualiseerd met behulp van een confocale laser scanning microscoop (Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland).

Statistische analyse

Alle gegevens zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. De gegevens zijn weergegeven als de gemiddelden ± S.E.M. Statistische significantie werd berekend met één variantieanalyse (ANOVA) of t-test van Student tussen de twee groepen met behulp van GraphPad Prism 5 statistische software. P
waarden. ≪ 0,05 werden beschouwd als significant

Resultaten

HDAC4 expressie waren up-gereguleerd in maagkanker weefsels en cellijnen

Ten eerste, we geanalyseerd HDAC4 expressie in negenentwintig gepaarde maagkanker en naburige niet-tumorweefsels door qRT-PCR analyse en western blot. We vonden dat HDAC4 was significant up-gereguleerd in maagcarcinoom weefsel (figuren 1A, B en C, ** P Restaurant < 0,01, *** P Restaurant < 0,001). Bovendien werden verscheidene maagkanker cellijnen geanalyseerd. We zagen hogere expressie van HDAC4 in drie maagkanker cellijnen (AGS, BGC-823 en SGC-7901), in vergelijking met een normale maag epitheel cellijn (GES) (figuren 1D en E, * P
<0,05, ** P Restaurant < 0,01). Daarom is onze resultaten toonden aan dat HDAC4 expressie waren up-gereguleerd in zowel maagkanker weefsels en cellijnen.

De HDAC4 expressie werd met succes down- of up-gereguleerd in SGC-7901 cellen

A pcDNA3.1 (+) expressievector werd gebruikt om HDAC4 overexpressie in SGC-7901-cellen met het oog op de doeltreffendheid ervan als een groeiregulator onderzoeken. Na stabiele transfectie, de expressie van HDAC4 mRNA was overvloedig in de pcDNA3.1 (+) - HDAC4 cellen dan in de niet-getransfecteerde cellen of negatieve controle (NC) SGC-7901-cellen (Figuur 2A, ** * P
. < 0,001), die in overeenstemming met resultaten van western blot analyse (figuur 2B) was

de gen-silencing effect van siRNA-humane HDAC4 evalueren, de mate van eiwitexpressie was HDAC4 gemeten na HDAC4-siRNA transfectie en een 48-h incubatieperiode in menselijke maagkanker cellijn SGC-7901. Real-time PCR-analyse toonde aan dat HDAC4 siRNA infectie resulteerde in 36,3% knockdown van HDAC4 mRNA (Figuur 2C, *** P
< 0,001). Western blot analyse toonde dat de HDAC4 eiwit significant gereduceerd (figuur 2D), in overeenstemming met mRNA reductie. Tezamen suggereren deze gegevens dat HDAC4 siRNA aanzienlijk kunnen onderdrukken de endogene expressie HDAC4.

HDAC4 bevorderd celproliferatie en kolonievorming

Vervolgens hebben we het effect van HDAC4 op celgroei onderzocht. Celproliferatie werd onderzocht onder toepassing Celtelling kit-8 (CCK-8) en de tijdstippen van 24, 48 en 72 uur. De groeicurves toonde aan dat wanneer HDAC4 was overexpressie in SGC-7901-cellen, werd de celgroei steeg met 1,5 maal in vergelijking met de controlegroep op dag 3 (Figuur 3A, * P Restaurant < 0,05, ∧∧P Restaurant < 0,01). Bovendien, de kolonievorming assay vertoonden een dramatische toename van 2 maal in kolonieaantal bij SGC-7901-cellen werden getransfecteerd met pcDNA3.1 (+) - HDAC4 opzichte van de NC-groep (figuren 3B en C, ** P Restaurant < 0,01)

We onderzochten ook de effecten van HDAC4 down-regulatie in SGC-7901-cellen.. De CCK-8-test en de vorming kolonie test toonde aan dat de HDAC4 down-regulatie onderdrukt de proliferatie vermogen (Figuur 3D, ∧P Restaurant < 0,05) en de kolonie vorming aantallen SGC-7901-cellen (figuren 3E en F, ** P Restaurant < 0,01). Samengevat suggereren deze gegevens dat HDAC4 groeibevorderaar in SGC-7901-cellen kunnen zijn.

HDAC4 verhoogde ATP niveaus en verlaagde ROS generatie

Een verhoging van de ATP-gehalten in cellen werd overexpressie HDAC4 waargenomen vergeleken met de NC SGC-7901-cellen (Figuur 3G, * P
< 0,05). Bovendien werd het ATP niveau gedaald HDAC4 knockdown cellen (Figuur 3H, * P
< 0,05).

Omdat intracellulaire ROS generatie kan verband houden met mitochondriale dysfunctie, we voorts onderzocht of HDAC4 ROS generatie kan stimuleren SGC-7901 cellen. De resultaten tonen aan dat een aanzienlijke vermindering van ROS generatie werd waargenomen in pcDNA3.1 (+) - HDAC4 SGC-7901-cellen in vergelijking met NC SGC-7901-cellen (Figuur 3G, ∧P
< 0,05). Ondertussen silencing van HDAC4 robuust geactiveerd ROS generatie in de SGC-7901-cellen (Figuur 3H, ** P Restaurant < 0,01). Het blokkeren van ROS productie met behulp van de antioxidant NAC significant geremd ROS generatie (Figuur 3H, ∧P Restaurant < 0,05). Dit blokkeren van ROS productie door voorbehandeling van de cellen met NAC ook sterk verhinderd ATP verlies in HDAC4 siRNA-SGC-7901-cellen (Figuur 3H, ∧P
< 0,05).

De in -gereguleerde HDAC4 expressie gearresteerd cellen in G0 /G1-fase

de down-regulatie van HDAC4 vertoonden een duidelijke stijging van het aandeel van de cellen in de G0 /G1 fase (78,74% tegenover 49,92% in de NC-siRNA groep). Er was ook een overeenkomstige afname van het aantal cellen in de S fase (12,94% tegenover 34,61% in de NC-groep siRNA) (Figuur 4A). Het kwantificeren celcyclus distributie resultaten werden aangetoond dat HDAC4 knockdown aanzienlijk geïnduceerd SGC-7901 cellen G0 /G1 arrestatie en S faag inhibitie (figuur 4B, * P Restaurant < 0,05, ** P
< 0,01). Vandaar dat deze bevindingen suggereren dat de HDAC4 niveau voortgang van de celcyclus kan regelen.

De-down gereguleerd HDAC4 expressie geïnduceerde apoptose en autofagie

Om te onderzoeken of de-down gereguleerd-HDAC4 geïnduceerde celgroei remming was gerelateerd aan apoptose, het effect van downgereguleerde HDAC4 op apoptose werd geëvalueerd door flowcytometrie behulp Annexine V-FITC /PI dubbele kleuring. Waargenomen werd dat apoptose sterk toegenomen in HDAC4 siRNA-SGC-7901-cellen vergeleken met de NC-groep siRNA (figuur 4C). We bevestigden verder de inductie van apoptose door de activering van caspase-3 en 9 door western blot. Hierbij bleek dat neerwaarts gereguleerd HDAC4 verhoogde klieving van caspases-3 en 9 vergeleken met NC-siRNA aan. De expressie van het anti-apoptotische eiwit Bcl-2 en pro-apoptotisch eiwit Bax werden gekwantificeerd. De Bax /Bcl-2-verhouding was significant verhoogd in HDAC4 siRNA-SGC-7901-cellen in vergelijking met de NC-groep siRNA (figuur 5D).

Om te onderzoeken of-downgereguleerde HDAC4 geïnduceerde autofagie in SGC-7901 cellen, we eerst gekeken naar de intracellulaire lokalisatie van LC3 in HDAC4-siRNA SGC-7901 cellen door immunofluorescentie analyse met behulp van fluorescerende antilichamen tegen LC3. De specifieke accentueren verdeling van endogeen LC3 waargenomen als gestippelde puntjes van groene fluorescentie in HDAC4 siRNA-SGC-7901 cellen vergeleken met die van de NC-groep siRNA (Figuur 4E) dat aangeeft dat autofagie werd geïnduceerd als een middel om te overleven. De subcellulaire distributie van LC3 significant geremd door de autofagie-specifieke remmer 3-MA in HDAC4 siRNA-SGC-7901-cellen (Figuur 4E). Vervolgens wordt de autofagie verwante eiwitten Atg7, beclin 1 en de verhouding van LC3-II LC3-I werden geanalyseerd met western blot. We zagen dat de expressieniveaus van Atg7, beclin 1 en LC3-II alle aanzienlijk HDAC4 siRNA-SGC-7901 cellen werden verhoogd vergeleken met de NC-groep siRNA (figuur 4F). De Atg7, beclin 1 en de verhouding van LC3-II LC3-I aanzienlijk afgenomen HDAC4 siRNA-SGC-7901 cellen die waren behandeld met 3-MA ten opzichte van de NC-groep siRNA (figuur 4F).

de downgereguleerde HDAC4 expressie remde celgroei met p21 opregulatie

door de behandeling van humane kankercellen met HDAC remmers consistent leidt tot opwaartse regulatie van p21 expressie, een cycline-afhankelijke kinaseremmer die een gevestigde doelstelling van HDAC-remmers [6], [7], [12], we gevraagd om te bepalen of overexpressie of knockdown van HDAC4 van invloed kunnen zijn p21 regelgeving en om het mechanisme van HDAC4 gemedieerde bevordering van de groei speculeren bij maagkanker cellen.

Zoals getoond in figuur 5A, de up-regulatie van HDAC4 drastisch tot de verlaagde p21-eiwitexpressie. Daarentegen HDAC4 downregulatie geleid tot de verhoogde p21 expressie (Figuur 5A). Vervolgens hebben we onderzocht of p21 knock-down kunnen beïnvloeden celgroei en apoptose in SGC-7901 cellen waarin HDAC4 is verwijderd. SGC-7901-cellen werden gecotransfecteerd met siRNA HDAC4 en siRNA p21. De p21 mRNA-niveau was significant verlaagd in HDAC4-siRNA SGC-7901 cellen na p21 knock-down (Figuur 5B, ** P Restaurant < 0,01, *** P Restaurant < 0,001). p21 knock-down dramatisch verzwakte celproliferatie remming in HDAC4-siRNA SGC-7901-cellen (Figuur 5C, * P Restaurant < 0,05, ∧∧ P Restaurant < 0,01). Het ATP-niveau werd verhoogd, maar intracellulaire ROS generatie daalde in siRNA-p21-HDAC4 groep in vergelijking met de siRNA HDAC4 groep (Figuur 5D, * P Restaurant < 0,05, ** P
<0,01). p21 down-regulatie aanzienlijk verzwakt G0 /G1 arrestatie en S faag inhibitie in HDAC4-siRNA SGC-7901-cellen (figuren 5E en F, * P Restaurant < 0,05). Immunoblotting aangetoond dat de hoeveelheid Bcl-2 was significant hoger, maar Bax was lager in siRNA-p21-HDAC4 cellen (Figuur 5G). De cel apoptose aanzienlijk afgenomen siRNA-p21-HDAC4 SGC-7901-cellen vergeleken met de siRNA HDAC4 groep (figuur 5H). Ook werd waargenomen dat p21 knockdown konden de hogere autofagieprocessen redden onderbroken fluorescerende vlekken (figuur 5I) en Atg 7, beclin 1 en LC3II eiwitten expressie in SGC-7901-cellen geïnduceerd door siRNA HDAC4 (Figuur 5J). Tezamen zijn deze gegevens blijkt dat down-regulatie van p21 het effect van HDAC4 overexpressie kon nabootsen en kan een belangrijke bemiddelaar in-HDAC4 gemedieerde SGC-7901 celgroei promotie.

Discussie

Talrijke HDAC remmers, waarvan is aangetoond dat proliferatie remmen en differentiatie kunnen induceren of apoptose in tumorcellen, worden onderzocht in klinische proeven of als antikankermiddelen of samen met andere behandelingen [13]. Hoge expressie van HDAC1 /2 werd gevonden in maagcarcinoom weefsels [14]. In onze studie hebben we aangetoond dat HDAC4 expressie waren up-gereguleerd bij maagkanker weefsels en cellijnen In vitro
. HDAC4 neerwaartse regulatie van SGC-7901-cellen onderdrukte de celproliferatie en de kolonievorming nummers aangehouden celcyclus en geïnduceerde apoptose afhankelijk van de activatie van caspases 3 en 9, die in overeenstemming met de antiproliferatieve en pro-apoptotische effecten van HDAC-inhibitoren in menselijke kankercellijnen [15] en met de eerder gerapporteerde waarneming dat HDAC4 neerwaartse regulatie vermindert klonale overleving en induceert apoptose in HeLa-cellen [5]. Proproliferative het effect van HDAC4 bij maagkanker cellen overeen met die eerder gerapporteerd voor de klasse I HDACs, HDAC1, -2 en -3 [16]. Dus gericht op de remming van HDAC4 activiteit kan een potentiële therapeutische aanpak van maagkanker behandelen.

Autofagie is eigenlijk een eiwitafbraak stelsel van eigen lysosomen de cel. Een verscheidenheid van stress-signalen, zoals tekort aan voedingsstoffen of behandeling met andere antikankermiddelen, stimuleren autofagie procedure [17]. Autofagie wordt algemeen gekenmerkt door de aanwezigheid van autofagosomen en een toename van splitsing van LC3 [18]. De rol van autofagie in het proces van celdood is omstreden, maar het is bevestigd dat overspraak tussen apoptose en autofagie essentieel geprogrammeerde celdood [19]. In onze studie, de inductie van autofagie in HDAC4-siRNA SGC-7901 cellen werd aangetoond door het accentueren patroon van LC3 immunokleuring en de accumulatie van biochemische kenmerk eiwitten van autofagie (Atg7, beclin 1 en LC3) door western blot analyse. Autofagie remming door de remmer 3-MA verzwakt de autofagie inductie in HDAC4-siRNA SGC-7901-cellen. Zo speculeerden wij autophagy plaatsgevonden, beschermen SGC-7901 kankercellen apoptose geïnduceerd door HDAC4 knockdown.

p21-eiwit, ook bekend als cycline-afhankelijke kinase (CKD) inhibitor 1, regelt de fase G1 progressie van de celcyclus . p21 is vaak verkeerd gereguleerd in menselijke kankers, en kan fungeren als een tumor suppressor of een oncogen [20]. Degenen met p21-p53-positieve en negatieve kankers significant hoger overlevingskrommen in maagcarcinoom [21], terwijl het verlies van p21-expressie samen met een verhoogde p53 detectie wordt geassocieerd met een slechte prognose en afgenomen overleving bij maagkanker [22]. Consistent zodat p21 eiwit werd down-gereguleerd in de maagkanker weefsels [23], observeerden we dat HDAC4 bevordert maag proliferatie en groei van kankercellen, gemedieerd door de onderdrukking van p21 bij maagkanker cellen, en gaat gepaard met een toename van ATP niveaus en onderdrukking van ROS generatie. Daarom hebben we onderzocht of p21 was een belangrijke mediator voor HDAC4 gemedieerde SGC-7901 celgroei promotie. In deze studie HDAC4 knockdown sterk induceerde de verhoogde expressie van p21 eiwit, terwijl HDAC4 overexpressie significant de expressie van p21 eiwit afgenomen SGC-7901 cellen. Deze gegevens impliceerde dat p21 kan een stroomafwaarts doelwit van HDAC4 zijn. Functionele analyses toonden down-regulatie van p21 kan het effect van HDAC4 overexpressie op SGC-7901 celgroei promotie na te bootsen. Tezamen bieden deze resultaten suggereerden dat HDAC4 down-regulatie kon SGC-7901 cel apoptose door up-regulering van p21 expressie te bevorderen. p21 kan een tumor suppressor in de ontwikkeling en progressie van maagkanker, kan de expressie van die helpen bij het regelen verschillende maligne gedrag van maagkanker. De mogelijke relevantie HDAC4 regulatie van p21 expressie moet ook in verband worden gezien dat er meerdere belangrijke factoren en pathways die mogelijk de expressie van p21 in maagkanker moduleren.

Samengevat onze bevindingen onthulde een belangrijke rol bij het regelen HDAC4 menselijke maagkanker cellijn SGC-7901 ontwikkeling via regulatie van p21 suggereert dat verandering van HDAC4 expressie en /of activiteit een belangrijke gebeurtenis tijdens maagkanker is. Tot slot, deze bevindingen te identificeren HDAC4 als een belangrijke regulator van de proliferatie van maagkanker door middel van onderdrukking van p21 In vitro
.

• PLoS ONE: circulerende tumorcellen (CTC's) gedetecteerd door RT-PCR en de prognostische rol bij maagkanker: een meta-analyse van gepubliceerde Literature
• PLoS ONE: MUC5AC Upstream Complex Repetitive Regio polymorfismen zijn geassocieerd met gevoeligheid en de klinische fase van Gastric Cancer