PLOS ONE: histone déacétylase HDAC4 Favorise cellules de cancer gastrique SGC-7901 Progression via p21 Repression

Résumé

Le cancer gastrique (GC) est l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Le rôle de l'histone déacétylase 4 (HDAC4) dans les types de cellules et de tissus spécifiques a été identifié. Cependant, ses rôles biologiques dans le développement du cancer de l'estomac restent largement inexplorées. temps réel PCR quantitative (qRT-PCR) et Western blot ont été utilisés pour analyser l'expression des HDAC4 dans les échantillons cliniques. ARNsi et la surexpression de HDAC4 et l'ARNsi de p21 ont été utilisés pour étudier les effets fonctionnels de la prolifération, une formation de colonies, une adénosine 5'-triphosphate (ATP) dosage et les espèces réactives de l'oxygène (ROS), le cycle cellulaire, les taux d'apoptose des cellules et autophagy dosages. HDAC4 a été régulée à la hausse dans les tissus de cancer gastrique et plusieurs lignées cellulaires de cancer gastrique. La prolifération, la colonie la capacité de formation et de niveau ATP ont été renforcées dans les cellules SGC-7901 HDAC4 surexpression, mais inhibées dans HDAC4 knockdown cellules SGC-7901. HDAC4 knockdown a conduit à la cellule arrestation G0 /G1 de phase et a provoqué l'apoptose et l'augmentation de ROS. En outre, HDAC4 a été trouvé pour inhiber l'expression de p21 dans les cellules SGC-7901 cancer gastrique. p21 knockdown considérablement atténué l'inhibition de la prolifération cellulaire, l'arrêt du cycle cellulaire, la promotion de l'apoptose cellulaire et autophagie-régulation dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA. Nous avons démontré que HDAC4 gastrique favorise la progression des cellules cancéreuses à médiation par la répression de p21. Nos résultats fournissent une base expérimentale pour la compréhension du mécanisme pro-tumeur HDAC4 comme traitement pour le cancer gastrique

Citation:. Kang Z-H, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) histone déacétylase HDAC4 Favorise cancer gastrique SGC-7901 Cellules Progression via p21 Repression. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10.1371 /journal.pone.0098894

Editeur: Wei-Guo Zhu, l'Université de Pékin Health Science Center, la Chine

Reçu 12 Février 2014; Accepté: 8 mai 2014; Publié 4 Juin, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Kang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par une subvention du ministère de la Santé de la province du Jilin (n ° 2012z119). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès par cancer dans le monde [1]. pays d'Asie et d'Amérique du Sud ont un taux d'incidence plus élevé de GC que les États-Unis et en Europe occidentale [2]. La plupart des thérapies ciblées se concentrent sur le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) des indications relatives à GC avancé. Composés contre de nouvelles cibles, telles que mTOR [3], (récepteur du facteur de croissance des hépatocytes) c-Met [4], et HDAC sont également à l'étude.

histone déacétylase 4 (HDAC4), qui est une classe II HDAC, on sait qu'il existe dans les complexes de co-répresseur de la transcription distincts. HDAC4 est une composante essentielle de la voie de réponse aux dommages de l'ADN qui agit par 53BP1 [5]. HDAC4 réprime l'expression de l'inhibiteur de kinase p21 dépendante de la cycline (également connu sous le nom p21WAF1 /Cip1) dans des cellules cancéreuses humaines par un mécanisme indépendant de p53 Sp1 dépendante [6]. HDAC4 favorise la croissance des cellules du cancer du côlon par la répression de la p21 [7]. L'inactivation de HDAC4 par de petits ARN interférents ou les inhibiteurs de HDAC supprime la mort cellulaire neuronale [8].

Le rôle de HDAC4 dans des cellules spécifiques (HeLa (cancer du col utérin), U373 (gliomes), OVCAR (ovaire), T98G ( gliome), HCT116 (colorectal), NHA (astrocytes) et SKBR3 (sein)) et les tissus (cortex cérébral, testicule, de la prostate, et la couche épidermique de la peau) est de plus en plus clair [9]. Cependant, le mécanisme exact de HDAC4 dans le cancer gastrique n'a pas été déterminée. Par conséquent, le but de cette étude était d'abord d'évaluer les niveaux d'expression dans HDAC4 gastrique humain tissus cancéreux et des lignées cellulaires. En second lieu, l'effet de HDAC4 sur des lignées cellulaires de cancer gastrique a été examinée à l'aide surexpression et knock-down. Enfin, nous avons cherché à savoir si HDAC4 avait une relation avec p21 dans les cellules de cancer gastrique. Ensemble, notre objectif était de trouver si HDAC4 a un rôle biologique dans le développement de GC et d'élucider le mécanisme sous-jacent.

Des échantillons de tissus de Matériels et méthodes

Vingt-neuf appariés tissus de carcinome gastrique primaire et les tissus gastriques normaux éloignés ont été prélevés chez des patients (âge: 58.46 ± 9,17 années) pendant la chirurgie thérapeutique de routine dans le département de gastro-Surgery, le premier hôpital de l'Université de Jilin. Tous les échantillons ont été obtenus avec le consentement éclairé conformément à la Déclaration d'Helsinki et approuvés par le Comité des droits de l'éthique du premier hôpital de l'Université de Jilin et de l'Université de Jilin, Chine. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de tous les participants.

Les lignées cellulaires et la culture

Les lignées cellulaires de cancer gastrique humains SGC-7901, AGS et BGC-823 et la lignée cellulaire de l'épithélium gastrique normale GES étaient obtenu auprès de American type Culture Collection (Manassas, VA) et cultivées dans un milieu RPMI 1640 avec du sérum bovin fœtal à 10% dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _{2 à 37 ° C}

lignée cellulaire. stable transfectée et transfection transitoire

HDAC4 Le fragment de pleine longueur a été amplifiée par PCR à transcription inverse à partir de cellules GES en utilisant les amorces spécifiques telles que décrites précédemment [10], et inséré dans les sites BamH I et Hind III de pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, Royaume-Uni). PcDNA3.1 (+) - HDAC4 plasmide a été vérifiée par analyse de séquence pour confirmer l'absence de mutations. les cellules CGT-7901 ont été ensemencées dans des plaques 6 puits et transfectées avec le vecteur pcDNA3.1 (+) - HDAC4 et pcDNA3.1 (+) - vecteurs, respectivement, en utilisant de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) selon les instructions fournies par le fabricant pendant 24 h sans sélection antibiotique. Ensuite, les cellules ont été cultivées dans un milieu contenant 400 ug /ml de G418 (Sigma, St. Louis, MO) jusqu'à ce que toutes les cellules dans la culture de contrôle non transfectées ont été tués.

cellules CGT-7901 ont été ensemencées sur des plaques 6 puits puis transfectées avec non-ciblage siRNA ou siRNA dirigé contre HDAC4 humain ou p21 (Santa Cruz) en utilisant Lipofectamine 2000, selon les instructions fournies par le fabricant. expériences extensibles ont été réalisées sur des cellules 48 ou 72 h post-transfection.

l'isolement de l'ARN et quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR)

L'ARN total a été isolé à partir de tissus ou de cellules par réactif Trizol ( Invitrogen), et transcriptions inverses ont été effectuées en utilisant le kit Takara RNA PCR (Takara, Dalian, Chine) suivant les instructions du fabricant. La PCR quantitative a été effectuée en utilisant une Ex Taq vert SYBR Premix (Takara, Japon) dans un système PCR en temps réel (Eppendorf, Allemagne). Le ratio d'expression relative dans chaque tissu tumoral et non tumoral apparié a été calculée par la 2 ^{méthode -ΔΔCT.}

Le comptage des cellules kit-8 (CCK-8) test

Les proliférations des cellules CGT-7901 ont été évaluées en utilisant un dosage CCK-8 (Beyotime, Jiangsu, Chine) selon le protocole recommandé par le fabricant. En bref, les cellules ont été cultivées dans une plaque à 96 puits à une concentration de 2000 cellules par puits. 0, 1, 2 et 3 jours après la transfection, le dosage de la prolifération cellulaire a été réalisée par l'addition de 10 pl de solution de CCK8 à chaque puits, suivie d'une incubation à 37 ° C pendant 2 h. L'absorbance a été mesurée par un lecteur ELISA à une longueur d'onde de 450 nm.

Colony essai de formation

En bref, les cellules SGC-7901 HDAC4 surexprimant et -knockdown ont été ensemencées en triple (1000 cellules par 60 mm boîte de culture) et on fait incuber à 37 ° C pendant deux semaines pour former des clones. Les cellules ont été lavées avec du PBS, fixées avec du paraformaldehyde à 4% pendant 15 minutes et colorées avec du cristal violet (0,5% de cristal violet, 1% de paraformaldehyde et 20% de methanol dans du PBS) pendant 30 min. Les colonies sur chaque plaque ont été comptées et la survie des cellules a été exprimé en pourcentage du nombre de colonies survivantes sur les plaques témoins.

Analyse du cycle cellulaire

Les cellules ont été récoltées et remises en suspension doucement dans des suspensions de cellules individuelles dans cellulaire activé par fluorescence (FACS), un tampon (PBS contenant 2% de FBS). Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS froid et fixés dans de l'éthanol pendant une nuit à 70%. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS froid, remis en suspension dans une solution de RNase et incubées pendant 30 min à 4 ° C. La suspension a été ajouté à 0,05 mg /ml d'iodure de propidium (Beyotime) suivie d'une incubation à 4 ° C pendant 30 minutes et on analyse à l'aide FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

apoptose des cellules test

Propidiumiodide (pi, 1 pg /ml) et de l'annexine V-FITC (1 pg /ml) ont été utilisés pour la détermination de l'apoptose cellulaire. En bref, les cellules ont été trypsinisées et mises en incubation avec du PI et de l'Annexine V-FITC pendant 15 min à 37 ° C. Les échantillons ont été détectés en utilisant un flux FACS Calibur cytomètre. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

adénosine intracellulaires 5'-triphosphate (ATP) niveaux dosage

niveaux intracellulaires ATP ont été analysés en utilisant la bioluminescence [11]. En bref, les cellules ont été lysées et centrifugées à environ 15 000 g pendant 10 min à 4 ° C. Les surnageants ont ensuite été mélangés avec une solution de travail ATP dosage de mélange (Sigma), et la quantité de lumière émise a été immédiatement mesurée avec un luminomètre (Thermo Scientific Luminoskan Ascent, Walthan, MA). Les données de luminescence ont été normalisées par rapport aux quantités de protéine de l'échantillon (mesurée en utilisant un dosage BCA).

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) mesure

Production intracellulaire des ROS a été examinée en utilisant du 6-carboxy-2 ' , 7'-dichloro diacétate (H _{2DCFDA). En bref, 5 x 10 ^{4 cellules ont été étalées dans des boîtes de 60 mm et a permis de fixer pendant une nuit. Les cellules ont été colorées avec 5 uM H 2DCFDA pendant 30 min à 37 ° C, puis collectés, et la fluorescence a été analysée par un spectromètre à fluorescence (Flex StationII 384, Molecular Devices) à 485 nm (excitation) et 538 nm ( émission). niveaux oxydantes cellulaires ont été exprimés par rapport DCF fluorescence par quantités de protéines d'échantillons (méthode BCA). Dans certaines expériences, les cellules ont été prétraitées avec 10 mM N -acetylcysteine ​​(NAC) avant l'analyse de la production de ROS.}}

Analyse par Western blot

Les cellules ont été lysées dans IP
tampon de lyse (Beyotime), dénaturé pendant 10 min à 95 ° C, cisaillé avec une seringue à insuline, et résolu sur des gels SDS /PAGE. Après immunoblot, les membranes ont été bloquées et incubées avec des anticorps primaires dans du PBS /0,1% de Tween-20 avec du lait sec non gras à 5%. Des anticorps dirigés contre HDAC4, p21, LC3, Beclin 1, Atg 7, la caspase 3, 9, Bcl-2, Bax et anti-β-actine ont tous été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). La détection chimioluminescente a été testée en utilisant un kit de détection ECL (Pierce, Rockford, IL, USA). Les résultats ont été analysés en utilisant le logiciel Quantity One pour obtenir le rapport de la densité optique de la protéine cible pour la ß-actine.

Immunofluorescence

Les cellules ont été étalées sur des lamelles couvre-objet, fixées avec du paraformaldehyde à 4% (Sigma Aldrich) pendant 10 minutes et perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 /PBS. Les cellules ont été bloquées avec 1% de BSA pendant 1 h, suivie d'une incubation pendant une nuit à 4 ° C avec l'anticorps anti-LC3, puis les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à FITC (Beyotime) pendant 1 h. Les noyaux ont été colorés avec du 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, Sigma). L'imagerie par fluorescence a été visualisé en utilisant un microscope confocal à balayage laser (Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne).

L'analyse statistique

Toutes les données sont représentatives d'au moins trois expériences indépendantes. Les données sont présentées comme des moyennes ± S.E.M. La signification statistique a été calculée par analyse simple de la variance (ANOVA) ou par le test t de Student entre les deux groupes en utilisant GraphPad Prism 5 logiciels statistiques. P
valeurs <. 0,05 ont été considérées comme significatives

Résultats

expression HDAC4 étaient régulés à la hausse dans les tissus de cancer gastrique et des lignées cellulaires

D'abord, nous expression de HDAC4 analysés dans vingt-neuf apparié cancer gastrique et les tissus non tumoraux adjacents par analyse qRT-PCR et western blot. Nous avons constaté que HDAC4 était significativement régulée à la hausse dans le tissu gastrique de carcinome (Figures 1A, B et C, ** P
< 0,01, *** P
< 0,001). De plus, plusieurs lignées cellulaires de cancer gastrique ont également été analysés. Nous avons observé une expression plus élevée de HDAC4 dans trois lignées cellulaires de cancer gastrique (AGS, BGC-823 et SGC-7901), par rapport à une ligne normale gastrique de cellules de l'épithélium (GES) (figures 1D et E, * P
<0,05, ** P
< 0,01). Par conséquent, nos résultats ont démontré que l'expression de HDAC4 étaient régulés à la hausse dans les deux tissus de cancer gastrique et des lignées cellulaires.

L'expression de HDAC4 a été DOWNLIGHTS avec succès ou régulés à la hausse dans le SGC-7901 cellules

A pcDNA3.1 (+) vecteur d'expression a été utilisé pour surexprimer HDAC4 dans les cellules SGC-7901 afin d'examiner son efficacité en tant que régulateur de croissance. Après transfection stable, l'expression de taux d'ARNm HDAC4 est plus abondant dans pcDNA3.1 (+) - Les cellules HDAC4 que dans les cellules non transfectées (NF) ou des cellules CGT-7901 témoin négatif (figure 2A, ** * P
. < 0,001), ce qui était conforme à la suite de l'ouest de l'analyse de blot (figure 2B)

Pour évaluer l'efficacité du gène silençage de HDAC4-siRNA humaine, l'étendue de HDAC4 expression de la protéine était mesurée après HDAC4-transfection de siRNA et une période d'incubation de 48 heures dans la lignée cellulaire de cancer gastrique humain SGC-7901. En temps réel une analyse PCR a montré que l'infection HDAC4 siRNA a donné lieu à 36,3% knockdown de niveaux HDAC4 ARNm (figure 2C, *** P
< 0,001). L'analyse Western blot a montré que la protéine était significativement réduit HDAC4 (figure 2D), conformément à sa réduction de l'ARNm. Pris ensemble, ces données suggèrent que HDAC4 siRNA pourrait supprimer de manière significative l'expression de HDAC4 endogène.

HDAC4 promu la prolifération cellulaire et la formation de colonies

Ensuite, nous avons examiné l'effet de HDAC4 sur la croissance cellulaire. La prolifération cellulaire a été examinée en utilisant le kit de comptage de cellules 8 (CCK-8) aux points temporels de 24, 48 et 72 h. Les courbes de croissance ont montré que lorsque HDAC4 a surexpression dans des cellules CGS-7901, la croissance des cellules a été augmentée de 1,5 fois par rapport au groupe témoin au jour 3 (figure 3A, * P
< 0,05, ∧∧P
< 0,01). En outre, l'essai de formation de colonies affiche une augmentation spectaculaire de deux fois du nombre de colonies lorsque les cellules CGT-7901 ont été transfectées avec pcDNA3.1 (+) - HDAC4 par rapport au groupe CN (figures 3B et C, ** P
< 0,01)

Nous avons également examiné les effets de HDAC4 down-régulation dans les cellules SGC-7901.. Le dosage et la formation de colonies test CCK-8 a montré que la HDAC4 down-regulation supprimé la capacité de prolifération (Figure 3D, ∧P
< 0,05) et les numéros de formation de colonies de SGC-7901 cellules (Figures 3E et F, ** P
< 0,01). En résumé, ces données suggèrent que HDAC4 pourrait être un promoteur de croissance dans les cellules SGC-7901.

HDAC4 a augmenté les niveaux d'ATP et une diminution de la génération de ROS

Une augmentation des niveaux d'ATP dans les cellules surexprimant HDAC4 était observée par rapport aux cellules NC SGC-7901 (Figure 3G, * P
< 0,05). En outre, le niveau de l'ATP a été diminuée dans les cellules HDAC4 knockdown (Figure 3H, * P
< 0,05).

Parce que la génération de ROS intracellulaire peut être liée à un dysfonctionnement mitochondrial, nous avons encore examiné si HDAC4 pourrait stimuler la production de ROS dans les cellules de la CGT-7901. Les résultats démontrent qu'une réduction significative de la production de ROS a été observée dans pcDNA3.1 (+) - cellules HDAC4 SGC-7901 par rapport aux cellules SGC-7901 NC (Figure 3G, ∧P
< 0,05). Pendant ce temps, le silençage de HDAC4 robuste activé la génération de ROS dans les cellules SGC-7901 (Figure 3H, ** P
< 0,01). Blocage production de ROS en utilisant le NAC antioxydant significativement inhibée génération de ROS (Figure 3H, ∧P
< 0,05). Ce blocage de la production de ROS par un prétraitement des cellules avec NAC aussi nettement empêché la perte d'ATP dans les cellules-siARN HDAC4 SGC-7901 (Figure 3H, ∧P
< 0,05).

Le bas expression HDAC4 régulés cellules en phase G0 /G1 arrêté

la régulation négative de HDAC4 présentait une nette augmentation de la proportion de cellules dans la phase G0 /G1 (78,74% contre 49,92% dans le NC-siRNA groupe). Il y avait aussi une diminution correspondante du nombre de cellules dans la phase S (12,94% par rapport à 34,61% dans le groupe CN ARNsi) (figure 4A). Les résultats de la distribution du cycle cellulaire de Quantifier ont été montrées que HDAC4 knockdown significativement induites cellules SGC-7901 G0 /G1 arrestation et S phage inhibition (figure 4B, * P
< 0,05, ** P
< 0,01). Par conséquent, ces résultats suggèrent que le niveau de HDAC4 pourrait réguler la progression du cycle cellulaire.

La HDAC4 expression induite apoptose et l'autophagie
down-régulé

Pour étudier si l'inhibition de la croissance cellulaire induite par HDAC4-régulé à la baisse est liée à l'apoptose des cellules, l'effet de HDAC4 down régulés sur l'apoptose des cellules a été évaluée par cytométrie en flux en utilisant une double coloration de l'annexine V-FITC /PI. Il a été observé que l'apoptose a nettement augmenté dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA par rapport au groupe NC-siRNA (figure 4C). On a confirmé en outre l'induction de l'apoptose par l'activation de la caspase-3 et 9 par Western Blot. L'analyse a révélé que régulé à la baisse HDAC4 augmente le clivage de caspases-3 et 9 par rapport au groupe CN ARNsi. L'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 et la protéine pro-apoptotique Bax ont également été quantifié. Le ratio Bax /Bcl-2 a été significativement augmentée dans siARN HDAC4 cellules SGC-7901 par rapport au groupe NC-siRNA (Figure 5D).

Afin de déterminer si HDAC4 autophagie induite régulée à la baisse dans le SGC-7901 cellules, nous avons examiné d'abord la localisation intracellulaire de LC3 dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA par analyse d'immunofluorescence en utilisant des anticorps fluorescents à LC3. La distribution de punctuate spécifique de LC3 endogène ont été observés sous forme de points punctiformes de fluorescence verte dans les cellules CGT-7901 HDAC4-siRNA par rapport à celui du groupe NC-siRNA (figure 4E), ce qui indique que autophagy a été induite comme moyen de survie. La distribution subcellulaire de LC3 ont été significativement inhibée par le particulier-autophagie inhibiteur 3-MA dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA (Figure 4E). Ensuite, les autophagie protéines apparentées Atg7, Beclin 1 et le rapport de LC3-II à LC3-I ont été analysés par western blot. Nous avons observé que les niveaux de Atg7, Beclin 1 et LC3-II expression ont tous augmenté de façon significative dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA par rapport au groupe NC-siRNA (Figure 4F). Le Atg7, Beclin 1 et le rapport de LC3-II à LC3-I a nettement diminué dans HDAC4-siRNA cellules SGC-7901 qui ont été traités avec du 3-MA par rapport au groupe NC-siRNA (Figure 4F).

la HDAC4 expression régulée à la baisse a inhibé la croissance cellulaire par p21-régulation

Parce que le traitement des cellules cancéreuses humaines avec des inhibiteurs de HDAC conduit systématiquement à un inhibiteur de kinase de régulation à la hausse de l'expression de p21 dépendante de la cycline qui est cible bien établie d'inhibiteurs de HDAC [6], [7], [12], nous avons cherché à déterminer si la surexpression ou knockdown de HDAC4 pourraient affecter la réglementation de p21 et de spéculer sur le mécanisme de la promotion de la croissance HDAC4 médiation dans les cellules de cancer gastrique.

Comme le montre la figure 5A, la régulation à la hausse de façon spectaculaire HDAC4 a conduit à l'expression de la protéine p21 diminue. En revanche, la régulation négative HDAC4 a conduit à l'expression accrue de p21 (figure 5A). Nous avons ensuite examiné si p21 knockdown pourrait affecter la croissance cellulaire et l'apoptose dans les cellules SGC-7901 dans lequel HDAC4 a été supprimé. Les cellules SGC-7901 ont été co-transfectées avec le siRNA HDAC4 et siRNA p21. Le niveau d'ARNm de p21 a été significativement diminuée dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA après p21 knockdown (figure 5B, ** P
< 0,01, *** P
< 0,001). p21 knockdown considérablement atténué l'inhibition de la prolifération cellulaire dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA (Figure 5C, * P
< 0,05, ∧∧ P
< 0,01). Le niveau de l'ATP a été augmenté, mais la production de ROS intracellulaire a diminué dans le groupe siRNA-p21-HDAC4 par rapport au groupe siRNA HDAC4 (Figure 5D, * P
< 0,05, ** P
<0,01). p21 régulation à la baisse de manière significative atténué G0 /G1 arrestation et S phage inhibition in HDAC4-siRNA SGC-7901 cellules (Figures 5E et F, * P
< 0,05). Immunoblot a montré que la quantité de Bcl-2 était significativement plus élevée, mais Bax était plus faible dans les cellules de l'ARNsi-p21 HDAC4 (figure 5G). L'apoptose des cellules a diminué de façon marquée dans les cellules SGC-7901 siRNA-p21-HDAC4 par rapport au groupe siRNA HDAC4 (figure 5H). Il a également observé que p21 knockdown pourrait sauver l'autophagie accrue ponctuée taches fluorescentes (Figure 5I) et Atg 7, Beclin 1 et LC3II protéines expression dans SGC-7901 cellules induites par siRNA HDAC4 (Figure 5J). Collectivement, ces données indiquent que la régulation de p21 pourrait imiter l'effet de HDAC4 surexpression et pourrait être un médiateur important dans la promotion de la croissance des cellules SGC-7901 HDAC4-médiée.

Discussion

De nombreux HDAC les inhibiteurs qui se sont avérés inhiber la prolifération et induire une différenciation ou une apoptose dans les cellules tumorales, sont étudiés dans des essais cliniques en tant qu'agents anti-cancéreux ou conjointement avec d'autres traitements [13]. Une expression élevée de HDAC 1/2 a été retrouvé dans les tissus de carcinome gastrique [14]. Dans notre étude, nous avons montré que l'expression de HDAC4 étaient régulés à la hausse dans l'estomac des tissus cancéreux et des lignées cellulaires in vitro
. HDAC4 régulation à la baisse dans les cellules CGT-7901 a supprimé la prolifération cellulaire et les numéros de formation de colonies, le cycle cellulaire arrêté et l'apoptose cellulaire induite dépendant de l'activation des caspases 3 et 9, ce qui est cohérent avec les effets anti-prolifératives et pro-apoptotiques des inhibiteurs de HDAC dans des lignées cellulaires cancéreuses humaines [15] et à l'observation précédemment rapporté que HDAC4 la régulation réduit la survie clonogénique et induit l'apoptose dans les cellules HeLa [5]. L'effet proproliferative de HDAC4 dans les cellules de cancer gastrique est compatible avec celui rapporté précédemment pour les HDAC de classe I, HDAC1, -2, -3 et [16]. Ainsi, le ciblage de l'inhibition de l'activité HDAC4 peut être une approche thérapeutique potentielle pour le traitement du cancer gastrique.

L'autophagie est essentiellement un système de propres lysosomes de la cellule de la dégradation des protéines. Une variété de signaux de stress, tels que la privation de nutriments ou d'un traitement avec différents agents anticancéreux, de stimuler le processus de autophagie [17]. Autophagy est généralement caractérisé par la présence d'autophagosomes et une augmentation du clivage de LC3 [18]. Le rôle de l'autophagie dans le processus de mort cellulaire est controversé, mais il a été confirmé que la diaphonie entre l'apoptose et autophagy est essentielle dans la mort cellulaire programmée [19]. Dans notre étude, l'induction de l'autophagie dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA a été mis en évidence par le motif punctuate de LC3 immunocoloration et l'accumulation de protéines de cachet biochimiques de l'autophagie (Atg7, Beclin 1 et LC3) par analyse western blot. L'autophagie inhibition par l'inhibiteur 3-MA atténué l'induction autophagie dans les cellules SGC-7901 HDAC4-siRNA. Ainsi, nous avons spéculé autophagy a eu lieu peut protéger SGC-7901 cellules cancéreuses apoptose induite par HDAC4 effet de choc.

protéine p21, également connu sous kinases cycline-dépendantes (CKD), inhibiteur 1, régule la progression de la phase G1 du cycle cellulaire . p21 est souvent mal régulés dans les cancers humains, et il peut agir comme un suppresseur de tumeur ou comme un oncogène [20]. Ceux qui ont des cancers p21 positifs et p53-négatives ont des courbes de survie significativement plus élevés dans le carcinome gastrique [21], alors que la perte d'expression de p21 avec détection accrue de p53 est associée à un mauvais pronostic et une diminution de la survie globale dans le cancer gastrique [22]. Cohérent avec le résultat que la protéine p21 a été régulée à la baisse dans les tissus de cancer gastrique [23], nous avons observé que HDAC4 favorise gastrique prolifération des cellules cancéreuses et la croissance, à médiation par la répression de p21 dans les cellules de cancer de l'estomac, et est accompagnée d'une augmentation de la les niveaux d'ATP et de la répression de la génération de ROS. Par conséquent, nous avons exploré si p21 était un médiateur important pour la promotion de la croissance des cellules SGC-7901 HDAC4-médiée. Dans cette étude, HDAC4 effet de choc induit significativement l'expression accrue de la protéine p21, tandis que la surexpression HDAC4 a diminué de manière significative l'expression de la protéine p21 dans les cellules CGT-7901. Ces données implicites que p21 pourrait être une cible en aval de HDAC4. Les analyses fonctionnelles ont montré une régulation de p21 pourrait imiter l'effet de HDAC4 surexpression sur SGC-7901 la promotion de la croissance cellulaire. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que HDAC4 la régulation pourrait favoriser SGC-7901 l'apoptose des cellules par up-régulation de l'expression de p21. p21 peut être un gène suppresseur de tumeur dans le développement et la progression du cancer gastrique, dont l'expression peut aider à contrôler une variété de comportements malignes du cancer gastrique. Cependant, la pertinence potentielle de la réglementation HDAC4 d'expression de p21 doit également être considérée dans le contexte qu'il existe de multiples facteurs et les principales voies qui modulent potentiellement l'expression de p21 dans le cancer gastrique.

Pris ensemble, nos résultats ont a révélé un rôle important dans le contrôle de HDAC4 lignée cellulaire de cancer gastrique humain SGC-7901 le développement à travers la régulation de p21, ce qui suggère que la modification de l'expression et /ou activité HDAC4 peut être un événement important au cours de cancer de l'estomac. En conclusion, ces résultats permettent d'identifier HDAC4 comme un régulateur important de la prolifération du cancer gastrique par la répression de p21 in vitro
.

• PLoS ONE: circulantes cellules tumorales (CTC) détectés par RT-PCR et son rôle pronostique dans le cancer gastrique: une méta-analyse de publication Literature
• PLOS ONE: MUC5AC amont complexes Région Répétitive Longueur polymorphismes sont associés à Susceptibilité et Stade clinique de Cancer